塞尼卡谷病毒3D蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域和病毒免疫学领域，尤其是涉及sva（senecavirusa）的蛋白3d的新功能，即sva3d蛋白可以诱导il-1β的分泌，最终导致sva病毒复制降低，起到促进免疫反应的作用。

背景技术：

炎症是身体自然愈合过程的一部分，但是当它变成慢性时，它会导致癌症、阿尔茨海默病和其他疾病。在对细胞应激、组织损伤或传染性病原体产生的不同信号作出反应时，炎性体（inflammasome）触发炎症产生。白介素1（il-1β）是一种炎性细胞因子或激素，是分泌蛋白，通常由巨噬细胞产生，在宿主抗病毒免疫应答过程中发挥关键作用。炎症的有益影响和不利影响都是由il-1β引发的。在正常情形下，il-1β以非常低的数量产生，但是当对组织损伤、环境应激、感染或慢性炎症作出反应时，il-1β的产生高度地增加。il-1β的分泌可以促进大量的急性蛋白表达，同时也参与机体局部的免疫调节作用，如促进b细胞的生长和分化以及抗体的形成；促进单核细胞的抗原递呈能力等，以il-1β通路为靶标的治疗已成功地应用于许多病毒感染的临床治疗，如在治疗干眼病的过程中，通过局部敷用靶向il-1的拮抗剂药物可显著的降低干眼病的相关症状以及眼表疾病；临床还可以通过抑制il-1途径治疗痛风。il-1β在病毒诱导应答过程中，机体受到病毒刺激应答，通过模式识别受体信号通路激活nf-κb信号通路，导致il-1β前体的产生，此为信号1；同时病毒诱导炎症小体活化，如nlrp3炎症小体活化，活化过程包括nlrp3与asc形成复合体，然后结合caspase1的前体，并使其形成成熟的caspase1，成熟的caspase1对il-1β前体进行切割，最终形成成熟的il-1β并分泌至胞外，产生炎症反应。

为了对抗宿主适度的免疫防御，病毒获得了无数的策略，其中之一就是针对il-1β产生的信号通路，包括抑制炎症小体活化以及激活炎性小体使得其过度活化。例如，脊髓灰质炎病毒（ev71）的基因组能够活化nlrp3诱导的il-1β的分泌。寨卡病毒（zika）的ns5作为非结构蛋白能够通过结合nlrp3的lrrs和nacht结构域激活nlrp3炎症小体。emcv的2b蛋白也参与激活nlrp3炎症小体介导的il-1β的分泌。许多病毒蛋白也同样抑制nlrp3炎症小体的活化，如流感病毒的ns1蛋白利用其n端结构抑制il-1β以及il-18的表达。麻疹病毒v蛋白结合nlrp3的c端，进而阻止nlrp3介导的il-1β的分泌。ev71的2a和3c蛋白通过降解nlrp3抑制il-1β的表达。

塞内卡病毒病是由a型塞内卡病毒引起的动物传染病，主要感染猪，对不同年龄阶段的猪都易感。在2015年初，巴西、泰国和中国首次暴发了由塞内卡病毒引起的水疱性疾病。同年，研究发现病毒感染与新生仔猪死亡率相关。sva属于rna病毒科（picornaviridae），sva具有小rna病毒基因组的典型特征，其基因组rna由大约7200个核苷酸（nt）组成。该病毒基因组仅有一个开放阅读框（openreadingframes，orf），编码约2180个氨基酸的多聚蛋白。由先导蛋白（l）、p1（裂解vp1、vp2、vp3和vp4四种结构蛋白）、p2（裂解为2a、2b和2c三种非结构蛋白）、p3（裂解成3a、3b、3c和3d四种非结构蛋白）组成。3d蛋白是sva的一个重要病毒蛋白，为病毒聚合酶。同时3d蛋白也参与结合宿主因子，但研究较少，如同科sva的3d蛋白能够与宿主因子相互作用如sam68、ddx1等，其具体的机制不清楚，sva3d蛋白的参与免疫和炎症反应的研究目前是空白。

