本发明属于医疗领域，特别是涉及一种大叶蒟提取物及其制备方法与应用。
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：大叶蒟piperlaetispicumc.dc，为胡椒科胡椒属植物，主要分布在我国广东、广西、云南及海南省。民间用于活血、消肿、止痛，主治跌打损伤、淤血肿痛。抑郁症目前已成为妨碍人类健康的最主要疾病之一，全世界大概12%~25%的人在一生中会面临抑郁问题。作为一种全球常见病，目前估计有约3.5亿名患者在忍受抑郁症的痛苦，年龄层分布也从覆盖所有年龄段进入低龄化趋势。申请人经过多年系统研究，动物实验及临床实验发现大叶蒟有关提取物具有显著的抗抑郁活性，以及一定的抗焦虑、镇痛、镇静等生物活性，并且已经申请了两项与大叶蒟相关的中国发明专利及多项国际专利。目前对大叶蒟的研究主要有如下专利：zl03115911.7大叶蒟有效部位的制备及其在医疗、保健领域的应用，zl200410084791.7制备大叶蒟提取物的方法、提取物及其应用,zl201010556017.7大叶蒟有效组分的制备方法,zl201010169679.95’-甲氧基-3’，4’-次甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺在制备抗抑郁药物中的应用，201010296974.0大叶蒟提取物的制备方法、提取物及其应用，zl201110123076.x一种酰胺类化合物及其制备方法和应用。本领域技术人员都明白，对于天然药物有效部位提取物的制备工艺，使用的药材部位、制备工艺参数不同，所得到的提取物物质基础就不相同。例如：（一）、zl201010169679.9通过如下制备方法制得的是5’-甲氧基-3’，4’-次甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺，其公开的制备方法为：步骤一：取药材胡椒属植物大叶蒟或华南胡椒的地上部分，粗粉碎，置于提取罐中，加入10~15倍重量的70%~95%的乙醇，回流提取2小时，滤过，10~15倍重量的70%~95%的乙醇，回流提取2小时，滤过，合并两次滤液，65℃减压浓缩成rd1.3-1.35的浸膏；步骤二：浸膏用30%~60%的乙醇溶解，加入d101大孔吸附树脂的色谱柱中，用30%~60%的乙醇洗脱，洗脱液弃去，换用70%~95%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到提取物；步骤三：提取物经拌样，加入填装有硅胶的色谱柱中，分别用体积比为5：1和3：1石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，薄层法检测，合并3：1体系下样品量最大的单点成分，回收溶剂，浓缩至无液体，析出黄色颗粒，黄色颗粒经石油醚洗涤成白色颗粒，再经乙醇-水体系重结晶，得到5’-甲氧基-3’，4’-次甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺白色结晶。（二）、zl201110123076.x通过如下制备方法制得的是1-【（2e,4e,7e）-9-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰】四氢吡咯和1-【（2e,7e）-n-7-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰】四氢吡咯，其公开的制备方法为：步骤（1）、大叶蒟的上部分切成饮片，加入4~10倍药材量体积的70%~95%乙醇回流提取，煎煮1.5~3.5小时，滤过，药渣继续用3~8倍量乙醇煎煮1~3小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，60℃时浓缩至相对密度为1.30~1.38的浸膏；步骤（2）、浸膏用醇水溶液溶解后，过ab-8大孔吸附树脂柱，原药材与大孔树脂重量比为5：1~1:1，先用3~8倍量柱床体积的50%乙醇冲洗，然后用2~8倍量的70%~95%乙醇洗脱，洗脱液浓缩得浸膏，然后经硅胶柱分离，硅胶柱分离所用流动相为石油醚-乙酸乙酯6：1~1：2，得到混合物；步骤（3）、混合物经高效制备液相分离得到1-【（2e,4e,7e）-9-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰】四氢吡咯和1-【（2e,7e）-n-7-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰】四氢吡咯。（三）、zl03115911.7通过如下制备方法制得的提取物中包括5’-甲氧基-3’，4’-亚甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺、3’，4’-亚甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺、n-异丁基-9(3’,4’-亚甲基二氧苯基)-2e,8e-壬二烯酰胺、1-【（2e,4e）-2，4-癸二烯酰】四氢吡咯、n-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺、1-【（2e）-5-（3，4-亚甲基二氧苯基）】四氢吡咯、5’-甲氧基-3’，4’-亚甲基二氧桂皮酸四氢吡咯，其制备方法为：取大叶蒟的干燥地下部分打成粗粉，加60%乙醇溶液浸渍，水浴回流两次，每次约1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至原滤液体积的14%，并加30%乙醇得澄清不透明乙醇稀溶液。随后以大孔吸附树脂柱色谱法分离、精制，先后以40%、55%和80%乙醇溶液洗脱，收集80%乙醇洗脱液，浓缩干燥后得有效部位提取物，经hplc检测，该提取物中酰胺类生物碱含量为68%。