聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及肿瘤治疗领域，具体来说是指聚乙二醇洛塞那肽的免疫活化作用和抗肿瘤用途。

背景技术：

肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。传统的手术、放疗、化疗等方案在一定程度上抑制了肿瘤的进展，但难以控制肿瘤的复发、转移。随着不断出现的令人振奋的临床研究结果，抗肿瘤免疫治疗给肿瘤患者带来了希望。免疫系统具有识别并清除异己的能力，肿瘤在发生发展过程中不仅通过多种途径抑制免疫系统的先天性免疫反应，也通过限制自身“新”抗原的“展示”和启动免疫检查点等诸多方法来“麻痹”浸润的免疫效应细胞，从而达到逃避免疫识别和免疫清除的目的。如何有效的活化抗肿瘤免疫反应，解除免疫逃避，从而达到免疫清除的效果，一直是肿瘤免疫治疗领域所追求的目标。

胰高血糖素样肽-1(glp-1)是人体内分泌的一种内源性多肽，它是胰高血糖素原基因经组织特异性的翻译后加工得到的30个氨基酸的肽类激素。glp-1通过与其受体glp-1r结合，刺激胰岛素分泌，起到降低血糖的作用。glp-1还可以通过多种途径产生降低体重的效果，包括抑制胃肠道蠕动和胃液分泌、抑制食欲及摄食、延缓胃内容物排空等等。除此之外，glp-1还可作用于中枢神经系统(尤其是下丘脑)，从而使人产生饱胀感并降低食欲。glp-1还具有许多生理功能，比如降脂、降压、保护心血管系统，再比如通过作用于中枢增强学习和记忆功能、保护神经等等。目前为止，并未出现其具有免疫活化或者具有抗肿瘤免疫活化的报道。

glp-1的半衰期极短，仅有1.5～2分钟，无法在临床上用于糖尿病和其他病症的治疗。因此，目前制药领域都是在尝试研发半衰期长的胰高血糖素样肽-1受体(glp-1r)的人工合成激动剂，期望延长半衰期、又具有glp-1类似的活性和功能。

聚乙二醇洛塞那肽(孚来美)是一种新型的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂。它是江苏豪森药业集团有限公司研制的一种胰高血糖素样肽-1受体(glp-1r)的人工合成激动剂。

目前为止还没有聚乙二醇洛塞那肽用于肿瘤治疗或者抗肿瘤的报道，也没有其具有免疫活化或者抗肿瘤免疫活化的数据或者结果的报道。我们在筛选具有免疫活化功能的上市多肽类药物时发现其具有令人意想不到的功能——免疫活化作用，因此，我们尝试将其应用于抗肿瘤免疫活化和抗肿瘤免疫治疗。

技术实现要素：

本发明的目的是通过体外研究揭示聚乙二醇洛塞那肽的免疫活化活性及其在制备活化抗肿瘤免疫药物上的应用；通过多个体内动物模型，确认聚乙二醇洛塞那肽的免疫活化作用及其在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用。

本发明在体外确认了聚乙二醇洛塞那肽在制备免疫活化药物上的应用。进一步，本发明在多个体内模型上确认了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫活化药物上的应用，在体内确认了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用。同时，也确认了聚乙二醇洛塞那肽的基本安全性。

本发明内容概括如下：

(1)聚乙二醇洛塞那肽在体外显著刺激免疫细胞增殖，显著刺激干扰素γ(ifn-γ)的释放，具有明确的免疫活化作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备免疫活化药物上的应用。

(2)聚乙二醇洛塞那肽在体内显著刺激干扰素γ(ifn-γ)的释放，具有明确的免疫活化作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫活化药物上的应用。

(3)聚乙二醇洛塞那肽在体内显著抑制肿瘤生长，显著延长荷瘤小鼠的生存期，具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用。

(4)聚乙二醇洛塞那肽在多个体内动物肿瘤模型上显著抑制肿瘤生长、显著延长荷瘤小鼠的生存期，这些肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤，具有广泛的作用范围，具有明确的广谱抗肿瘤免疫治疗作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的广泛应用价值。

(5)聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的抑制或者延缓转移复发，以及延长肿瘤术后生存期的作用。