技术实现要素：

本发明揭示sva的3d蛋白的新功能，即3d蛋白首先活化nf-κb的磷酸化，进而通过改变细胞内的钙离子和钾离子浓度以及结合nlrp3的nacht结构域激活nlrp3炎症小体，最终导致il-1β的成熟与分泌降解。

本发明构建的3d蛋白的慢病毒表达系统，接种小鼠后，发现il-1β的分泌和产生显著增加，7天后，小鼠死亡，不同的小鼠组织显示充血、肿大。结果表明，过度的3d蛋白能够诱导炎症的发生并且导致器官损伤。同时，将相同剂量的该慢病毒系统接种宿主动物（猪，90日龄），动物组织没有出现明显病变，然而il-1β的表达量显著上升。表明低剂量的3d也能诱导炎症反应。本发明为控制病毒诱导炎症反应，设计3d的抑制药物提供新的视角，同时在疫苗设计中，为促进机体免疫应答，sva3d蛋白作为诱导剂或者佐剂使用，帮助更好产生抗体做理论铺垫。

其中，3d蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

本发明构建3d基因慢病毒表达系统，构建策略如下：

（1）以sva病毒为模板，用引物1f和2r扩增含有3d基因的片段，与pmd20t载体连接，获得阳性克隆pmd-3d，送华大基因测序，显示正确；

其中扩增含有3d基因的引物：

1f：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctg-3'（seqidno:2）；

1r：5'-gtctgtggatccctcgttggagcc-3'（seqidno:3）；

（2）将pmd-3d进行双酶切，连接到慢病毒载体（phblv-zsgreen-puro）；

（3）将慢病毒载体进行病毒包装，收获r-lenti-3d。

空载体的慢病毒（empty-lenti）包装同3d基因过表达慢病毒包装策略相同。

sva的3d蛋白通过其n端（1～154aa）与nlrp3的natch结构域结合，并通过改变细胞内的钾离子和钙离子的浓度激活nlrp3炎症小体介导的il-1β的产生和分泌，具体鉴定过程如下：

（1）sva的3d基因和其他相关基因如3d-12(△309-463aa)、3d-13(△154-309aa)、3d-23(△1-154aa)、natch、nlrp3、pyd、lrr、pro-caspase-1、pro-il-1β、asc等重组质粒的构建；

其中，3d基因的核苷酸序列如seqidno:4所示，3d-12(△309-463aa)、3d-13(△154-309aa)、3d-23(△1-154aa)、nlrp3、pro-caspase-1、pro-il-1β、asc基因的核苷酸序列分别如seqidno:5～11所示。

（2）3d以及3d缺失突变体flag-3d-12(△309～463aa)、flag-3d-13(△154～309aa)、flag-3d-23(△1～154aa)基因重组载体分别与空载体、nlrp3、pyd、lrr、或pro-caspase-1、pro-il-1β、asc等共转染，并且部分结果中使用不同的信号通路激活或抑制剂或标记物进行处理，这些激活剂或抑制剂或标记物的作用路径不同。

（3）根据激活剂或抑制剂或标记物的作用途径来判断3d蛋白激活nlrp3的作用方式：3d通过改变细胞内的钙离子和钾离子的浓度变化激活nlrp3炎症小体。这是sva3d的新功能。

本发明发现在小鼠体内，3d蛋白过表达后，小鼠7天死亡，动物组织充血、肿大，同时发现3d蛋白过表达后小鼠血清和组织中il-β表达量显著上升。在猪体内，3d蛋白相同剂量过表达后，动物组织无明显病变，动物也无发病，但血清和动物组织的il-β表达量显著上升。这说明在高剂量表达3d基因后，3d蛋白激活il-β的产生和分泌，可能导致炎症风暴的产生。低剂量的3d过表后，能够诱导血清和组织中的il-β的产生和分泌，但是不能导致动物组织病变以及发病。