（四）、zl200410084791.7通过如下制备方法制得的提取物中包括n-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺、1-【（2e,4e）-2，4-癸二烯酰基】吡咯烷、3’，4’-亚甲二氧基桂皮酸-异丁基酰胺、5’-甲氧基-3’，4’-亚甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺、胡椒酰胺c5：1（2e）、5’-甲氧基-3’，4’-亚甲基二氧桂皮酸-四氢吡咯、4，5-二氢荜拨明宁碱、胡椒酰胺等，其制备方法为：取大叶蒟的干燥根和根茎1kg切成段状，加入约90%乙醇常温下浸渍约48小时，然后加入同浓度乙醇至20l，进行渗漉得粗提物，渗漉液加入温水15l搅拌混匀，然后将稀释后的渗漉液上d101大孔吸附树脂柱，流穿后依次以40%、90%乙醇洗脱，收集90%乙醇洗脱的液体，经不超过70℃浓缩干燥得到精制的提取物。（五）、zl201010556017.7通过如下制备方法制得的提取物中包括【（2e,4e）-n-异丁基-9-（3，4-次甲二氧基苯）七碳二烯酰胺、【（2e,4e,7e）-n-异丁基-9-（3，4-次甲二氧基苯）九碳二烯酰胺、（2e,4e）-n-异丁基-9-苯基九碳二烯酰胺、大叶蒟素，其制备方法为：取大叶蒟地上部分，粗粉碎，加6倍量95%乙醇溶液，回流提取2小时，滤过，药渣用5倍量95%乙醇回流提取2小时，滤过，合并提取液，60℃减压浓缩至浓浸膏，即得大叶蒟总提物。取大叶蒟总提物用50%乙醇溶解至1倍生药量体积（先用1/295%溶解，不溶物再用1/2热水溶解，合并溶液即得），上d101大孔树脂柱，用70%乙醇溶液洗脱，流速1bv/h，收集洗脱液4bv，弃去。继续用95%乙醇洗脱，流速1bv/h，收集洗脱液4bv，浓缩至浓浸膏，得大叶蒟有效组分。而201010296974.0公开了取大叶蒟的根和藤茎打粗粉，加入约10倍药材的量的70%乙醇，常温下渗漉得粗提物溶液，然后将粗提物溶液于真空条件下浓缩至原体积的约25%，浓缩后的粗提取物溶液搅拌均匀后上非极性型大型吸附树脂柱进行分离纯化，依次以30%、80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱的液体，经浓缩干燥得到精制的提取物。但是，其并未公开提取物中含有哪些成分，也没有对提取物中的具体活性成分进行分离和鉴定，更没有测定活性成分的含量，实际上得到的是一些活性成分并不明确的提取物。而目前制备方法所获得的提取物的抗抑郁效果仍有待提高。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种活性成分明确且药效好、安全性高的大叶蒟提取物及其制备方法与应用。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：本发明的一个目的是提供一种大叶蒟提取物，其包括芝麻素、(2e,6e)-n-异丁基-7-（3，4-次甲二氧苯基）七碳二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺中的任意一种或一种以上的组合。进一步地，所述的大叶蒟提取物还包括3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺、5’-甲氧基-3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺、n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺中的任意一种或一种以上的组合。优选地，所述的大叶蒟提取物包括芝麻素、(2e,6e)-n-异丁基-7-（3，4-次甲二氧苯基）七碳二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺、3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺、5’-甲氧基-3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺和n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺。进一步地，所述的大叶蒟提取物中酰胺类生物碱的总质量含量为40%~85%。优选地，所述的大叶蒟提取物中酰胺类生物碱的总质量含量为50%~80%。进一步地，所述的大叶蒟提取物中所述的n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺的总质量含量为5%~30%。本发明的另一个目的是提供一种所述的大叶蒟提取物的制备方法。为了从大叶蒟中得到杂质含量低同时又尽可能保留有效成分的提取物，本发明申请人经反复研究，完成以下制备工艺。由于大叶蒟中的酰胺类生物碱化合物大多是低极性化合物，水提或者低浓度乙醇提取，生物碱类成分提取不完全，同时杂质含量高，因此经本申请人综合考虑及多次试验后采用体积浓度为80%~95%乙醇进行提取。提取方法包括煎煮、加热回流、浸渍、渗滤等常规提取方法，但是研究发现，大多数酰胺类生物碱类化合物对热不稳定，煎煮或者加热回流提取方法往往温度难以控制，影响提取效率，因此最好采用浸渍或者渗滤的提取方法进行提取。研究发现，在回收溶剂的过程中，受温度的影响，部分生物碱会受到破坏，某些生物碱成分析出后亦无法复溶，因此回收溶剂的温度与回收溶剂后提取液的体积与含醇量对本发明中提取物中所述生物碱成分及含量影响较大，对大孔树脂的吸附效果亦有较大影响，本发明申请人经反复研究发现，当提取液回收溶剂至含醇量为35%~45%，回收溶剂时温度不超过70℃时，所得有效部位生物碱种类最全，且总含量最高；吸附完毕后，先用低浓度乙醇溶液洗脱，目的是把被大孔树脂吸附的部分杂质洗脱下来，同时又要尽量保留有效成分，因此洗脱溶剂乙醇溶液浓度以不把生物碱类成分洗脱下来为上限，本发明申请人经研究发现依次用30%~50%、50%~70%的乙醇溶液洗脱最为合适，本发明中所述生物碱成分均得到充分保留，然后用80%~95%乙醇溶液解吸附，把生物碱类成分洗脱下来，收集洗脱液，洗脱液经减压浓缩，得到大叶蒟有效部位提取物，其中除了酰胺类生物碱成分外，还含有木脂素类成分芝麻素，同样，洗脱液浓缩时的温度也以不超过70℃为宜。