(6)而且，非常重要的一点是，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以聚乙二醇洛塞那肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

总的来说，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备刺激免疫细胞增殖药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备增强干扰素γ(ifn-γ)表达药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备免疫活化药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备抗肿瘤免疫活化药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备抗肿瘤免疫治疗药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备抗肿瘤药物。聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备抑制或者延缓转移复发以及延长肿瘤术后生存期药物。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以聚乙二醇洛塞那肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

附图说明

图1聚乙二醇洛塞那肽对外周血单核细胞(pbmc)的增殖刺激作用

图2聚乙二醇洛塞那肽对外周血单核细胞(pbmc)分泌ifn-γ的刺激作用

图3小鼠黑色素瘤模型上聚乙二醇洛塞那肽的抗肿瘤免疫治疗效果(a)elispot结果(b)不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(c)不同处理组小鼠的生存期变化

图4小鼠乳腺癌模型上聚乙二醇洛塞那肽的抗肿瘤免疫治疗效果(a)elispot结果(b)不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(c)不同处理组小鼠的生存期变化

图5小鼠结肠癌模型上聚乙二醇洛塞那肽的抗肿瘤免疫治疗效果(a)elispot结果(b)不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(c)不同处理组小鼠的生存期变化

图6小鼠转移复发性乳腺癌模型上术后不同处理组小鼠的生存期变化

图7小鼠转移复发性非小细胞肺癌模型上术后不同处理组小鼠的生存期变化

图8小鼠转移复发性结肠癌模型上术后不同处理组小鼠的生存期变化

具体实施方式

实施例1在外周血单核细胞上检测多肽药物的免疫活化功能

一、实验方法

1、筛选对象的确定

我们利用drugbank数据库检索多肽药物，排除fda批准的用于感染性疾病治疗、血液系统疾病治疗、肿瘤治疗和免疫调节的多肽，留下的这些多肽所获批的功能与肿瘤治疗和免疫调控是没有关系的。功能集中为治疗激素失调、治疗性功能障碍、治疗糖尿病、治疗胃肠消化道疾病、治疗遗传性疾病、治疗心血管疾病、治愈骨病、治疗神经系统疾病、治疗呼吸紊乱、治疗眼障碍治疗吸收不良症。这当中包括用于糖尿病治疗的多肽药物。另外，也检索了中国上市的特有的用于糖尿病治疗的多肽药物。在汇总fda和中国sfda批准的用于糖尿病治疗的多肽药物之后，我们通过各种途径购买获得这些多肽用于本发明的体内外活性检测和确认。我们首先在外周血单核细胞上筛选这批多肽的免疫活化功能，筛选发现其中一种糖尿病治疗多肽——聚乙二醇洛塞那肽具有较强的免疫活化功能。聚乙二醇洛塞那肽由江苏豪森药业集团有限公司出品，我们购自鼓楼大药房(生产批号：190603)，直接按照剂量使用或者pbs稀释使用。

2、聚乙二醇洛塞那肽对外周血单核细胞(pbmc)的增殖刺激作用的检测

无菌条件下取健康志愿者的外周血,利用肝素抗凝,然后使用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(pbmc),细胞重悬在含10％胎牛血清的rpmi-1640细胞培养基当中，调整pbmc细胞浓度为3×10⁵/ml,将pbmc接种到96孔细胞板,每孔200μl,加入聚乙二醇洛塞那肽至终浓度为1μmol/l,用pbs作为对照，37℃5％的co2条件下培养72h。72h之后用碧云天的增强型cck-8试剂盒(货号c0042)检测细胞的增殖情况。

3、聚乙二醇洛塞那肽对外周血单核细胞(pbmc)的ifn-γ刺激分泌的检测

无菌条件下取健康志愿者的外周血,利用肝素抗凝,然后使用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(pbmc),细胞重悬在含10％胎牛血清的rpmi-1640细胞培养基当中，调整pbmc细胞浓度为3×10⁵/ml,将pbmc接种到96孔细胞板,每孔200μl,加入聚乙二醇洛塞那肽至终浓度为1μmol/l,用pbs作为对照，37℃5％的co2条件下培养72h。72h之后离心取上清液，用invitrogen的elisa试剂盒(货号88-7316-76)检测细胞的ifn-γ刺激分泌情况。

