一种用于感染成像及抗菌的碳点-铁血红素复合材料及其制备方法

1.本发明属于纳米生物医药材料技术领域，具体涉及到一种碳点-铁血红素 复合材料及其制备方法。


背景技术：

2.由于抗生素的滥而导致耐药细菌的产生及蔓延，逐渐演变成为了一个威胁 公共健康安全的重大问题。因此，亟需开发新型材料来应对日益严峻的细菌耐 药性问题。目前研究者们基于纳米金属、壳聚糖、季铵化合物和抗菌肽等开发 了一系列抗菌材料，在对抗耐药性细菌方面展现出独特优势。然而受到缺乏靶 向抗菌设计，毒副作用高；缺少可视化成像手段指导等问题的制约，发展兼具 特异性成像及抗菌性能的智能材料意义重大。
3.碳点作为一种新型零维碳纳米材料，具有可控的光学性能、良好的生物相 容性、制备简便、易于表面修饰等特性。此外，碳点独特的光热、光敏等功能， 拓展了其在生物医学领域的应用空间。目前已有一些工作针对碳点的本征抗 菌、光热/光动力抗菌性能进行了研究，验证了其作为抗菌制剂的应用价值。
4.铁血红素是一种含铁的卟啉化合物，具有较高的催化活性，可以催化双氧 水产生大量的氧气，激活鲁米诺及其衍生物发挥自发光成像功能。同时，可作 为氧气供体提高光敏剂产生活性氧的效率。目前，尚缺乏对铁血红素在感染成 像及抗菌领域中应用的研究。
5.基于碳点与铁血红素的特性，充分发挥碳点作为多功能偶联中心的优势， 构建生物相容性良好，具有本征和增强光动力协同杀菌效果，并兼具靶向成像 的碳点-铁血红素复合材料体系，有望实现针对细菌感染部位成像及其指导下 的高效、广谱抗菌，并减少细菌耐药性的产生。