因此，本发明提供一种所述的大叶蒟提取物的制备方法包括如下步骤：步骤（1）、将大叶蒟药材进行前处理后，加入10~30倍大叶蒟药材重量的体积浓度为80%~95%的乙醇进行浸渍或渗漉得粗提液；步骤（2）、将步骤（1）得到的粗提液浓缩至含醇量为35%~45%，并控制浓缩温度不超过70℃；步骤（3）、将经步骤（2）浓缩后的粗提液上大孔吸附树脂柱，依次用2~6倍大叶蒟药材重量的体积浓度为30%~50%、50%~70%的乙醇溶液进行洗脱，弃去洗脱液；步骤（4）、再用4~8倍大叶蒟药材重量的体积浓度为80%~95%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至褐色黏稠状浸膏，真空干燥并控制温度不超过70℃，得到所述的大叶蒟提取物。优选地，所述的大叶蒟提取物的制备方法包括如下步骤：步骤（1）、将大叶蒟药材进行切制或打粉后，加入19~21倍大叶蒟药材重量的体积浓度为90%~95%的乙醇进行浸渍或渗漉得粗提液；步骤（2）、将步骤（1）得到的粗提液浓缩至含醇量为35%~45%，并控制浓缩温度不超过70℃；步骤（3）、将经步骤（2）浓缩后的粗提液上d101大孔吸附树脂柱，依次用3~5倍大叶蒟药材重量的体积浓度为40~50%的乙醇溶液、2~3倍大叶蒟药材重量的体积浓度为60%~70%的乙醇溶液进行洗脱，弃去洗脱液；步骤（4）、再用5~7倍大叶蒟药材重量的体积浓度为90%~95%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至褐色黏稠状浸膏，真空干燥并控制温度不超过70℃，得到所述的大叶蒟提取物。最为优选地，所述的大叶蒟提取物的制备方法包括如下步骤：步骤（1）、将大叶蒟药材进行前处理后，加入20倍大叶蒟药材重量的体积浓度为95%的乙醇进行浸渍或渗漉得粗提液；步骤（2）、将步骤（1）得到的粗提液浓缩至含醇量为40%，并控制浓缩温度不超过70℃；步骤（3）、将经步骤（2）浓缩后的粗提液上d101大孔吸附树脂柱，依次用4倍大叶蒟药材重量的体积浓度为45%的乙醇溶液、2倍大叶蒟药材重量的体积浓度为65%的乙醇溶液进行洗脱，弃去洗脱液；步骤（4）、再用6倍大叶蒟药材重量的体积浓度为95%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至褐色黏稠状浸膏，真空干燥并控制温度不超过70℃，得到所述的大叶蒟提取物。进一步地，步骤（1）中所述的大叶蒟药材为选自大叶蒟的地上部分或地上部分及地下部分。本发明的第三个目的是提供一种所述的大叶蒟提取物作为活性成分在制备预防、缓解和治疗精神性疾病的药物或缓解精神性疾病的保健品中的应用。进一步地，所述的精神性疾病包括抑郁症、焦虑症等。本发明的第四个目的是提供一种用于预防、缓解和治疗精神性疾病的药物，其包括所述的大叶蒟提取物。本发明的第五个目的是提供一种用于缓解精神性疾病保健品，其包括所述的大叶蒟提取物。进一步地，所述的药物或保健品可以制备成药学上可接受的剂型。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明通过对制备方法的改进得到大叶蒟提取物，并对该提取物的化学成分进行分离和鉴定，得到了芝麻素、(2e,6e)-n-异丁基-7-（3，4-次甲二氧苯基）七碳二烯酰胺、n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺，5’-甲氧基-3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺，并进一步从大叶蒟中首次得到了化合物(2e,4e)-n-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺和化合物(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺，更进一步的首次得到了全新化合物(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺。本发明的制备方法所得到的大叶蒟提取物的抗抑郁效果明显且安全性好。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1取大叶蒟根及根茎，粗粉碎，加适量体积浓度为95%乙醇常温下浸渍24小时，然后补加体积浓度为95%乙醇至20倍量，进行渗漉提取，渗漉液减压浓缩至含醇量为40%，浓缩温度60℃，即得浓缩后的大叶蒟粗提液；浓缩后的粗提液上样于已经处理好的d101大孔吸附树脂，依次以4倍量体积浓度为40%的乙醇溶液，60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液弃去；继续用6倍量体积浓度为95%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至粘稠状，真空干燥，浓缩和干燥温度为60℃，即得大叶蒟提取物。将得到的提取物经反复硅胶柱层析、重结晶、中压快速制备及高效液相制备色谱等方法，得到9个单体化合物，依次编号为化合物c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9，经结构鉴定，除芝麻素外均为酰胺类生物碱。