二、实验结果

聚乙二醇洛塞那肽能够显著刺激外周血单核细胞(pbmc)的增殖。图1的结果显示，pbmc在经过pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽处理培养72h之后，cck-8试剂盒检测450nm处的平均吸光值a450分别为0.4598和0.7226，聚乙二醇洛塞那肽处理组是pbs对照组的接近1.6倍，而且两组之间有显著差异(p<0.05),聚乙二醇洛塞那肽能够显著刺激pbmc的增殖。这样的初步结果说明聚乙二醇洛塞那肽具有一定的免疫活化作用，这一结果也大大出乎我们的预料，这一结果暗示聚乙二醇洛塞那肽可能具有用于抗肿瘤或者抗病毒的潜在治疗作用。

聚乙二醇洛塞那肽能够显著刺激外周血单核细胞(pbmc)的ifn-γ的分泌。图2的结果显示，pbmc在经过pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽处理培养72h之后，ifn-γ的elisa试剂盒检测pbmc细胞胞外清液当中ifn-γ的浓度，结果显示pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽处理组胞外ifn-γ的浓度分别为74和119pg/ml，两组之间有显著差异(p<0.05)，结果说明聚乙二醇洛塞那肽能够显著刺激pbmc分泌ifn-γ。这样的结果既肯定了前面的增殖刺激实验，也能够说明聚乙二醇洛塞那肽具有确定的免疫活化作用，这一结果也大大出乎我们的预料，这一结果暗示聚乙二醇洛塞那肽具有用于抗肿瘤或者抗病毒的潜在治疗作用。

三、实验小结

本实施例的以上结果非常有趣，第一次检测到聚乙二醇洛塞那肽在体外具有明确的免疫活化作用，而且由于细胞选用的是正常健康志愿者的外周血pbmc，所以体外的免疫活化作用并不依赖于pbmc来源者是不是2型糖尿病患者，也就是说聚乙二醇洛塞那肽的这一活性和功能并不依赖于其已有的功能、与已有功能无关。在确认其具有明确的免疫活化的基础上，下一步我们将在多个肿瘤模型上检测其抗肿瘤免疫治疗作用，以及在体内动物模型上的免疫活化作用。

实施例2正常小鼠黑色素瘤模型上观察聚乙二醇洛塞那肽的治疗效果

一、实验方法

我们选用的是正常健康小鼠c57bl/6，小鼠免疫健全、血糖正常，主要是想在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(黑色素瘤模型)，然后观察治疗效果和免疫活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果聚乙二醇洛塞那肽有效的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

选用6-8周龄c57bl/6小鼠，在右侧腋窝建立皮下黑色素瘤模型。每只小鼠一侧接种5×10⁶个b16/f10黑色素瘤细胞，6天左右之后测量肿瘤大小至约200mm³，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：pbs对照组(100μlpbs)和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射治疗组(聚乙二醇洛塞那肽剂量为20μg/kg，注射体积100μl)，每5天皮下注射1次。聚乙二醇洛塞那肽开始处理的当天记为给药的第0天，在给药的第0天聚乙二醇洛塞那肽和pbs处理前测量瘤子体积、小鼠称重。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其中每组当中随机取6只在给药的第7天，取出瘤子，使用abcam的小鼠interferongammaelispot试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做elispot检测，检测肿瘤组织当中ifn-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿瘤体积，体重，记录小鼠生存期(生存期起算日为荷瘤之日起)。肿瘤体积公式为v＝0.5×长×宽²。

二、实验结果

在正常小鼠黑色素瘤模型上，pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射处理之后，使用interferongammaelispot试剂盒检测ifn-γ的分泌情况，图3a结果显示pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽处理组ifn-γ的elispot分别为170和289spots/2×10⁵细胞，两组之间有显著差异(p<0.05),与pbs对照组比较，聚乙二醇洛塞那肽处理组能够显著刺激ifn-γ的分泌。这样的结果既充分肯定了前面聚乙二醇洛塞那肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的免疫活化作用。

