一种负载抗菌分子的双层抗菌敷料、制备及应用

1.本发明涉及生物医用材料制备技术领域。更具体地，涉及一种负载抗菌分子的双层抗菌敷料、制备及应用。


背景技术：

2.烧伤是目前所有疾病中痛苦最大、治疗难度最高的疾病之一。目前的烧伤治疗多采用现代医学科技手段与药物配合的方式，但其仍是以牺牲皮肤换取生命的方法能使大面积烧伤的部分患者存活。虽然，研究人员进行了活性表皮修复组织的开发，但在应用方面仍然处于初级阶段。
3.脱细胞基质是一种由动物或人类皮肤制成的无细胞组织薄片，它保留了真皮的胶原成分和组织基本结构，同时也保留了基底膜成分，是目前最为理想的细胞微环境，已成为仿生型再生医疗产品开发和成果转化热点，并在创伤和烧伤修复、口腔医学、组织缺损等领域得以应用。但是目前现有技术仍存在如下问题：(1)烧伤伤口常伴有过量渗出液，由于其中包含有大量有利于细菌生长的有机物质，从而导致伤口具有大量的细菌生物膜产生率，加剧伤口愈合的难度，而目前鱼皮明胶几乎没有抑菌作用。(2)脱细胞鱼皮基质三维结构较为松散，很难起到与外部环境隔离作用，容易导致伤口感染。
4.因此，急需开发一种具有抑菌作用，隔离作用，结构规整，可工业化生产的新型抗菌敷料，有效促进烧伤伤口愈合。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种负载抗菌分子的双层抗菌敷料，该双层抗菌敷料兼具抗菌、生物安全性高、创面修复能力强、隔离效果好、结构规整等优点。
6.本发明的第二个目的在于提供一种制备如上双层抗菌敷料的制备方法，本方法操作简单，原料廉价易得，可实现工业化生产。
7.本发明的第三个目的在于提供一种包含如上双层抗菌敷料的应用。
8.为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
9.本发明提供一种负载抗菌分子的双层抗菌敷料，所述双层抗菌敷料包括：负载抗菌分子的鱼皮明胶纳米纤维层和脱细胞鱼皮基质层；其中，鱼皮明胶纳米纤维层厚度为 0.05-2mm，鱼皮明胶纳米纤维直径为100-600nm，脱细胞鱼皮基质层厚度为0.01-1mm。
10.本发明提供一种具有双层结构的抗菌敷料，其外层为负载抗菌分子的鱼皮明胶纳米纤维层，内层为脱细胞鱼皮基质层，从结构和组分上看，外层的鱼皮明胶纳米纤维层可以为内层脱细胞鱼皮基质层提供阻隔作用，减少外部环境的影响，有效保护脱细胞鱼皮基质层，使之更好地发挥修复组织作用，并且抗菌肽的添加能进一步提高双层敷料的抗菌活性；内层的脱细胞鱼皮具有与猪、牛皮类似的仿生结构，还含有更为丰富的脂肪和ω-3脂肪酸，可显著促进创面区域新生血管的生成，对于创伤修复尤其是难愈性创面的修复具有明显促进作用，更有效诱导创面修复，并且脱细胞鱼皮基质免疫原性低，临床使用安全性好，其人
畜共患病毒传播风险远低于陆地哺乳动物来源的猪、牛皮，不会引起机体自身免疫反应。
11.进一步，所述负载抗菌分子的鱼皮明胶纳米纤维层通过静电纺丝技术形成于脱细胞鱼皮基质层上。
12.进一步，所述抗菌分子包含抗菌肽。
13.进一步，所述抗菌肽包括但不限于昆虫抗菌肽，哺乳动物抗菌肽，两栖动物抗菌肽，鱼类抗菌肽，软体动物抗菌肽，甲壳类动物抗菌肽，植物抗菌肽或细菌抗菌肽中的一种或多种。
14.抗菌肽具有耐碱性强、热稳定性好以及广谱抗菌等特点，它的引入主要是为了提高双层抗菌敷料的抗菌活性，防止在创口修复过程中，受到外界细菌的侵入影响创口修复效果，同时也能抑制创口的细菌滋生，在本发明的具体实施方式中提及的牛乳铁蛋白抗菌肽或β
‑ꢀ
防御素为一类哺乳动物抗菌肽。
15.为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：