一、大叶蒟化学成分的结构鉴定：经结构鉴定，化合物c1-c9依次鉴定为5’-甲氧基-3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺（c1）、(2e,6e)-n-异丁基-7-（3，4-次甲二氧苯基）七碳二烯酰胺（风藤酰胺）（c2）、芝麻素（c3）、n-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺（墙草碱）（c4）、(2e,4e)-n-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺（c5）、(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺（c6）、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺（c7）、(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺（c8）、3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺（c9）。因为化合物数量较多，且多为已知化合物，结构鉴定较为简单，所以下列只选取几个具有代表性的化合物进行详细的结构鉴定解析。1、化合物c4的结构鉴定白色粉末，分子式：c14h25no，esi-msm/z：224[m+1]+，447[2m+1]+，表明分子量为223。uvλmeohmaxnm：2601hnmr(400mhz,cdcl3,δppm)：7.18(dd,j=15.0,10.0hz,1h,h-3),6.13(dd,j=15.4,9.8hz,1h,h-4)，6.06(m,1h,h-5),5.76(d,j=15.0hz,1h,h-2)，5.58(s,1h,-nh-)，3.15(dd,j=12.4,5.8hz,2h,h-1’),1.79(m,1h,h-2’),0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’,h-4’),2.14(dd,j=13.8,7.0hz,2h,h-6),1.41(m,2h,h-7),1.28(m,4h,h-8,h-9),0.89(t,j=6.9hz,3h,h-10)。13cnmr(101mhz,cdcl3,δppm)：166.40(c-1),143.12(c-3),141.24(c-5),128.22(c-4),121.80(c-2),46.93(c-1’),28.48(c-2’),20.11(c-3’,c-4’),32.89(c-6),31.35(c-8),28.63(c-7),22.45(c-9),13.97(c-10)。1hnmr(400mhz,cdcl3)数据中，低场区δ7.18(dd,j=15.0,10.0hz,1h,h-3)为3位烯键质子信号，因为与羰基共轭，处于较低场,j值为15.0hz，表明为反式双键；δ6.13(dd,j=15.4,9.8hz,1h,h-4)和6.06(m,1h,h-5)分别为4位和5位烯键质子信号，j值为15.4hz，表明为反式双键；δ5.76(d,j=15.0hz,1h,h-2)为2位烯键质子信号，以上数据推测这是一对反式共轭烯键；δ5.58(s,1h,-nh-)为酰胺的胺基信号；高场区中，δ3.15(dd,j=12.4,5.8hz,2h,h-1’),1.79(m,1h,h-2’)和0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’,h-4’)为异丁基胺信号；δ2.14(dd,j=13.8,7.0hz,2h,h-6)为与共轭烯键相连的亚甲基质子信号；δ1.41(m,2h,h-7)和1.28(m,4h,h-8,h-9)为3个亚甲基质子信号，δ0.89(t,j=6.9hz,3h,h-10)为甲基质子信号，可推断有-ch2ch3结构。13cnmr(101mhz,cdcl3)数据中，低场区δ166.40(c-1)为羰基信号；δ143.12(c-3),141.24(c-5),128.22(c-4),121.80(c-2)为共轭双键信号；高场区δ46.93(c-1’)为与酰胺的氮相连的碳信号,处于较低场，和28.48(c-2’)，20.11(c-3’,c-4’)构成异丁基胺的碳信号；δ32.89(c-6)为与共轭双键相连的碳信号；δ31.35(c-8),28.63(c-7),22.45(c-9)为3个亚甲基碳信号；13.97(c-10)为端基的甲基信号。根据以上分析，确定化合物c4为n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺，其结构式为：。2、化合物c5的结构鉴定淡黄色粉末，分子式：c16h29no，esi-msm/z：252[m+1]+，503[2m+1]+，表明分子量为251。uvλmeohmaxnm：2611hnmr(400mhz,cdcl3,δppm)：7.18(dd,j=14.9,9.9hz,1h,h-3),6.13(dd,j=13.9,8.6hz,1h)，6.05(dd,j=13.9,7.6hz,1h,h-5)，5.74(d,j=15.0hz,1h,h-2),5.46(s,1h,-nh-)，3.16(t,j=6.5hz,2h,h-1’),1.80(m,1h,h-2’),0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’,h-4’),2.14(dd,j=13.7,6.9hz,2h,h-6),1.42(dd,2h,h-7),1.28(d,j=2.9hz,8h,h-8,h-9,h-10,h-11),0.88(t,j=6.8hz,3h,h-12)。