技术实现要素：

6.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较 佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或 省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略 不能用于限制本发明的范围。
7.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
8.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种碳点-铁血红 素复合材料的制备方法。
9.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
10.将谷胱甘肽、富含氨基的聚合物与酰胺类化合物进行溶剂热反应，反应结 束后纯化制得碳点；
11.将铁血红素溶于酰胺类化合物中，再和偶联剂、催化剂混合均匀，活化后 加入碳点在缓冲液中继续反应，纯化制得碳点-铁血红素复合材料。
12.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述氨基类化合物包括聚乙烯亚 胺、氨基聚乙二醇和聚丙烯酰胺中的一种或多种；所述酰胺类化合物包括甲酰 胺、乙酰胺、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺中的一种或多种；所述 铁血红素包括氯化血红素和羟高铁血红素中的一种。
13.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述偶联剂4-(4,6-二甲氧基-1,3,5
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三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物、n,n-羰基二咪唑，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺中的一种或多种；所述催化剂为4-二甲基氨基吡啶和n-羟基琥珀酰 亚胺中的一种或多种；所述缓冲溶液为n,n-二甲基甲酰胺、去离子水、二甲 基亚砜、甲醇、碳酸盐缓冲液中的一种或多种。
14.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述谷胱甘肽与富含氨基的聚合 物的摩尔比为5:1～5，所述谷胱甘肽和富含氨基的聚合物的总质量与酰胺类化 合物的质量比为1:10～50。
15.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述铁血红素和碳点质量比是 1:1～100；所述铁血红素和偶联剂、催化剂的摩尔比是1:1～10。
16.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述溶剂热反应温度为 150～300℃，反应时间为2～6h。
17.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述纯化制得碳点，其中纯化为 以去离子水为透析液，2000-5000da的水性透析袋透析5-10天，冷冻干燥。
18.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述纯化制得碳点-铁血红素复 合材料，其中纯化为以缓冲溶液和去离子水为透析液，2000-5000da的水性透 析袋透析3-7天，获得碳点-铁血红素复合材料。
19.本发明的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种碳点-铁血红素 复合材料。
20.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述碳点-铁血红素复合材料的 粒径为2～20nm；在激发波长为390-450nm的光激发下，能发射波长为650-700nm 的荧光。
21.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述碳点-铁血红素复合材料在 抗菌诊疗、细菌感染识别领域以及减少细菌耐药性的产生中的应用。
22.本发明有益效果：
23.(1)本发明制备的碳点-铁血红素复合材料通过对感染性微环境的特异 响应激活化学发光分子提供长时间、稳定的自发光成像功能，实现对小鼠细菌 感染部位的选择性识别。
24.(2)本发明制备的碳点-铁血红素复合材料具有本征杀菌及增强的光动 力杀菌效果，能够有效杀灭耐药细菌，促进小鼠感染伤口愈合，且材料稳定性 强、生物相容性好，可用于感染诊断及治疗领域。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需 要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的 一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下， 还可以根据这些附图获得
其它的附图。其中：
26.图1为本发明实施例1中制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料透射电子 显微镜和粒径分布结果图。
27.图2为本发明实施例1中制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料的荧光光 谱结果图。
28.图3为本发明实施例1中制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料的紫外吸 收光谱图。
29.图4为本发明实施例1中制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料的光动力 性能图。
30.图5为本发明实施例1中制得的碳点-铁血红素复合材料的细胞毒性实验。
31.图6为本发明实施例1中制得的碳点-铁血红素复合材料体外抗菌性能测试 结果图。
32.图7为本发明实施例1中制得的碳点-铁血红素复合材料在细菌感染部位进 行特异性的催化化学发光成像图。
33.图8为本发明实施例1中制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料在细菌感 染引起的脓肿模型的治疗应用测试结果图。
34.图9为本发明实施例1中制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料的在细菌 感染的伤口模型的治疗应用测试结果图。
35.图10为本发明实施例1以及对比例1中制得的碳点-铁血红素复合材料的 光动力性能测试结果图。
36.图11为本发明实施例1以及对比例2中制得的碳点-铁血红素复合材料的 光动力性能测试结果图。
37.图12为本发明实施例1以及对比例3中制得的碳点-铁血红素复合材料的 光动力性能测试结果图。
具体实施方式
38.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
39.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明 还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不 违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例 的限制。