图3b的结果显示，在正常小鼠黑色素瘤模型上，pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射处理之后，注射处理之后的第6天和第9天的结果显示聚乙二醇洛塞那肽处理组能够显著性抑制瘤子体积的增长(p<0.05)。这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，也能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。

图3c的结果显示，在正常小鼠黑色素瘤模型上，pbs对照组，在荷瘤之后的第27天就开始出现小鼠死亡，至第34天小鼠全部死亡。而聚乙二醇洛塞那肽处理组到第31天才开始出现小鼠死亡，直到第45天小鼠全部死亡。聚乙二醇洛塞那肽皮下注射可以显著性的延长黑色素瘤荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。

三、实验小结

正常小鼠黑色素瘤模型的体内结果显示聚乙二醇洛塞那肽具有明确的免疫活化作用和抗肿瘤免疫治疗作用，聚乙二醇洛塞那肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即聚乙二醇洛塞那肽具有显著的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以聚乙二醇洛塞那肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

实施例3正常小鼠乳腺癌模型上观察聚乙二醇洛塞那肽皮下注射的治疗效果

一、实验方法

我们选用的是正常健康balb/c雌性小鼠，小鼠免疫健全、血糖正常，主要是想在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(乳腺癌模型)，然后观察治疗效果和免疫活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果聚乙二醇洛塞那肽有效的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

选用6-8周龄balb/c雌性小鼠，在右侧腋下脂肪垫处建立皮下乳腺癌模型。每只小鼠一侧接种5×10⁶个小鼠4t1乳腺癌细胞，8天左右之后测量肿瘤大小至约200mm³，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：pbs对照组(100μlpbs)和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射治疗组(聚乙二醇洛塞那肽剂量为20μg/kg，注射体积100μl)，每5天皮下注射1次。聚乙二醇洛塞那肽开始处理的当天记为给药的第0天，在给药的第0天聚乙二醇洛塞那肽和pbs处理前测量瘤子体积、小鼠称重。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其中每组当中随机取6只在第7天，取出瘤子，使用abcam的小鼠interferongammaelispot试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做elispot检测，检测肿瘤组织当中ifn-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿瘤体积，体重，记录小鼠生存期(生存期起算日为荷瘤之日起)。肿瘤体积公式为v＝0.5×长×宽²。

二、实验结果

图4a的结果显示，在正常小鼠乳腺癌模型上，pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射处理之后，使用interferongammaelispot试剂盒检测ifn-γ的分泌情况，结果显示pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽处理组ifn-γ的elispot分别为181和300spots/2×10⁵细胞，两组之间有极显著差异(p<0.05),与pbs对照组比较，聚乙二醇洛塞那肽处理组是对照组的1.7倍、能够显著刺激ifn-γ的分泌。这样的结果既肯定了前面聚乙二醇洛塞那肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的免疫活化作用。

图4b的结果显示，在正常小鼠乳腺癌模型上，pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射处理之后，与对照组相比，第6天和第9天的结果显示聚乙二醇洛塞那肽处理组能够显著性抑制瘤子体积的增长(p<0.05)。这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，也能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。

图4c的结果显示，在正常小鼠乳腺癌模型上，pbs对照组，在荷瘤之后的第25天就开始出现小鼠死亡，至第34天小鼠全部死亡。而聚乙二醇洛塞那肽处理组到第31天才开始出现小鼠死亡，直到第43天小鼠全部死亡。聚乙二醇洛塞那肽皮下注射可以显著性的延长乳腺癌荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。

三、实验小结

正常小鼠乳腺癌模型的体内结果显示聚乙二醇洛塞那肽具有明确的免疫活化作用和抗肿瘤免疫治疗作用，聚乙二醇洛塞那肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即聚乙二醇洛塞那肽具有显著的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以聚乙二醇洛塞那肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

实施例4正常小鼠结肠癌模型上观察聚乙二醇洛塞那肽的治疗效果

一、实验方法

我们选用的是正常健康balb/c雌性小鼠，小鼠免疫健全、血糖正常，主要是想在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(结肠癌模型)，然后观察治疗效果和免疫活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果聚乙二醇洛塞那肽有效的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