1hnmr(400mhz,cdcl3)数据中，低场区δ7.18(dd,j=14.9,9.9hz,1h,h-3)为3位烯键质子信号，因为与羰基共轭，处于较低场，j值为14.9hz，表明为反式双键；δ6.13(dd,j=13.9,8.6hz,1h)和6.05(dd,j=13.9,7.6hz,1h,h-5)分别为4位和5位烯键质子信号；δ5.74(d,j=15.0hz,1h,h-2)为2位烯键质子信号；5.46(s,1h,-nh-)为酰胺的胺基信号；高场区δ3.16(t,j=6.5hz,2h,h-1’),1.80(m,1h,h-2’)和0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’,h-4’)为异丁基胺信号；δ2.14(dd,j=13.7,6.9hz,2h,h-6)为与共轭烯键相连的亚甲基质子信号；δ1.42(dd,2h,h-7),1.28(d,j=2.9hz,8h,h-8,h-9,h-10,h-11)为亚甲基质子信号；0.88(t,j=6.8hz,3h,h-12)为甲基质子信号，可推断有-ch2ch3结构。化合物c5的波谱特征与化合物c4极其相似，再结合两者的分子量相差28，推测两者为同系物，化合物c5比c4多两个亚甲基。根据以上分析，确定化合物c5为(2e,4e)-n-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺，为首次从大叶蒟中获得，其结构式为：。3、化合物c7的结构鉴定白色粉末，c25h39no，ei-msm/z：370[m+1]+，739[2m+1]+，表明分子量为369。uvλmeohmaxnm：255。1hnmr(400mhz,cdcl3,δppm)：7.23(m,6h,ar-h,h-3),6.08(qd,j=15.2,8.2hz,2h,h-4,h-5)，5.75(d,j=15.0hz,1h,h-2),5.52(s,1h,-nh-),2.59(m,2h,h-15),1.60(dd,j=14.6,7.1hz,2h,h-14)，2.13(dd,j=13.7,6.9hz,2h,h-6),1.39(dd,j=13.6,6.9hz,2h,h-7),1.28(d,j=15.7hz,12h,h-8~h-13),3.16(t,j=6.4hz,2h,h-1”),1.80(dt,j=13.4,6.7hz,1h,h-2’’),0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’’,h-4’’)。13cnmr(101mhz,cdcl3,δppm)：166.38(c-1),143.04(c-1’),128.23(c-3’,c-5’)，128.21(c-2’,c-6’),125.54(c-4’),142.94(c-5),141.26(c-3),128.39(c-4),121.78(c-2),46.93(c-1’’),28.64(c-2’’),20.12(c-3’’,c-4’’),35.98(c-15),32.94(c-6),31.49(c-14),29.53(c-7),29.48~28.64(c-8~c-13)。1hnmr(400mhz,cdcl3)数据中，δ7.23(m,6h,ar-h,h-3)为单取代苯环信号和一个烯氢信号；δ6.08(qd,j=15.2,8.2hz,2h,h-4,h-5)为4位和5位烯键质子信号，j值为15.2hz，表明为反式双键；δ5.75(d,j=15.0hz,1h,h-2)为2位反式烯键质子信号；δ5.52(s,1h,-nh-)为酰胺的胺基信号；δ2.59(m,2h,h-15)为15位亚甲基信号，由于与苯环相连，所以处在较低场；δ1.60(dd,j=14.6,7.1hz,2h,h-14)为14位亚甲基信号；δ2.13(dd,j=13.7,6.9hz,2h,h-6)为与共轭烯键相连的亚甲基质子信号,处于较低场；δ1.39(dd,j=13.6,6.9hz,2h,h-7)为7位亚甲基信号；δ1.28(d,j=15.7hz,12h,h-8~h-13)为8至13位亚甲基信号；δ3.16(t,j=6.4hz,2h,h-1’’),1.80(dt,j=13.4,6.7hz,1h,h-2’’)和0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’’,h-4’’)为异丁基胺信号。13cnmr(101mhz,cdcl3)数据中，δ166.38(c-1)为羰基信号,δ143.04(c-1’),128.23(c-3’,c-5’),128.21(c-2’,c-6’),125.54(c-4’)为单取代苯环信号；δ142.94(c-5),141.26(c-3),128.39(c-4),121.78(c-2)为共轭双键信号；δ46.93(c-1’’),28.64(c-2’’),20.12(c-3’’,c-4’’)为异丁基胺信号；δ35.98(c-15)和32.94(c-6)分别为连接苯环和连接烯键的亚甲基信号；δ31.49(c-14)和29.53(c-7)分别为14位和7位亚甲基信号；δ29.48~28.64(c-8~c-13)为6个亚甲基信号。根据以上分析，确定该化合物为(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺，其结构式为：。5、化合物c6的结构鉴定白色针晶，c23h35no，esi-msm/z：342[m+1]+，683[2m+1]+，表明分子量为341。uvλmeohmaxnm：257ir：3305、2923、2851、1657、1629、1549、1465、1369、1255、1160、998、746、696cm-1。