本发明具有以下有益效果：

本发明发现sva的3d蛋白能够诱导nf-κb活化，并通过结合nlrp3激活il-1β的分泌。此发明为进一步阐明sva的基因功能以及3d的新功能提供理论基础，同时，本发现能够为病毒诱导炎症反应，设计3d的抑制药物提供新的视角，同时在疫苗设计中，为促进机体免疫应答，sva3d蛋白作为诱导剂或者佐剂使用，帮助更好产生抗体做理论铺垫。

本发明进一步揭示了sva3d蛋白的新功能，且阐明了sva导致机体产生炎症反应的发病原因可能是由于3d激活了nlrp3炎症小体介导的il-1β信号通路。

更详细的技术方案和发明效果参见《具体实施方案》所述。

附图说明

图1sva诱导il-1β的分泌。

图2sva活化nlrp3炎性小体进而诱导il-1β的产生。

图3sva通过nf-κb第一信号活化nlrp3炎症小体。

图4sva的rna和sva蛋白均有参与nlrp3炎症小体的活化。

图5sva3d蛋白促进nlrp3炎症小体的活化。

图6sva3d蛋白通过结合nlrp3的nacht结构域进而激活nlrp3炎症小体。

图7r-lenti-3d,empty-lenti,dmem接种小鼠后的死亡率，血清il-1β的elisa检测以及动物组织il-1β的mrna表达水平变化和动物组织表型和病理变化。

图8r-lenti-3d,empty-lenti,dmem接种猪后的血清il-1β的elisa检测以及动物组织il-1β的mrna表达水平变化。

具体实施方式

实施例中所用sva病毒，仙台病毒均为常规野生毒株，保存于中国农业科学院兰州兽医研究所。公众通过其他途径获取的sva病毒野生毒株、仙台病毒野生毒株也可以实现本发明。

实施例中小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所，猪购自康乐县磊鑫生猪养殖有限责任公司，均进行过安全检疫。

其他所用细胞和试剂均为市售产品。

实施例1质粒构建

（1）sva总rna提取

取500μl病毒加入1mltrizol，吹打混匀，室温静置5分钟。

加入250μl氯仿，剧烈震荡15s，冰浴放置10min，4℃12000rpm离心15分钟；吸取上清，加入等体积异丙醇于新的离心管中，上下轻柔颠倒10次。室温静置10分钟。

4℃，12000rpm离心10分钟；弃上清，加入1ml75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。

4℃，12000rpm离心5分钟；弃上清，超净台内室温晾干（20分钟）。加入40μldepc水，65℃促溶解rna10～15min。-80℃保存备用。

（2）获取病毒cdna

采用promega公司的反转录试剂盒，按照其说明操作反转录合成cdna。具体步骤如下：

配制反应体系(总20μl体系)：

5×buffer4μl

10mmdntps1μl

randomprimers1μl

oligo-dtprimers0.5μl

m-mlvtranscriptase1μl

rri0.5μl

h2o6μl

rna4μl

反应程序：65℃10分钟；冰浴5min，37℃90分钟；75℃10分钟。

（3）sva3d基因cds编码核苷酸序列片段的扩增

参照genbank提供的sva3d基因序列，设计引物扩增3d基因。上游引物：5’-tatctcgagttatggagctgcgac-3’（含xhoi和ecori酶切位点），下游引物：5’-acaaagcttgtccagggagaggtc-3’（含hindiii和bamhi酶切位点），扩增获得3d基因片段。

扩增体系如下(总50μl体系)：

10×pcrbuffer5μl

2.5mmdntps5μl

上游引物1μl

下游引物1μl

primerstar1μl

h2o35μl

cdna模板2μl

反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸2分30秒，35个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