选用6-8周龄balb/c雌性小鼠，在右侧腋下脂肪垫处建立皮下结肠癌模型。每只小鼠一侧接种5×10⁵个小鼠ct26结肠癌细胞，10天左右之后测量肿瘤大小至约200mm³，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：pbs对照组(100μlpbs)和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射治疗组(聚乙二醇洛塞那肽剂量为20μg/kg，注射体积100μl)，每5天皮下注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其中每组当中的6只在第7天，取出瘤子，使用abcam的小鼠interferongammaelispot试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做elispot检测，检测肿瘤组织当中ifn-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿瘤体积，体重，记录小鼠生存期，聚乙二醇洛塞那肽开始处理的当天记为第0天，在第0天聚乙二醇洛塞那肽和pbs处理前测量瘤子体积、称重。肿瘤体积公式为v＝0.5×长×宽²。

二、实验结果

图5a的结果显示，在正常小鼠结肠癌模型上，pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射处理之后，使用interferongammaelispot试剂盒检测ifn-γ的分泌情况，结果显示pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽处理组ifn-γ的elispot分别为197和325.6spots/2×10⁵细胞，两组之间有显著差异(p<0.05),与pbs对照组比较，聚乙二醇洛塞那肽处理组是对照组的1.6倍多、能够显著刺激ifn-γ的分泌。这样的结果既肯定了前面聚乙二醇洛塞那肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的免疫活化作用。

图5b的结果显示，在正常小鼠结肠癌模型上，pbs对照和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射处理之后，与对照组相比，第6天和第9天的结果显示聚乙二醇洛塞那肽处理组能够抑制瘤子体积的增长，第6天和第9天都可以显著抑制肿瘤体积(p<0.05)。这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，也能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。

图5c的结果显示，在正常小鼠结肠癌模型上，pbs对照组，在荷瘤之后的第23天开始出现小鼠死亡，至第34天小鼠全部死亡。而聚乙二醇洛塞那肽处理组到第30天才开始出现小鼠死亡，直到第45天小鼠全部死亡。聚乙二醇洛塞那肽皮下注射可以显著性的延长结肠癌荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。

三、实验小结

正常小鼠结肠癌模型的体内结果显示聚乙二醇洛塞那肽具有明确的免疫活化作用和抗肿瘤作用，聚乙二醇洛塞那肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即聚乙二醇洛塞那肽具有显著的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以聚乙二醇洛塞那肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

实施例5小鼠转移复发性乳腺癌模型上观察聚乙二醇洛塞那肽对术后生存期的影响

一、实验方法与材料

1、实验材料：

2、4t1细胞培养

小鼠乳腺癌4t1细胞的培养基为含10％胎牛血清、100u/ml盘尼西林和100μg/ml链霉素的rpmi-1640完全培养基，细胞在温度为37℃、co2浓度为5％的恒温培养箱中持续培养。

人hcc细胞株bel-7402、huh-7、plc/prf/5、smmc-7721均购于上海中国科学院细胞库。细胞株mhcc97h由复旦大学附属中山医院贾凡教授赠送。这五种hcc细胞的培养基均为添加了10％胎牛血清的dmem完全培养基。细胞在温度为37℃、co2浓度为5％的恒温培养箱中持续培养。

3、小鼠饲养

实验动物为：6周龄雌性spf级balb/c小鼠，重约20g。饲养于spf级动物房中，环境温度为22℃～25℃、相对湿度为40％～60％，昼夜光周期为12:12小时，用高压灭菌水和商业老鼠饲料喂养。

4、乳腺原位转移瘤模型构建与手术

取对数生长期的4t1细胞，胰酶消化后用pbs制备成浓度为2×106/ml的细胞悬液；取0.1ml的4t1细胞悬液接种于小鼠左侧第四对乳腺脂肪垫，构建小鼠乳腺原位瘤模型。接种完成后，逐日观察小鼠状态、接种部位有无感染以及肿瘤生长情况；用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，根据公式(长×宽2)/2计算肿瘤体积并记录，绘制曲线。同时称量及记录小鼠体重。