1hnmr(400mhz,cdcl3,δppm)：7.21(m,6h,ar-h,h-3),6.08(m,2h,h-4,h-5),5.74(d,j=15.0hz,1h,h-2),5.45(s,1h,-nh-),2.59(m,2h,h-15),1.61(m,2h,h-14),2.13(dd,j=13.7,6.9hz,2h,h-6),1.40(m,2h,h-7),1.29(d,j=7.0hz,8h,h-8~h-11),3.16(t,j=6.4hz,2h,h-1’’),1.79(dt,j=20.2,6.8hz,1h,h-2’’),0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’’,h-4’’)红外光谱中，3305cm-1、1657cm-1、1549cm-1、1255cm-1处出现强吸收表示分子中含有仲酰胺，其中3305cm-1为n-h伸缩振动峰，1657cm-1为c=o伸缩振动峰，1549cm-1为n-h面内弯曲振动、1255cm-1为c-n伸缩振动；2923cm-1、2851cm-1处强吸收峰是-ch2的不对称伸缩振动和对称伸缩振动引起的；1629cm-1处是c=c伸缩振动峰，说明分子中有双键；1465cm-1、1369cm-1处吸收峰是-ch3的不对称变形振动和对称弯曲振动引起的；1160cm-1是c-c骨架振动，说明分子中含有-c(ch3)2；998cm-1是=c-h的c-h面外弯曲振动，该处出峰说明分子中含有反式双键；746cm-1、696cm-1为单取代苯环的c-h面外弯曲振动。1hnmr(400mhz,cdcl3)数据中，δ7.21(m,6h,ar-h,h-3)为单取代苯环信号和一个烯氢信号；δ6.08(m,2h,h-4,h-5)为4位和5位烯键质子信号；δ5.74(d,j=15.0hz,1h,h-2)为2位反式烯键质子信号；δ5.45(s,1h,-nh-)为酰胺的胺基信号；δ2.59(m,2h,h-15)为15位亚甲基信号，由于与苯环相连，所以处在较低场；δ1.61(m,2h,h-14)为14位亚甲基信号；δ2.13(dd,j=13.7,6.9hz,2h,h-6)为与共轭烯键相连的亚甲基质子信号,处于较低场；δ1.40(m,2h,h-7)为7位亚甲基信号；δ1.29(d,j=7.0hz,8h,h-8~h-11)为8至11位亚甲基信号；δ3.16(t,j=6.4hz,2h,h-1’’),1.79(dt,j=20.2,6.8hz,1h,h-2’’)和0.92(d,j=6.7hz,6h,h-3’’,h-4’’)为异丁基胺信号。化合物c6的波谱特征与化合物c7极其相似（见表1），再结合两者的分子量相差28，推测两者为同系物，化合物c6比c7少两个亚甲基。根据以上分析，确定化合物c6为(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺。经检索文献，ca截至目前，未见报道该结构，确定该化合物为一个新化合物，其结构式为：。表1为化合物c7和化合物c61hnmr（400mhz，cdcl3）的光谱数据。表15、化合物c8的结构鉴定白色粉末，c24h43no，esi-msm/z：362[m+1]+，723[2m+1]+，表明分子量为361。uvλmeohmaxnm：260。1hnmr(400mhz,cdcl3,δppm)：7.20(m,1h,h-3)，6.12(m,1h,h-4),6.05(dd,j=14.9,6.4hz,1h,h-5)，5.75(d,j=15.0hz,1h,h-2)，5.51(s,1h,-nh-)，5.35(t,j=6.0hz,2h)，3.16(t,j=6.1hz,2h,h-1’),1.80(dt,j=13.1,6.5hz,1h,h-2’),0.93(m,6h,h-3’,h-4’)，2.14(d,j=6.6hz,2h,h-6)，2.02(s,4h),1.41(s,2h,h-7),1.27(s,16h),0.93(m,3h,h-20)。13cnmr(101mhz,cdcl3,δppm)：166.36(c-1),143.14(c-3),141.26(c-5),128.12(c-4),121.88(c-2),129.74，46.93(c-1’),28.81(c-2’),20.11(c-3’,c-4’),32.94(c-6),14.08(c-20)。1hnmr(400mhz,cdcl3)数据中，δ7.20(m,1h,h-3)为3位烯键质子信号，因为与羰基共轭，处于较低场，δ6.12(m,1h,h-4)和6.05(dd,j=14.9,6.4hz,1h,h-5)分别为4位和5位烯键质子信号，j值为14.9hz，表明为反式双键，δ5.75(d,j=15.0hz,1h，h-2)为2位烯键质子信号，j值为15.0hz，表明为反式双键，以上数据推测这是一对反式共轭烯键；δ5.51(s,1h,-nh-)为酰胺的胺基信号；δ5.35(t,j=6.0hz,2h)为烯键质子信号，j值为6.0hz，表明为顺式双键；低场区中没有苯环质子信号；在高场区中，δ3.16(t,j=6.1hz,2h，h-1’)，1.80(dt,j=13.1,6.5hz,1h,h-2’)和0.93(m,6h,h-3’,h-4’)为异丁基胺信号；δ2.14(d,j=6.6hz,2h,h-6)为与共轭烯键相连的亚甲基质子信号；δ2.02(s,4h)为烯键两端的亚甲基质子信号；δ1.41(s,2h,h-7)和1.27(s,16h)为9个亚甲基质子信号；δ0.93(m,3h,h-20)为甲基质子信号，可推断有-ch2ch3结构。13cnmr(101mhz,cdcl3)数据中，δ166.36(c-1)为羰基信号；δ143.14(c-3),141.26(c-5),128.12(c-4),121.88(c-2)为共轭双键信号；δ129.74为孤立双键信号；δ46.93(c-1’)为与酰胺的氮相连的碳信号,处于较低场，和δ28.81(c-2’),20.11(c-3’,c-4’)构成异丁基胺的碳信号；δ32.94(c-6)为与共轭双键相连的碳信号；δ31.88~28.90和δ22.33为9个亚甲基碳信号；δ27.19和26.91为孤立双键两端亚甲基碳信号；δ14.08(c-20)为端基的甲基信号。根据以上分析确定该化合物为(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺，此化合物为首次从大叶蒟中发现，其结构式为：。