然后进行核酸电泳，利用promega公司的dna纯化回收试剂盒纯化回收sva3d基因扩增片段。

使用xhoi酶和hindiii酶，对纯化dna和pcdna3.1载体在37℃下酶切30min。

双酶切体系如下：

10×mbuffer2μl

xhoi0.5μl

hindiii0.5μl

dna(或载体)0.5μg

h2o补至总体积20μl

反应程序：37℃30min。

然后进行核酸电泳，利用的dna纯化回收试剂盒（promega公司）回收酶切产物。将回收产物进行连接，反应体系及程序如下：

t4dnaligase1μl

10×ligasebuffer1μl

酶切纯化质粒片段0.5μl

酶切纯化3d基因片段5μl

ddh2o补充至10μl，16℃过夜连接。

连接产物通过dh-5α转化，挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的lb液体培养基培养，利用promega质粒提取试剂盒提取重组质粒，送样华大基因有限公司测序鉴定。

其余所需蛋白基因nlrp3，asc，pro-caspase-1，pro-il-1β均按照相似方法扩增测序构建。

nlrp3：

上游引物：5'-atgagcatggcaagcgtcc-3'，

下游引物：5'-ctactgggaaggctcaaagacaa-3'；

pro-caspase-1：

上游引物：5'-5'atggccgacaaggt3'-3'，

下游引物：5'-ttaatgtcctgggaagaggt-3'；

asc：

上游引物：5'-atgccagctctgcccctgga-3'

下游引物：5'-tcaggatgggatcatgcctttgctc-3'；

pro-il-1β:

上游引物：5'atggcagaagtacctgagctcg3'

下游引物：5'ttaggaagacacaaattgcatggtga3'。

sva诱导il-1β的分泌：

sva接种前，将bmdm细胞、pk15细胞或thp-1细胞的营养液弃之，用冰冷pbs清洗，然后感染sva，感染1h后，pbs清洗三遍，加入1%的营养液培养，在不同时间点收取待检细胞样品。收取细胞样品时，使用冰冷pbs清洗细胞，然后用细胞裂解液裂解细胞，并将裂解样品超声1分钟（每次间隔10s），4℃，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，保留上清。使用bca方法（碧云天bca试剂）检测蛋白浓度。蛋白样品加入5×loadingbuffer，沸水煮沸10分钟，高速瞬离，取适量上清进行蛋白质电泳和westernlot，如图1b-h所示，与对照mock相比，sva感染后，均能诱导il-1β的蛋白表达上调。

实施例2sva活化nlrp3炎性小体进而诱导il-1β的产生

thp-1巨噬细胞或pk-15细胞经2μm尼日利亚菌素（nigercin，nlrp3刺激剂）或vx-765（casp-1抑制剂）作用1h，或用sva感染，或用vx-765与nigercin处理1h，或vx-765处理1h后感染sva。用elisa和westernblot检测il-1β和il-1β前体的表达水平，检测结果如图2中a-b和d-e所示。结果表明：当sva感染后，使用caspase-1抑制剂能够抑制sva诱导的il-1β的分泌和蛋白表达，这说明sva诱导il-1β的产生是通过caspase-1通路。

hek293细胞过表达靶向nlrp3的shrnas表达质粒，并用二甲基亚砜或尼日利亚霉素处理或感染sva。elisa和westernblot检测il-1β水平或il-1β前体的表达，检测结果如图2中c和f所示。结果表明：当sva感染使用靶向nlrp3的shrna干扰的细胞后，il-1β的分泌和蛋白表达降低，这说明sva诱导nlrp3介导的il-1β产生。

图2中g为感染sva的hek293细胞共聚焦显微镜检测结果图。共聚焦显微镜检测nlrp3、acs（绿色）和sva（红色）亚细胞定位。具体的，将感染sva的hek293细胞进行4%多聚甲醛固定，然后使用bsa进行封闭，1h后，将细胞进行穿透，30分钟后，加入相应的一抗进行孵育，然后利用带不同标记的二抗与一抗进行结合，dapi染色细胞核后，荧光显微镜进行观察。结果表明：sva能够与nlrp3以及asc蛋白共定位于细胞质。这为sva通过nlrp3诱导il-1β的产生提供环境。

