一种五味子木脂素常规脂质体制备工艺的制作方法

本发明涉及中药制剂领域，具体涉及一种五味子木脂素常规脂质体制备工艺。

背景技术：

五味子为五味子科植物，五味子干燥成熟果实，又称“北五味子”。又名五梅子、玄及、会及、山花椒等。五味子木脂素的主要成分为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素。主要有保肝、降糖、抗氧化、抗衰老、镇定、等作用。木脂素存在于植物中，其具体表现为亲脂性，很难到达真皮层，生物利用率低，属于一种植物雌激素。

五味子的主要成分木脂素，属于脂溶性化合物，因此难以到达真皮层，故考虑将其制备为新型剂型来进行渗透，达到真皮层。

脂质体是一种靶向人工膜，可包裹携带药物进入细胞膜，增加药物透过率，木脂素在被脂质体包裹后，可以快速的进入我们的皮肤或体内，在体内进行靶向治疗可降低毒性，在制剂上可以研发出比如化妆品，软膏剂等等更多型的制剂，为五味子木脂素经皮渗透实验，对其的广泛应用和深入开发奠定基础。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种五味子木脂素常规脂质体制备工艺。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种五味子木脂素常规脂质体制备工艺，包括如下步骤：

精密称取100mg五味子总提取物，加入15ml无水乙醇，超声5min溶解，放置于20ml离心管中，在1000rpm·min^-1的条件下进行离心5min，取上清液加入适量胆固醇和大豆卵磷脂，加入适量无水乙醇，超声溶解5min，在55℃水浴下旋转蒸发出去溶剂，在烧杯壁上形成一薄膜层，加入适量磷酸盐缓冲液使薄膜完全溶解后，超声5min，得到脂质体混悬液，取出于4℃冰箱保存。

进一步地，胆固醇与卵磷脂的比例为1∶2，成膜温度为65℃，磷酸缓冲溶液的ph为6.8。

本发明具有以下有益效果：

通过过单因素考察和正交试验筛选最优脂质体制备处方，以达到提高包封率，从而提高五味子木脂素的透皮性，并对脂质体的粒径电位等方面进行考察，以达到均粒工艺。

附图说明

图1为五味子混合标准品色谱图；

注：1为五味子醇甲；2为五味子醇乙；3为五味子甲素；4为五味子乙素

图2为五味子醇甲标准曲线；

图3为五味子木脂素脂质体色谱图；

注：1为五味子醇甲；2为五味子醇乙；3为五味子甲素；4为五味子乙素。

图4为膜材比考察结果曲线。

图5为膜材比考察结果曲线。

图6为膜材比考察结果曲线。

图7为磷酸缓冲溶液ph考察结果曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

材料

本实验所用五味子提取物，2020年9月购自于惠州市神农本草保健制品有限公司。

方法

2.1色谱条件的建立

色谱柱agilentzorbaxsb-c18(5μm，4.6×150mm)，流动相：水(a)–甲醇(b)，洗脱比例0~18min，73%b；18~25min，73%~100%b；25~35min，100%~10%b；35~55min，10%~73%b，流速1ml·min^-1，柱温30℃，检测波长254nm，进样体积10μl。

标准品溶液的配置

分别称取标准品五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素适量溶于25ml容量瓶中，配制成浓度均为0.2mg·ml^-1的混合对照品溶液^[8]。

标准曲线的建立

分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml的含混合对照品后用甲醇定容至10.0ml容量瓶中，按拟定色谱条件分别进样10l，记录峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

方法学考察

2.4.1精密度考察

取浓度为0.1mg·ml^-1对照品溶液自动进样10l，连续进样6次，测定峰面积，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对应峰面积的相对标准偏差。

稳定性考察

供试液溶液制备见“2.2”项下。分别于室温放置0、2、4、6、8、10h后，取10l进样。计算待测成分五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面积的rsd。

重复性考察

取同一批五味子药材粉末，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，重复制备6份，按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，通过计算各木脂素类化合物的保留时间以及峰面积的rsd，进行方法的重复性的考察。

加样回收率试验

精密量取9份已知浓度的五味子醇甲5%的样品溶液，准确加入五味子醇甲标准品1、2、3mg，检测其有效成分含量，计算样品回收率。

脂质体的制备

采用薄膜分散法制备脂质体。

脂质体制备拟处方

通过预实验确定制备五味子木脂素脂质体拟处方如表1所示。

表1脂质体制备拟处方

2.5.2五味子木脂素常规脂质体制备

精密称取100mg五味子总提取物，加入15ml无水乙醇，超声5min溶解，放置于20ml离心管中，在1000rpm·min^-1的条件下进行离心5min，取上清液加入12mg胆固醇和60mg大豆卵磷脂，加入适量无水乙醇，超声溶解5min，在55℃水浴下旋转蒸发出去溶剂，在烧杯壁上形成一薄膜层，加入适量ph=7.0的磷酸盐缓冲液（水化，使薄膜完全溶解），水化后超声5min，得到脂质体混悬液，取出于4℃冰箱保存。

包封率测定方法的建立

2.6.1透析袋的预处理

将透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段，在大体积（500ml）的1mmol·l^-1的乙二胺四乙酸（edta）溶液和2%的nahco3溶液中煮沸20min，冷却至室温后用蒸馏水冲洗干净，再用1mmol·l^-1的乙二胺四乙酸（edta）煮沸10min，冷却后，存放于4冰箱，使用前需用蒸馏水冲洗干净。