（二）、大叶蒟提取物中酰胺类生物碱含量测定方法研究（hplc含量测定方法）（1）、仪器、试剂、对照品仪器：agilent1100高效液相色谱仪，chemstationedition色谱工作站。试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、娃哈哈纯净水。对照品：前述分离得到的化合物单体通过重结晶、中压快速制备或者高效液相制备色谱等方法获得含量测定用的对照品。按本方法色谱条件，归一化测得纯度超过98%，符合相关要求。（2）、色谱条件agilent1100高效液相色谱仪，chemstationedition色谱工作站；色谱柱：bischoffprontosil120-5-c18-sh；流动相：甲醇-乙腈-水；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测器：dad检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl；梯度洗脱程序见表2。表2time（min）甲醇（%）乙腈（%）水(%)010090305050035505004510090（3）、样品溶液制备取大叶蒟提取物40mg，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇至近刻度，将容量瓶置超声波清洗仪超声处理使溶解，取出放凉后加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得，置深色容器中。(4)、测定方法分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积测定，利用外标法进行含量计算，即得。经检测，提取物生物碱总含量为70.15%。实施例2取大叶蒟根及根茎，粗粉碎，加适量体积浓度为95%乙醇常温下浸渍24小时，然后补加体积浓度为95%乙醇至20倍量，进行渗漉提取，渗漉液减压浓缩至含醇量为40%，浓缩温度60℃，即得大叶蒟粗提液；粗提液上样于已经处理好的d101大孔吸附树脂，依次以4倍量体积浓度为45%的乙醇溶液、2倍量体积浓度为65%乙醇溶液洗脱，洗脱液弃去；继续用6倍量体积浓度为95%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至粘稠状，真空干燥，浓缩和干燥温度60℃，即得提取物。提取物得膏率为1.21%，经hplc检测，提取物中包括芝麻素、(2e,6e)-n-异丁基-7-（3，4-次甲二氧苯基）七碳二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺、3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺和n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺。经hplc检测，n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺含量为18.32%，生物碱总含量为75.39%。对比例1取大叶蒟根及根茎，粗粉碎，加适量体积浓度为50%乙醇常温下浸渍24小时，然后补加体积浓度为50%乙醇至20倍量，进行渗漉提取，渗漉液减压浓缩含醇量为30%，浓缩温度60℃，即得大叶蒟粗提液；粗提液上样于已经处理好的d101大孔吸附树脂，以4倍量体积浓度为30%乙醇溶液洗脱，洗脱液弃去；继续用6倍量体积浓度为70%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至粘稠状，真空干燥，浓缩和干燥温度60℃，即得提取物。提取物得膏率为1.26%，经hplc检测，生物碱总含量为25.81%，提取物中不含有(2e,4e)-n-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺。对比例2取大叶蒟根及根茎，粗粉碎，加适量体积浓度为70%乙醇常温下浸渍24小时，然后补加体积浓度为70%乙醇至20倍量，进行渗漉提取，渗漉液减压浓缩至含醇量为30%，浓缩温度60℃，即得大叶蒟粗提液；粗提液上样于已经处理好的d101大孔吸附树脂，以4倍量体积浓度为40%乙醇溶液洗脱，洗脱液弃去；继续用6倍量体积浓度为85%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至粘稠状，真空干燥，浓缩和干燥温度60℃，即得提取物。提取物的膏率为1.33%，经检测，生物碱总含量为43.01%，提取物中不含有(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺。对比例3（zl200410084791.7）取大叶蒟根及根茎，切成段状，加入约80%乙醇常温下浸渍24小时，然后加入同浓度乙醇至药材量15倍，进行渗漉得粗提物，渗漉液缓慢加入约等量的60℃温水搅拌混匀，然后将稀释后渗漉液上d101大孔吸附树脂柱，流穿后分别以50%、85%乙醇洗脱，收集85%的乙醇洗脱的液体，经不超过70℃浓缩干燥得到精制的提取物。提取物的膏率1.96%，n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺含量为4.8%，生物碱总含量为43.20%对比例4（pct/cn2005/002034）取大叶蒟的干燥根和根茎1kg切成段状，加入约90%乙醇常温下浸渍约48小时，然后加入同浓度乙醇至20l，进行渗漉得粗提物，渗漉液加入温水15l搅拌混匀，然后将稀释后的渗漉液上d101大孔吸附树脂柱，流穿后依次以40%、90%乙醇洗脱，收集90%乙醇洗脱的液体，经不超过70℃浓缩干燥得到精制的提取物。