16.本发明提供一种制备如上双层抗菌敷料的制备方法，包括如下步骤：
17.将鱼皮酶解明胶溶于水，然后与抗菌分子配制成静电纺丝前驱液，然后通过静电纺丝技术在脱细胞鱼皮基质层上静电纺丝形成鱼皮明胶纳米纤维层，经热压贴合、交联、干燥后得到双层抗菌敷料。
18.在本发明中，通过静电纺丝技术的过程参数控制，使得鱼皮明胶纳米纤维层均匀覆盖在脱细胞鱼皮基质层上，从而得到结构规整的双层抗菌敷料，并且可根据具体应用需要裁减成规则的几何图形，如长方形，其规格可根据创面大小进行改变，例如：5cm
×
5cm， 5cm
×
10cm或10cm
×
10cm。外层鱼皮明胶纳米纤维不仅对外部细菌、微尘起到良好的阻隔作用，有效保护鱼皮基质层，发挥修复组织的效果；而且由纳米纤维所组成的外层，具有良好且快速的吸液性能，可及时迅速的将伤口的积液排出；另外抗菌肽的添加，可促使纳米纤维在降解过程中起到持久高效抗菌的作用。
19.在本技术中将热压贴合置于静电纺丝之后是为了将脱细胞鱼皮基质与鱼皮明胶纳米纤维层更好的复合在一起，其交联是为了实现双层抗菌敷料的可控降解、持续抗菌。
20.本发明使用的术语鱼皮酶解明胶是指一种将鱼皮明胶通过酶解方法制备得到的鱼皮酶解明胶，其中酶解方法可以采用现有成熟技术进行。
21.进一步，鱼皮酶解明胶在水中的浓度为5～15％；所述静电纺丝前驱液中，抗菌分子的浓度为0.5～1％；所述配制静电纺丝前驱液的温度为45～60℃。在本发明的具体实施方式中，作为优选，所述鱼皮酶解明胶的浓度为10％；所述配制静电纺丝前驱液的温度为 50℃。
22.进一步，所述静电纺丝的电压为15～25kv，所述静电纺丝的注射器针头的喷射距离为7-25cm。
23.进一步，所述热压贴合温度为40～60℃；所述热压贴合时间为0.1～30s。
24.进一步，所述交联选用的交联剂包括但不限于戊二醛、京尼平、甲醛、环氧氯丙烷、三偏磷酸钠中的一种或多种。
25.进一步，所述交联剂的浓度为1～5％。
26.进一步，所述交联时间为24～48h。
27.进一步，所述制备方法中在干燥结束后还包括灭菌。
28.进一步，所述灭菌选用高压蒸汽灭菌、co60灭菌、电子束辐照灭菌或环氧乙烷灭菌中的一种。
29.进一步，所述灭菌选用电子束辐照灭菌。
30.进一步，所述电子束辐照灭菌的辐照剂量为10～20kgy，辐照时间为0.1～7s。
31.脱细胞鱼皮基质层的制备可以参照现有技术中的方法进行制备，目的将外购鱼皮经脱脂、脱细胞处理后，以制备出三维结构的完整脱细胞鱼皮基质，本发明提供了一种制备脱细胞鱼皮基质层的方法：
32.取新鲜鱼皮去鳞、鱼肉、内侧筋膜，用饱和氯化钠水溶液浸泡，酸处理后用碱液清洗，之后在-60℃下反复冻融，取出后用表面活性剂进行脱细胞，碱液洗涤，冷冻干燥后得脱细胞鱼皮基质层。
33.进一步，所述酸处理选用的酸液包括但不限于醋酸溶液，柠檬酸溶液，磷酸溶液或甲酸溶液中的一种或多种，其酸液浓度为1～3％。
34.进一步，所述碱液包括但不限于氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙或氨水中的一种或多种；其碱液的浓度为3～5％。
35.在本发明的具体实施方式中，所述酸液的浓度为2％；所述碱液的浓度为4％。
36.进一步，所述表面活性剂包括但不限于十二烷基磺酸钠、吐温80、脱氧胆酸钠或tritonx-100中的一种或多种。其中，所述表面活性剂的浓度为0.3～0.5％。
37.为达到上述第三个目的，本发明采用下述技术方案：
38.本发明提供一种如上双层抗菌敷料或采用如上制备方法制备的双层抗菌敷料在制备促烧伤伤口愈合的产品中的应用。
39.本发明的有益效果如下：