图2中h为thp-1巨噬细胞或pk-15细胞感染sva或用尼日利亚霉素处理的结果。用westernblot检测asc原抗体寡聚斑点。结果表明：细胞用尼日利亚菌素处理或sva感染后，都能使得asc发生寡聚化，asc的寡聚化是nlrp3活化的重要指标，这说明sva能够诱导nlrp3介导的asc复合体的形成，最终诱导il-1β的产生。

本实施例总体表明：sva能够诱导il-1β的分泌和蛋白表达，同时sva通过诱导nlrp3-asc复合体的形成导致il-1β信号通路的活化。

实施例3sva通过nf-κb第一信号活化nlrp3炎症小体，同时通过诱导钾离子和钙离子的浓度变化激活nlrp3炎症小体

将nf-κb荧光素酶报告基因质粒或与3d表达质粒联合转染hek293细胞，24h后，用仙台病毒（sev,sendaivirus）或sva感染细胞。细胞裂解后采用双荧光素酶报告基因系统检测nf-κb启动子的激活倍数、qpcr法检测nf-κb的mrna表达水平以及westernblot检测nf-κb的磷酸化水平。

结果如图3a和3b所示，sva能够诱导nf-κb的活化（图3a），3d蛋白能够单独活化nf-κb的活性，同时增强sva等病毒诱导的nf-κb的活性（图3b）。

图3c为sva按照不同时间点感染hek293细胞或者使用sva3d蛋白转染hek293细胞，使用mitosox进行处理，结果表明，sva不能诱导活性氧的变化，反而3d抑制活性氧的产生。这说明sva不是通过活性氧升高的模式诱导il-1β的产生。

图3d为sva感染hek293细胞后，使用mito-tempo进行处理，mito-tempo是一种抗氧化剂，作为nlrp3的抑制剂抑制ros，结果显示sva感染没有改变il-1β的分泌。这说明sva不是通过活性氧的模式诱导il-1β的产生。

图3e为sva感染hek293细胞后，使用ca-074-me处理，ca-074-me是cathepsinb的抑制剂，结果显示sva感染没有改变il-1β的分泌。这说明sva不是通过cathepsinb的模式诱导il-1β的产生。

图3f和图3g为sva感染或3d质粒转染hek293细胞，使用fluo-calcium进行染色（f），或者使用bapta-am的细胞渗透钙离子螯合剂处理细胞（g），发现sva感染和3d表达能够促进钙离子的浓度升高（f），当钙离子被螯合后，il-1β的产生降低。这说明sva和3d蛋白诱导钙离子的浓度升高，进而诱导nlrp3炎症小体的活化，最终诱导il-1β的分泌升高。

图3h和图3i为sva感染或者3d质粒转染hek293细胞，分别使用不同浓度的kcl和cacl2进行处理，结果显示，随着钾离子升高，il-1β的产生降低，随着钾离子升高，il-1β的产生上调。

综合实例3的结果说明，sva或者3d能够诱导nf-κb的活化，进而引发nlrp3的第一信号的产生，同时，sva或者3d蛋白通过诱导钾离子的外流和钙离子的内流模式诱导nlrp3炎症小体的活化。