包封率的测定

精密移取2ml脂质体至10ml容量瓶中，加入适量甲醇进行超声破乳后，定容至刻度线并摇匀，用0.22μm的滤膜进行过滤，按色谱条件进行含量测定，根据色谱图峰面积计算脂质体内包封药物量we，精密吸取1ml透析液，用0.22μm按色谱条件进样进行含量测定，依据色谱图峰面积计算未包封的游离药物量wo，按下列公式计算脂质体的包封率(entrapmentefficiency，ee%)。

式中we脂质体内包封的药物量wo未包封的游离药物量

2.7脂质体制备处方的单因素考察

对脂质体制备处方分别从胆固醇与卵磷脂的比例、五味子木脂素用量、成膜温度、磷酸缓冲溶液ph等因素进行考察，以脂质体的包封率为指标进行处方优化，同时进行均粒工艺，使脂质体粒径变小，能够更好的透过皮肤。

不同膜材比对包封率的影响

固定胆固醇用量，提高大豆卵磷脂用量，改变膜材比，根据表2制备脂质体，按色谱条件“2.1”进样，以大豆卵磷脂用量为横坐标，以包封率为纵坐标，绘制曲线。

表2不同膜材比对包封率的影响

2.7.2不同五味子提取物用量对包封率的影响

根据表3制备脂质体，按色谱条件“2.1”进样，以五味子提取物用量为横坐标，以包封率为纵坐标，绘制曲线。

表3不同五味子提取物用量对包封率的影响

2.7.3不同成膜温度对包封率的影响

根据表4制备脂质体，按色谱条件“2.1”进样，以成膜温度为横坐标，以包封率为纵坐标，绘制曲线。

表4不同成膜温度对包封率的影响

2.7.4不同磷酸缓冲溶液的ph对包封率的影响

根据表5制备脂质体，按色谱条件“2.1”进样，以磷酸缓冲溶液ph为横坐标，以包封率为纵坐标，绘制曲线。

表5不同磷酸缓冲溶液ph对包封率的影响

2.8正交试验筛选最优制备工艺

根据单因素实验的结果选取恰当的因素水平，用l9(3⁴)正交表，以包封率为考察指标，筛选最优处方。

结果测定与数据分析

3.1标准曲线的建立

经“2.1”项测得五味子混合标准品色谱峰如图1所示。

按“2.2”项配制标准品溶液，按“2.1”项进行含量测定，建立五味子醇甲的标准曲线，如图2所示。

由图2可知，用五味子醇甲为标准品测得其标准曲线，回归方程为y=2.3318x=7.99，r²=0.994（y为峰面积，x为五味子醇甲浓度），表明浓度在0.004~0.020mg·ml^-1范围内线性关系良好。

方法学考察结果

3.2.1精密度考察

在“2.1”项的条件下，吸取浓度为0.1mg·ml^-1对照品溶液，依法进样6次后测得五味子醇甲的峰面积均值为394.8，峰面积rsd值均小于0.5%，表面该仪器精密度良好。

稳定性考察

经测得五味子醇甲的峰面积均值为400.8，其rsd值为1.46%。该数据表面，对照品溶液在此方法下的稳定性良好，各个时间点的rsd值均符合要求。

重复性考察

经测得，所配置的五味子醇甲的浓度平均值为0.197mg·ml^-1、五味子醇乙的浓度平均值为0.199mg·ml^-1、五味子甲素的浓度平均值为0.196mg·ml^-1、五味子乙素的浓度平均值为0.198mg·ml^-1，相对标准偏差rsd值小于2%，重复性符合要求。

加样回收率考察

经测得加样回收率表6所示。

表6加样回收率

统计求得低、中、高，各浓度的回收率范围在96.80.48%~99.80.50%，相对标准偏差rsd值小于1%，该实验结果表明，所建立的分析方法准确度良好。

单因素考察

根据“2.6.2”测定脂质体的包封率，以包封率为考察指标，分别测定脂质体透析袋内和透析袋外的五味子醇甲含量，并以其包封率，脂质体的五味子木脂素含量色谱图如图3所示

3.3.1膜材比

单因素考察膜材比的结果如图4所示，根据图4所示，最高包封率的是膜材比为1:3制备的脂质体。因此本实验优化考察的胆固醇与卵磷脂比例为1:1、1:2、1:3。

五味子提取物用量

单因素考察五味子提取物用量的结果如图5所示。根据图5所示，包封率在五味子提取物用量为100mg之后无明显变化，而在100mg之前包封率较低，因此本实验优化考察的五味子提取物用量为100、120、140mg。

成膜温度

单因素考察成膜温度的结果如图6所示。根据图6所示，包封率在55℃以前变化较大，在55℃以后变化不明显，因此本实验优化考察的成膜温度为55、60、65℃。

磷酸缓冲溶液的ph

单因素考察磷酸缓冲溶液的ph的结果如图7所示。根据图7所示，ph为6.8时脂质体的包封率最高，因此本实验优化考察的磷酸缓冲溶液ph为6.6、6.8、7.0。

正交试验结果

根据单因素考察结果，筛选正交试验水平如表7所示，用l9(3⁴)正交实验表来筛选最优脂质体制备处方。

表7五味子木脂素脂质体因素水平表

根据表7的正交因素水平表设计正交试验表,如表8所示得到方差分析表如表9所示。

表8正交试验结果

表9方差分析表

由正交试验表，图3中的r值得，影响最大的因素为b、d，影响最小的因素为a，即可得：温度＞磷酸缓冲溶液的ph＞膜材比＞载药量。由表得知，在制备脂质体的时候，必须掌握温度和卵磷脂与表面活性剂比，温度和卵磷脂与表面活性剂比不可过高或过低，看k值得大小，当a2：膜材比为1:2；b3：温度为65°c；c1：载药量为100mg；d2：磷酸缓冲溶液的ph为6.8时，包封率最好。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。