40.本发明提供一种负载抗菌分子的双层抗菌敷料、制备及应用。该双层抗菌敷料包括：负载抗菌分子的鱼皮明胶纳米纤维层和脱细胞鱼皮基质层，其中，鱼皮明胶纳米纤维层厚度为0.05-2mm，鱼皮明胶纳米纤维直径为100-600nm，脱细胞鱼皮基质层厚度为0.01-1mm。从结构和组分上看，一方面，脱细胞鱼皮具有与猪、牛皮类似的仿生结构，还含有更为丰富的脂肪和ω-3脂肪酸，可显著促进创面区域新生血管的生成，对于创伤修复尤其是难愈性创面的修复具有明显促进作用，更有效诱导创面修复，并且脱细胞鱼皮基质免疫原性低，临床使用安全性好，其人畜共患病毒传播风险远低于陆地哺乳动物来源的猪、牛皮，不会引起机体自身免疫反应，另一方面与包含抗菌肽的鱼皮明胶纳米纤维层结合后，外层的鱼皮明胶纳米纤维层可以为内层脱细胞鱼皮基质层提供阻隔作用，减少外部环境的影响，有效保护脱细胞鱼皮基质层，使之更好地发挥修复组织作用，并且抗菌肽的添加能进一步提高双层敷料的抗菌活性，有望广泛应用于烧伤伤口愈合领域中。
附图说明
41.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
42.图1示出本发明实施例1所制备双层敷料的实物照片。
43.图2示出本发明实施例1所制备双层敷料中脱细胞鱼皮基质层的扫描电镜图照片。
44.图3示出本发明实施例1所制备双层敷料中负载抗菌分子的鱼皮明胶纳米纤维层的扫描电镜图照片。
45.图4示出本发明实施例1所制备双层敷料横截面扫描电镜图。
46.图5示出了实施例1、实施例2和对比例1所制备样品的细胞存活率统计图。
具体实施方式
47.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
48.实施例1
49.(1)取新鲜鱼皮去除鳞、鱼肉、内侧筋膜，用饱和氯化钠水溶液浸泡揉搓之后反复冲洗，随后用超纯水反复清洗，沥干水分；
50.(2)用2％甲酸溶液次对步骤(1)所述鱼皮浸泡进行脱脂、去杂蛋白处理，用4％氢氧化钠溶液清洗，接着用超纯水反复清洗，沥干水分；
51.(3)将步骤(2)所得的鱼皮在-80℃下冻融数次，然后采用0.4％的十二烷基磺酸钠溶液进行脱细胞处理，接着用超纯水反复清洗，沥干水分；
52.(4)将步骤(3)所述的鱼皮用夹具固定后在-20℃冷冻干燥，得到三维结构的完整，且外观平整的脱细胞鱼皮基质。
53.(5)将鱼皮酶解明胶加入超纯水中，在50℃下配制成10％鱼皮明胶水溶液；
54.(6)将0.8％的β-防御素加入步骤(5)所述的鱼皮明胶水溶液中，超声溶解配制成静电纺丝前驱液；
55.(7)将步骤(4)所述的鱼皮基质固定在螺旋静电纺丝设备的接收器上，纺丝槽加入步骤(6)所述的纺丝前驱液，在20kv电压下纺丝，得到一层脱细胞鱼皮基质，一层为鱼皮明胶纳米纤维层的双层抗菌敷料前体，然后裁剪成5cm
×
5cm规格；
56.(8)将步骤(7)所述的双层抗菌敷料前体在50℃下热压贴合；
57.(9)将步骤(8)所述的材料用1％戊二醛溶液交联24小时，然后放置35℃鼓风干燥箱中干燥48h；
58.(10)将步骤(9)所述的材料用电子束辐照灭菌，辐照剂量为10kgy，真空包装后最终得双层抗菌敷料。
59.实施例2
60.(1)取新鲜鱼皮去除鳞、鱼肉、内侧筋膜，用饱和氯化钠水溶液浸泡揉搓之后反复冲洗，随后用超纯水反复清洗，沥干水分；
61.(2)用2％甲酸溶液次对步骤(1)所述鱼皮浸泡进行脱脂、去杂蛋白处理，用4％氢氧化钠溶液清洗，接着用超纯水反复清洗，沥干水分；
62.(3)将步骤(2)所得的鱼皮在-80℃下冻融数次，然后采用0.4％的十二烷基磺酸钠溶液进行脱细胞处理，接着用超纯水反复清洗，沥干水分；