实施例4sva的rna翻译产物活化nlrp3炎性小体进而诱导il-1β产生

（1）猪bmdm、pbmc、pk-15和thp-1细胞用2μm尼日利亚霉素处理或分别接种uv灭活后的sva、热灭活的sva或感染sva；或者以剂量依赖性方式转染sva-rna或单独转染poly（da:dt）转染pk-15细胞24h，用elisa、qpcr和westernblot检测il-1β水平；再或者pk-15和thp-1细胞经2μm尼日利亚霉素处理2h、100μmchx作用1h，或sva感染24h、100μmchx作用1h，24h后用elisa和qpcr检测il-1β水平。具体检测方法参照bio-ray小鼠或猪源elisa检测试剂说明书。如图4a和4b所示，当sva病毒经过紫外、热处理后，不能诱导il-1β的分泌和mrna表达水平的上调，这说明sva的感染以及rna的复制或转录是sva诱导所必需的。如图4d-4f所示，当sva病毒感染后的细胞经过chx处理后，sva不能够引起il-1β的产生，这说明sva的翻译是诱导il-1β分泌和表达所必需的。同时，如图4c所示，发现当sva的rna进行转染后，能够诱导il-1β的产生。这说明当病毒rna可能转入细胞中，能够转录形成mrna用以形成蛋白，最终诱导il-1β的产生。

实施例4总体说明，sva诱导il-1β的产生可能需要其病毒蛋白参与。

实施例5sva3d蛋白促进nlrp3炎症小体的活化

图5中的a-b为nlrp3、asc、pro-casp1和pro-il-1β质粒与表达sva不同蛋白的质粒共同转染hek293细胞。elisa法和qpcr法检测il-1β水平，具体方法参照和bio-rayelisa检测试剂盒说明书。如图5a和5b所示，筛选到sva的3d蛋白能够诱导il-1β的分泌（a）和mrna表达上调（b）。

图5c和5d显示，在pk-15细胞中，sva的3d蛋白能够诱导il-1β的分泌（c）和mrna表达上调（d），且具有剂量依赖性。

图5e证实，sva的3d蛋白能够诱导asc的寡聚化。

实施例5的结果表明sva的3d蛋白具有诱导il-1β的分泌和表达的能力。

实施例6sva3d蛋白利用氨基端（1～154aa）结合nlrp3的nacht结构域进而激活nlrp3炎症小体

（1）图6-a为用myc-nlrp3、myc-caspase-1或asc联合flag-3d转染hek293细胞，用sds-page检测细胞裂解产物的结果图。结果表明，3d蛋白能够诱导nlrp3蛋白的表达上调。

（2）用flag-3d和myc-nlrp3或nlrp3的myc-nacht结构域转染hek293细胞，用igg、抗myc或抗flag一级抗体对细胞裂解液进行ip（免疫共沉淀）处理，如图6b和6c，结果表明，3d蛋白与nlrp3的natch结构域相互作用。

图6中的d-f为将3d基因分为3个平均长度的片段，每个片段分别删除。标识为flag-3d-12（△926～1389bp），flag-3d-13（△463～926bp），flag-3d-23（△1～463bp）。缺失突变体分别与nlrp3共表达。24小时后，用相关抗体对蛋白质样品进行ip处理，并用westernblot进行检测。结果表明：sva的3d蛋白的n端（1～154aa）能够与nlrp3结合。

本实施例表明，3d蛋白利用白利用氨基端（1～154aa）结合nlrp3的nacht结构域进而激活nlrp3炎症小体。

实施例7sva毒株攻毒及其动物体内il-1β和血清病毒中和效价测定

1、动物攻毒实验

使用dmem，r-lenti-3d，empty-lenti于小鼠尾静脉部位注射，接种后，在0～7天内分别观察动发病情况，并采集血清以及组织样品。如图7a所示，小鼠接种含3d基因的慢病毒（r-lenti-3d）后，小鼠在七天全部死亡，对照全部存活。图7b显示，3d基因表达后，小鼠组织明显发生充血和肿大。

使用dmem，sva毒株（3×10⁹拷贝数/头），r-lenti-3d，empty-lenti于猪（90日龄）大腿内侧部位进行肌肉注射，接种后，在0～7天内分别观察动物体温发病情况，同时采集血清或组织样品，并统计死亡率。