待接种4t1细胞后11天，乳腺原位瘤直径达到5mm左右。在异氟烷气体麻醉下完全切除小鼠乳腺肿瘤组织，清除粘连的乳腺脂肪垫，缝合切开的皮肤。手术完成后，逐日观察小鼠状态、乳腺原位瘤是否复发以及小鼠生存期。

给药方式：将小鼠随机分成2组，每组6只，分别是：pbs对照组(100μlpbs)和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射治疗组(聚乙二醇洛塞那肽剂量为20μg/kg，注射体积100μl)，每5天皮下注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。第一次给药是在荷瘤之后的第9天(也是术前2天)，之后每5天皮下注射1次，合计注射4次。

二、实验结果

图6的结果显示，在小鼠转移复发性乳腺癌模型上，荷瘤之后的第11天做乳腺癌移除手术，在荷瘤之后的第9天(也是术前2天)，之后每5天皮下注射1次，合计注射4次。pbs对照组，在荷瘤之后的第33天开始出现小鼠死亡，至第44天小鼠全部死亡。而聚乙二醇洛塞那肽处理组到第42天才开始出现小鼠死亡，直到第55天小鼠全部死亡。聚乙二醇洛塞那肽皮下注射可以显著性的延长转移复发性乳腺癌荷瘤小鼠术后的生存期。

三、实验小结

这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的延长转移复发性肿瘤术后生存期的作用。

实施例6小鼠转移复发性非小细胞肺癌模型上观察聚乙二醇洛塞那肽对术后生存期的影响

一、实验方法与材料：

1.llc细胞培养

小鼠肺癌llc细胞的培养基为含10％胎牛血清、100u/ml盘尼西林和100μg/ml链霉素的dmem完全培养基，细胞在温度为37℃、co2浓度为5％的恒温培养箱中持续培养。

2.小鼠饲养

实验动物为：6周龄雄性spf级c57小鼠，重约20g。饲养于spf级动物房中，环境温度为22℃～25℃、相对湿度为40％～60％，昼夜光周期为12:12小时，用高压灭菌水和商业老鼠饲料喂养。

3.肺癌术后模型构建

取对数生长期的llc细胞，胰酶消化后用pbs制备成浓度为1×107/ml的细胞悬液；取0.2ml的llc细胞悬液接种于小鼠右侧背部皮下，构建小鼠肺癌模型。接种完成后，每日观察小鼠状态、接种部位有无感染以及肿瘤生长情况；用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，根据公式(长×宽2)/2计算肿瘤体积并记录，绘制曲线。同时称量及记录小鼠体重。

待llc皮下瘤体积达到1000～1500mm3(接种llc细胞后19天)，在异氟烷气体麻醉下彻底切除小鼠llc皮下瘤，清除粘连的结缔组织，缝合切开的皮肤。手术完成后，每日观察小鼠状态、llc皮下瘤是否复发以及小鼠生存期。待小鼠死亡后，解剖小鼠观察有无肺、肝脏等部位转移。

给药方式：将小鼠随机分成2组，每组6只，分别是：pbs对照组(100μlpbs)和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射治疗组(聚乙二醇洛塞那肽剂量为20μg/kg，注射体积100μl)，每5天皮下注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。第一次给药是在荷瘤之后的第17天(也是术前2天)，之后每5天皮下注射1次，合计注射4次。

4.实验材料：

二、实验结果

图7的结果显示，在小鼠转移复发性非小细胞肺癌模型上，荷瘤之后的第19天做非小细胞肺癌移除手术，在荷瘤之后的第17天(也是术前2天)注射待测药物，之后每5天皮下注射1次，合计注射4次。pbs对照组，在荷瘤之后的第39天开始出现小鼠死亡，至第51天小鼠全部死亡。而聚乙二醇洛塞那肽处理组到第51天才开始出现小鼠死亡，直到第66天小鼠全部死亡。聚乙二醇洛塞那肽皮下注射可以显著性的延长转移复发性非小细胞肺癌荷瘤小鼠术后的生存期。