提取物得膏率为1.94%，经hplc检测，n-异丁基癸-反-2-反4-二烯酰胺含量为5.2%，生物碱总含量为44.10%对比例5（201010296974.0）取大叶蒟的根和藤茎打粗粉，加入约10倍药材的量的70%乙醇，常温下渗漉得粗提物溶液，然后将粗提物溶液于真空条件下浓缩至原体积的约25%，浓缩后的粗提取物溶液搅拌均匀后上非极性型大型吸附树脂柱进行分离纯化，依次以30%、80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱的液体，经浓缩干燥得到精制的提取物。提取物得膏率为2.72%，经hplc检测,生物碱总含量为33.19%,提取物中不含有(2e,4e)-n-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e)-n-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、(2e,4e,14z)-n-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺。对实施例2，对比例1至5的大叶蒟提取物进行以下试验：1.小鼠尾悬挂试验昆明种小白鼠（雄性，18-20g），随机分成14组，每组10只，各组按表3所示给予相应剂量的提取物，并以生理盐水对照，阳性对照组为文拉法辛。每日一次，连续给药14天。最后一次口服给药1h后进行小鼠尾悬挂试验，将小鼠尾巴用胶布粘在高出桌面50cm的木条上，使其呈倒立状态，四周以板隔离小鼠视线。小鼠为了克服不正常体位而挣扎活动，但活动一段时间后出现不动，显示绝望状态。持续时间6分钟，记录6分钟内静止不动时间。表3小鼠尾悬挂试验结果(n=10,±sd)由表3的结果可见，小鼠口服给予20、10、5和2.5mg/kg/d的本发明提取物（实施例2提取物）两周后，明显缩短了小鼠静止不动的时间，与空白对照组相比，p值均小于0.05，10mg/kg/d时，p值小于0.01，2.5mg/kg/d的本发明提取物即显示了良好的抗抑郁作用。对比发现，剂量为5mg/kg/d的剂量时，本发明提取物生物活性与对比例4提取物20mg/kg/d时活性相当，说明本发明大叶蒟提取物的生物活性明显高于对比例4大叶蒟提取物，也优于其它现有技术所得到的大叶蒟提取物。2.小鼠游泳试验昆明种小白鼠（雄性，18-20g），随机分成12组，每组10只，各组按表4所示给予相应剂量的提取物，并以生理盐水对照，阳性对照组为文拉法辛。每日一次，连续给药14天。最后一次口服给药后1小时，将小鼠置于10x20cm、水深10cm的玻璃缸内（水温25℃）进行游泳试验，游泳持续时间为6min，记录后4min内停止不动的时间。表4小鼠游泳试验结果（(n=10,±sd）由表4的结果可见，小鼠口服给予10、5、2.5mg/kg/d的本发明提取物（实施例2提取物）两周后，明显缩短了小鼠停止不动的时间，与空白对照组相比，p值均小于0.05，2.5mg/kg/d的本发明提取物即显示了良好的抗抑郁作用。对比发现，剂量为2.5mg/kg/d的剂量时，对比例4提取物活性与空白对照比较，没有显著性差异，而本发明提取物生物活性与对比例4提取物10.0mg/kg/d时的生物活性相当，说明本发明大叶蒟提取物的生物活性明显高于对比例4大叶蒟提取物，也优于其它现有技术所得到的大叶蒟提取物。3.大鼠获得性无助试验选用wistar大鼠，随机分组，每组10只。采用获得性无助试验（learnedhelplessness）模型，按表5所示经口灌胃给药，给予相应剂量的提取物，阳性对照为文拉法辛，每日一次，连续给药7天，最后一次给药后24h，进行条件回避试验。表5大鼠获得性无助试验结果（(u检验：n=300,±sd）获得性无助模型是一种有效的抑郁症动物模型。表5显示，模型组动物的平均逃避潜伏期明显长于空白对照组（p<0.01），动物显示了明显的绝望状态，体现了造模的成功性，阳性对照药文拉法辛和本发明提取物（实施例2提取物）10、5、2.5mg/kg/d的剂量均明显缩短了大鼠逃避的潜伏期，与模型组相比，p<0.01，显示了良好的抗抑郁作用。对比发现，剂量为2.5mg/mg/d时，对比例4提取物没有明显缩短大鼠逃避的潜伏期，说明本发明提取物抗抑郁活性优于对比例4提取物的抗抑郁活性。4.小鼠明暗箱试验小鼠随机分组，每组10只，按表6所示分别给予相应剂量的提取物，并以生理盐水作对照，阳性对照药为地西泮。各组小组灌胃给药后60min开始明暗箱试验。每只小鼠试验5min，记录小鼠在明暗箱中停留时间和穿梭次数。表6小鼠明暗箱试验结果(n=10,±sd）表6显示，与空白组相比，剂量为10mg/kg时，本发明提取物能显著提高小鼠进入明箱活动次数和活动时间，剂量为10mg/kg时，p<0.05，剂量为20mg/kg时，p<0.01，说明本发明提取物具有抗焦虑作用。同时，对比发现，本发明提取物抗焦虑作用优于对比例提取物。5.大叶蒟提取物安全性评价-小鼠急性毒性试验将昆明种小白鼠（雌雄各半，体重18-22g），随机分组，每组10只，雌雄各半。所有小鼠禁食（不禁水）4小时后，各组按预实验结果的剂量经口灌胃给药，给药容量为：0.2ml/10g。随后观察小鼠给药后的反应，记录死亡情况，并于每日观察一次，连续14天。14天观察期结束后，存活动物称重后解剖，观察脏器有否异常。经dastm统计软件bliss法计算，小鼠急性毒性试验结果如表7。表7小鼠急性毒性试验结果提取物ld50（mg/kg）实施例2提取物986.34对比例4提取物560.05对比例3提取物525.24对比例1提取物480.13对比例2提取物476.54对比例5提取物462.13从表7可以看出，本发明所述大叶蒟提取物（实施例2提取物）的ld50数值高于对比例提取物，说明本发明所述提物安全性显著高于对比例4、对比例3所述提取物，也高于其它现有技术所得到的提取物。以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12