63.(4)将步骤(3)所述的鱼皮用夹具固定后在-20℃冷冻干燥，得到三维结构的完整，且外观平整的脱细胞鱼皮基质。
64.(5)将鱼皮酶解明胶加入超纯水中，在50℃下配制成10％鱼皮明胶水溶液；
65.(6)将0.8％的牛乳铁蛋白抗菌肽加入步骤(5)所述的鱼皮明胶水溶液中，超声溶解配制成明胶静电纺丝前驱液；
66.(7)将步骤(4)所述的鱼皮基质固定在螺旋静电纺丝设备的接收器上，纺丝槽加入步骤(6)所述的纺丝前驱液，在20kv电压下纺丝，得到一层脱细胞鱼皮基质，一层为鱼皮明胶纳米纤维层的双层抗菌敷料前体，然后裁剪成5cm
×
5cm规格；
67.(8)将步骤(7)所述的双层抗菌敷料前体在50℃下热压贴合；
68.(9)将步骤(8)所述的材料用1％戊二醛溶液交联24小时，然后放置35℃鼓风干燥箱中干燥48h；
69.(10)将步骤(9)所述的材料用电子束辐照灭菌，辐照剂量为10kgy，真空包装；
70.对比例1
71.(1)取新鲜鱼皮去除鳞、鱼肉、内侧筋膜，用饱和氯化钠水溶液浸泡揉搓之后反复冲洗，随后用超纯水反复清洗，沥干水分；
72.(2)用2％甲酸溶液次对步骤(1)所述鱼皮浸泡进行脱脂、去杂蛋白处理，用4％氢氧化钠溶液清洗，接着用超纯水反复清洗，沥干水分；
73.(3)将步骤(2)所得的鱼皮在-80℃下冻融数次，然后采用0.4％的十二烷基磺酸钠溶液进行脱细胞处理，接着用超纯水反复清洗，沥干水分；
74.(4)将步骤(3)所述的鱼皮用夹具固定后在-20℃冷冻干燥，得到三维结构的完整，且外观平整的脱细胞鱼皮基质，然后裁剪成5cm
×
5cm规格；
75.(6)将步骤(5)所述的材料用1％戊二醛溶液交联24小时，然后放置35℃鼓风干燥箱中干燥48h；
76.(7)将步骤(6)所述的材料用电子束辐照灭菌，辐照剂量为10kgy，真空包装；
77.实验例1
78.本实验例为抑菌实验测试，测试方法如下：将e.coli和s.aureus无菌接种在胰酶大豆培养基中，在37℃的摇床中培养16h。各取80μm接种液加入4ml胰酶大豆培养基中继续培养2-4h。然后通过梯度分散法得到106cfu/ml的pbs细菌悬液，然后取实施例1、实施例2、对比例1所制备的样品加入上述配制的pbs细菌悬液中，浓度为0.4cm2/ml， 37℃下反应1h。然后，取各10μl溶液，在无菌pbs中稀释104倍。随后取稀释后的pbs 悬液100μl，扩散到琼脂平板上，然后在37℃将所有琼脂板孵育16h，最后统计形成的合适菌落的数量，每组进行3个平行实验，取平均值，测试结果见下表1。从表1中可以看出，实施例1和实施例2制备的样品对e.coli和s.aureus具有极好的抑菌性能。
79.表1实施例1、实施例2和对比例1的抑菌实验测试数据对比表
[0080][0081]
实验例2
[0082]
本实验例为细胞毒性实验测试，测试方法如下：按照国标gb/t 16886.12-2005标准制备浸提液，分别将实施例1、实施例2和对比例1所制备的样品加入细胞培养基中，浸提比为3cm2/ml，然后在37℃培养箱培养24h，得到的浸提液在4℃下冷藏备用，然后将浸提液
加入96孔板中，每孔接种2000个细胞，每孔添加10％fbs，在37℃下在5％co2中培养7天，未添加浸提液的孔板区域作为对照组，利用incucyte
tm
zoom系统实时观察提取液对人胚肺成纤维细胞(mrc-5)的影响，测试结果如图5所示。从图5可以看出，对比例1和实施例1实施例2所制备的样品的细胞相对存活率与对照组相当，表明所制备样品没有细胞毒性。
[0083]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。