2、（1）动物血清或组织il-1β的elisa检测

将采集的血液样本置于37℃，30分钟，然后置于4℃过夜凝集，2000rpm,10分钟离心，收集上清，-80℃待用。检测接种动物血清中il-1β含量。

如图1a所示，猪接种sva后，猪血清中的il-1β的分泌上调。

如图7d和图8a-d所示，动物接种3d以后，相对于对照组，接种3d组诱导血清和组织的il-1β的分泌和蛋白表达以及il-1βmrna表达水平上调。这说明3d在动物水平能够诱导il-1β介导的炎症应答。

将动物不同组织进行切片后染色，如图7c所示，接种3d蛋白的小鼠，能够诱导部分组织发生侵润。但如图8e所示，接种3d的猪的组织显示，与对照相比，无明显变化。这可能是由于在猪体内的慢病毒表达的3d蛋白含量相对小鼠来说较少。

（2）sva病毒滴度测定

将感染sva的细胞进行反复冻融三次后，将裂解液进行过滤，将sva按照10倍梯度稀释后，接种培养有ibrs2细胞的96孔板，每天观察细胞病变情况，记录并计算sva的tcid50，收集的细胞毒用于后期的感染实验。

（3）动物组织il-1β表达检测

将7天采集的动物组织如外周血（pbmc）、脾脏、肾脏、心脏、肺脏组织用于病毒含量以及il-1β的mrna以及elisa检测。pbmc加入红细胞裂解液，裂解10min，500×g,5分钟离心，弃上清，pbs分别清洗沉淀3次，500×g，5分钟离心，提取rna，反转录后，检测sva病毒含量以及il-1β的mrna表达水平变化。动物组织，取1立方厘米大小组织，研磨，pbs冲洗收集研磨后的细胞，提取rna，反转录后检测il-1β的mrna表达水平变化。同时将研磨后收集的上清，利用试剂盒检测il-1β的蛋白含量。

结果如图7和8显示，3d过表达的接种动物相对于无3d表达的接种动物，动物血清的il-1β含量显著上升，同时，外周血淋巴细胞、脾脏、肺脏、心脏、肾脏的il-1β含量和mrna表达水平也显著上升。

以上所有的实施例结果表明，sva3d蛋白能够通过激活nf-kb的“第一信号”，通过结合nlrp3蛋白的natch结构域并且改变细胞内的钾离子和钙离子浓度，进而显著促进nlrp3介导的il-1β炎症应答水平。本结论在动物水平也得到了证实。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

sequencelisting

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>塞尼卡谷病毒3d蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用

<130>无

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>462

<212>prt

<213>senecavirusa

<400>1

glyleumetthrgluleugluproglyvalthrvalhisvalproarg

151015

lysserlysleuarglysthrthralahisalavaltyrlysproglu

202530

phegluproalavalleuserlyspheaspproargleuasnlysasp

354045

valaspleuaspgluvaliletrpserlyshisthralaasnvalpro

505560

tyrglnproproleuphetyrthrtyrmetserglutyralahisarg

65707580

valpheserpheleuglylysaspasnaspvalleuthrvallysglu

859095

alaileleuglyileproglyleuaspprometaspprohisthrala

100105110

proglyleuprotyralaileserglyleuargargthraspleuval

115120125

aspphealaasnglythrvalaspproalaleualametglnilegln

130135140

lyspheleuaspglyasptyrserasphisvalpheglnthrpheleu

145150155160

lysaspgluileargproserglulysvalargalaglylysthrarg

165170175

ilevalaspvalproserleualahiscysilevalglyargmetleu

180185190

leuglyargphealaalalyspheglnserhisproglypheleuleu

195200205

glyseralaileglyseraspproaspvalphetrpthrvalilegly

210215220

alaglnleugluglyarglysasnthrtyraspvalasptyrserala

225230235240

pheaspserserhisglythrglyserpheglualaleuiletyrhis

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<213>人工序列（artificialsequence）

<400>3

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