三、实验小结

这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的延长转移复发性肿瘤术后生存期的作用。

实施例7小鼠转移复发性结肠癌模型上观察聚乙二醇洛塞那肽对术后生存期的影响

一、实验方法：

1.ct26细胞培养

小鼠结肠癌ct26细胞的培养基为含10％胎牛血清、100u/ml盘尼西林和100μg/ml链霉素的dmem完全培养基，细胞在温度为37℃、co2浓度为5％的恒温培养箱中持续培养。

2.小鼠饲养

实验动物为：6周龄雄性spf级balb/c小鼠，重约20g。饲养于spf级动物房中，环境温度为22℃～25℃、相对湿度为40％～60％，昼夜光周期为12:12小时，用高压灭菌水和商业老鼠饲料喂养。

3.结肠癌术后模型构建

取对数生长期的ct26细胞，胰酶消化后用pbs制备成浓度为1×107/ml的细胞悬液；取0.1ml的ct26细胞悬液接种于小鼠右侧背部皮下，构建小鼠结肠癌模型。接种完成后，每日观察小鼠状态、接种部位有无感染以及肿瘤生长情况；用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，根据公式(长×宽2)/2计算肿瘤体积并记录，绘制曲线。同时称量及记录小鼠体重。

待ct26皮下瘤体积达到1000～1500mm3(接种ct26细胞后17天左右)，在异氟烷气体麻醉下彻底切除小鼠ct26皮下瘤，清除粘连的结缔组织，缝合切开的皮肤。手术完成后，每日观察小鼠状态、ct26皮下瘤是否复发以及小鼠生存期。待小鼠死亡后，解剖小鼠观察有无肺、肝脏、胃肠道等部位转移。

给药方式：将小鼠随机分成2组，每组6只，分别是：pbs对照组(100μlpbs)和聚乙二醇洛塞那肽皮下注射治疗组(聚乙二醇洛塞那肽剂量为20μg/kg，注射体积100μl)，每5天皮下注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。第一次给药是在荷瘤之后的第15天(也是术前2天)，之后每5天皮下注射1次，合计注射4次。

二、实验结果

图8的结果显示，在小鼠转移复发性结肠癌模型上，荷瘤之后的第17天做结肠癌移除手术，在荷瘤之后的第15天(也是术前2天)注射待测药物，之后每5天皮下注射1次，合计注射4次。pbs对照组，在荷瘤之后的第37天开始出现小鼠死亡，至第53天小鼠全部死亡。而聚乙二醇洛塞那肽处理组到第46天才开始出现小鼠死亡，直到第63天小鼠全部死亡。聚乙二醇洛塞那肽皮下注射可以显著性的延长转移复发性结肠癌荷瘤小鼠术后的生存期。

三、实验小结

这样的结果与前面聚乙二醇洛塞那肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说明聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的延长转移复发性肿瘤术后生存期的作用。

具体实施方式部分的总结：

(1)聚乙二醇洛塞那肽在体外能够显著刺激免疫细胞增殖，显著刺激干扰素γ(ifn-γ)的分泌释放，具有明确的免疫活化作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备免疫活化药物上的应用。

(2)聚乙二醇洛塞那肽在体内能够显著刺激干扰素γ(ifn-γ)的释放，具有明确的免疫活化作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备免疫活化药物上的应用，进一步的揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫活化药物上的应用。

(3)聚乙二醇洛塞那肽在体内能够显著抑制肿瘤生长，显著延长荷瘤小鼠的生存期，具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用。

(4)聚乙二醇洛塞那肽在多个体内动物肿瘤模型上能够显著抑制肿瘤生长、显著延长荷瘤小鼠的生存期，这些肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤，具有广泛的作用范围，具有明确的广谱抗肿瘤免疫治疗作用，揭示了聚乙二醇洛塞那肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的广泛应用价值。

(5)非常重要的一点是，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以聚乙二醇洛塞那肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

(6)聚乙二醇洛塞那肽在体内具有明确的延长转移复发性肿瘤术后生存期的作用。

总的来说，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备刺激免疫细胞增殖药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备增强干扰素γ(ifn-γ)表达药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备免疫活化药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备抗肿瘤免疫活化药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备抗肿瘤免疫治疗药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备抗肿瘤药物，聚乙二醇洛塞那肽可以用来制备延长转移复发性肿瘤术后生存期的药物。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以聚乙二醇洛塞那肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。