40.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少 一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在 一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施 例互相排斥的实施例。
41.本发明中所涉及原料无特殊说明均为普通市售。
42.实施例1
43.将2.83g谷胱甘肽与1.76g聚乙烯亚胺溶于50ml甲酰胺，混合均匀加入 反应釜，放置于160℃烘箱中反应4h。溶剂热反应结束后待冷却至室温，用去 离子水稀释后将溶液置于截留分子量为3500da的透析袋透析7天，冷冻干燥 后制得碳点。
44.将10mg氯化血红素溶于1mln,n-二甲基甲酰胺中，将17mg4-(4,6-二甲 氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物和15mg4-二甲基氨基吡啶分别溶于1 ml碳酸盐缓冲溶液中形成第一反应体系，在油浴30℃和500rpm的搅拌速度 下反应1h；
45.然后将20mg碳点溶于7ml碳酸盐缓冲溶液中，再加入到第一反应体系 中形成第二反应体系，继续在油浴30℃和1000rpm的搅拌速度下反应12h； 在截留分子量为2000da的透析袋透析5天，之后透析液通过旋转蒸发、冷冻 干燥得碳点-铁血红素复合材料。
46.对制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料进行性能表征分析，透射电子 显微镜和粒径分布结果如图1所示，cds和h-cds是单分散性分布的纳米颗 粒，其平均直径分别为4.59和7.84nm；荧光光谱结果如图2所示，cds和h-cds 的发射波长在685nm；紫外吸收光谱如图3所示，cds和h-cds的吸收峰分 别在在390和670nm。
47.实施例2
48.本实施例对实施例1制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料进行光动力 性能测试：
49.分别在比色皿中加入碳点和碳点-铁血红素复合材料，使其浓度梯度为10、 20、30、40和50μg/ml；再加入100μl浓度为25μm单线态氧检测探针sosg， 分别用激光辐照(波长＝660nm，功率密度＝40mw/cm2)1、3、5、7、10、15 和20分钟，并检测荧光强度(激发波长488nm，发射波长508nm)，其光动 力性能如图4，可以看出，相较于碳点，碳点-铁血红素复合材料具有增强的光 动力效果，在杀菌领域具有更好的应用前景。
50.实施例3
51.本实施例对实施例1制得的碳点-铁血红素复合材料进行细胞毒性实验：
52.将碳点-铁血红素复合材料分别加入到mn9d和hacat细胞株中，使复合 材料浓度梯度为0、50、100、200、300、400和500μg/ml，置于37℃培养箱3 小时后，利用酶标仪采用cck-8检测法测定450nm处的吸光度，实验结果见 图5，可以看出，碳点-铁血红素复合材料对细胞毒性较低，具有良好的生物相 容性。
53.实施例4
54.本实施例对实施例1制得的碳点-铁血红素复合材料进行体外抗菌性能测 试：
55.抗菌实验共分为四组：
56.a组：分别向每只离心管中加入0、50、100、150μl的浓度为2mg/ml 碳点-铁血红素复合材料和200μl的1
×
109cfu/ml的金黄色葡萄球菌，用生理 盐水补齐到1ml；
57.b组：分别向每只离心管中加入0、50、100、150μl的浓度为2mg/ml 碳点-铁血红素复合材料和200μl的1
×
109cfu/ml的耐甲氧基的金黄色葡萄球 菌，用生理盐水补齐到1ml；
58.c组：分别向每只离心管中加入0、50、100、150μl的浓度为2mg/ml 碳点-铁血红素复合材料和200μl的1
×
109cfu/ml的大肠杆菌，用生理盐水补 齐到1ml；
59.d组：分别向每只离心管中加入0、50、100、150μl的浓度为2mg/ml 碳点-铁血红素复合材料和200μl的1
×
109cfu/ml的铜绿假单胞杆菌，用生理 盐水补齐到1ml；
60.每只离心管取0.5ml溶液进行激光辐照10分钟，剩余0.5ml溶液在摇床 进行培养；随后，分别取每组经过辐照和未经过辐照的溶液50μl涂覆在琼脂 板上，在37℃培养箱培养24小时。
61.杀菌结果如图6，证明碳点-铁血红素复合材料对于各类细菌均具有良好的 本征
杀菌和光动力协同杀菌效果，能够有效减少细菌耐药性产生。
62.实施例5
63.本实施例对实施例1制得的碳点-铁血红素复合材料进行细菌感染部位的 特异性成像测试：
64.分别在去毛小鼠脓肿部位和正常组织部位注射20μl浓度为300μg/ml碳点
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铁血红素复合材料和10μl浓度为1mm的l012溶液，用小动物荧光成像仪对 其化学发光现象进行拍照分析；随后，在荧光模式(激发波长为420nm)下对 其荧光现象进行拍照分析，结果如图7。证明相比于荧光模式，碳点-铁血红素 复合材料在细菌感染部位能够进行特异性的化学发光成像。
65.实施例6
66.本实施例对实施例1制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料进行细菌感 染引起的脓肿模型的治疗应用测试：
67.分别将20μl浓度为300μg/ml的碳点和碳点-铁血红素复合材料注射到小 鼠细菌脓肿部位，并用激光辐照5分钟，拍照记录小鼠脓肿恢复情况如图8， 可以看出，在激光辐照条件下，碳点-铁血红素复合材料对于细菌感染引起的 脓肿具有较强的治愈能力。
68.实施例7
69.本实施例对实施例1制得的碳点以及碳点-铁血红素复合材料进行伤口模 型的治疗应用测试：
70.分别将20μl浓度为300μg/ml的碳点和碳点-铁血红素复合材料注射到小 鼠伤口感染部位，并用激光辐照5分钟，拍照记录小鼠伤口恢复情况如图9， 可以看出，在激光辐照条件下，碳点-铁血红素复合材料对于细菌感染引起的 脓肿具有较强的治愈能力。
71.对比例1
72.本对比例与实施例1的区别在于在制备碳点-铁血红素复合材料时将铁血 红素与碳点的质量比分别调整为1:50、1：10和1:1，其余制备方法与实施例1 相同。
73.对本对比例制得的碳点-铁血红素复合材料与实施例1制得的产物进行光 动力性能测试对比，结果如图10所示。
74.对比例2
75.本对比例与实施例1的区别在于在制备碳点-铁血红素复合材料时将氯化 血红素替换为羟高铁血红素，其余制备方法与实施例1相同。
76.对本对比例制得的产物与实施例1制得的产物进行光动力性能测试对比， 结果如图11所示。
77.对比例3
78.本对比例与实施例1的区别在于在制备碳点时，将溶剂热反应温度替换为 150℃、200℃和300℃，其余制备方法与实施例1相同。
79.对本对比例制得的产物与实施例1制得的产物进行光动力性能测试对比， 结果如图12所示。
80.由上述实施例以及对比例与实施例1的光动力性能测试结果图可以看出， 本发明制备的碳点-铁血红素复合材料能够充分发挥碳点作为多功能偶联中心 的优势，构建生物相容性良好，具有本征和增强光动力协同杀菌效果，并兼具 靶向成像的效果，能够实现针
对细菌感染部位成像及其指导下的高效、广谱抗 菌，并减少细菌耐药性的产生。
81.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可 以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精 神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。