胎盘来源的基质凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及一种胎盘来源的基质凝胶及其制备方法，属于生物工程。

背景技术：

1、应用组织工程技术修复全层皮肤创面和皮肤烫伤在临床试验中是一个热点。目前用于伤口愈合的水凝胶包括合成的水凝胶和天然的基质凝胶，其中，天然的基质凝胶是从组织中提取的，存在来自提取组织的各种细胞因子且比例和种类与原组织类似，更能模拟生物体内细胞外基质的场景，有利于伤口更快更贴近自然地愈合。

2、胎盘组织中含有多种生理活性成分，如细胞因子、gfs和氨基酸，在母胎耐受中发挥独特作用，防止胎儿异体移植被排斥。因此，可用于减少同种异体移植中的宿主免疫反应。使用这种人类来源的组织可以大大减少对异种支架的需求，且产后胎盘材料的丢弃使得人胎盘ecm水凝胶的发展成为可能。

3、现有技术中制备胎盘水凝胶的技术较为少见，以人胎盘为原料的更少，方法通常为制备脱细胞外基质后再进行酶消，对细胞因子和部分蛋白破坏较大，且部分方法中的基质凝胶由于提取试剂的选择或时间与温度的选择，导致对组织中的蛋白和细胞因子也有较大的破坏；另外还存在凝胶后的透明度较低，制备时间过长，引入其他有毒性的物质等不足之处。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种胎盘来源的基质凝胶，其富含细胞因子，且与原组织细胞外基质构成相似，本发明还提供了其制备方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种胎盘来源的基质凝胶，是通过以下方法制备得到的，包括以下步骤：

4、(1)预处理：取胎盘组织，将其破碎(使用组织破碎机破碎)，然后浸泡于氯化钠溶液中8～12min以去除细胞；取出，滤干水分，浸泡于尿素溶液a中以进行组织内可溶性蛋白的提取，浸泡2～4天后离心(优选4000rpm，15min)，分离得到上清液和沉淀；

5、所述氯化钠溶液是由以下组分组成的(以500ml计)：氯化钠95～105克，1.3～1.7克三羟甲基氨基甲烷(tris)，0.7～0.8克edta，0.11～0.14克乙基马来酰亚胺，余量为超纯水，ph为7.0～8.0；

6、优选的，所述氯化钠溶液中氯化钠的浓度为3.4mol/l，是由以下组分组成的(以500ml计)：氯化钠99.25克，1.5143克三羟甲基氨基甲烷，0.75克edta，0.125克乙基马来酰亚胺，余量为超纯水，ph为7.4；

7、所述尿素溶液a(尿素溶液的浓度为2.5～3.5mol/l)是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素70～105克，氯化钠4.0～5.0克，3.0～3.1克tris，余量为超纯水，ph为7.0～8.0；尿素溶液a属于低浓度尿素，对蛋白变性程度不大，可保留丰富的细胞因子，无毒，且兼顾了提取效率；

8、优选的，所述尿素溶液a中尿素的浓度为3mol/l，是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素90克，氯化钠4.5克，3.025克tris，余量为超纯水，ph为7.4；

9、进一步地，所述胎盘组织，是去除多余血液的新鲜胎盘组织，或在4℃条件下保存于含有edta的pbs缓冲液(1l pbs缓冲液加1.5g edta，并调ph至7.4)中的胎盘组织；

10、进一步地，所述胎盘组织与尿素溶液a的配比关系为：1g胎盘组织加0.8～1.2ml尿素溶液a；优选的，1g胎盘组织加1ml尿素溶液a；

11、进一步地，所述浸泡于氯化钠溶液、浸泡于尿素溶液均是在4℃条件下进行的；

12、(2)细胞因子的提取：上述上清液，在3500da截流量透析袋中用50～100倍样品量(体积比)的pbs缓冲液透析20～28小时；保留液离心(优选4000rpm，15min)取上清，继续在3500da截流量透析袋中用50～100倍样品量(体积比)的pbs缓冲溶液透析20～28小时；保留液离心(优选12000rpm,10min)取上清，用含有抗生素的8～12倍样品量(体积比)的pbs缓冲液透析10～15小时，得富含细胞因子的保留液；

13、进一步地，所述含有抗生素的pbs缓冲液中含有青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素。所述青霉素、链霉素的浓度为0.8％～1.2％(重量体积比，单位g/ml)，所述庆大霉素和两性霉素的浓度为0.08％～0.12％(重量体积比，单位g/ml)；优选的，所述青霉素、链霉素的浓度为1％，所述庆大霉素和两性霉素的浓度为0.1％；

14、(3)蛋白凝胶支架的制备：步骤(1)中的沉淀，称重，置于ph为1.0～2.0的盐酸中处理2.5～3.5h，过滤除去盐酸；再置于胃蛋白酶溶液(浓度为8～12mg/ml，优选10mg/ml)中，消化处理(在20～28℃、摇床120～200rpm/min条件下消化处理20～28小时)，离心(优选12000rpm，10min)收集上清，所得沉淀继续用胃蛋白酶溶液消化处理，离心收集上清；将两次所得上清合并，置于8～12倍样品量(体积比)的尿素溶液b中处理10～14小时；然后在14000da截流量透析袋中用50～100倍样品量(体积比)的pbs缓冲液透析20～28小时，得蛋白液；

15、所述胃蛋白酶溶液是由以下组分组成的：胃蛋白酶800～1200克，ph为1～2的盐酸100ml；优选的，是由以下组分组成的：胃蛋白酶1000克，ph为1的盐酸100ml；

16、所述尿素溶液b(尿素溶液的浓度为5～7mol/l)是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素150～210克，氯化钠4.0～5.0克，2.9～3.2克tris，余量为水，ph为7.0～8.0；优选的，所述尿素溶液b(尿素溶液的浓度为6mol/l)是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素180克，氯化钠4.5克，3.025克tris，余量为水，ph为7.4；

17、所述沉淀与盐酸、胃蛋白酶溶液的用量配比关系为：1g沉淀加入1.8～2.2ml盐酸；1g沉淀加入1.8～2.2ml胃蛋白酶溶液；优选的，1g沉淀加入2ml盐酸；1g沉淀加入2ml胃蛋白酶溶液；

18、其中，先用盐酸预处理沉淀3h左右，可改变沉淀ph值，避免胎盘沉淀组织中残留的弱碱性液体对胃蛋白酶溶液的ph值造成影响，10mg/ml的胃蛋白酶浓度，以及两倍的质量体积比，既可以保证胎盘组织的完全消化，又可以保证被消化后的蛋白溶液的浓度适宜；25℃的消化条件为适宜温度，温度过高会导致消化过度，温度过低会影响消化速度；尿素溶液的浓度为6mol/l，其具有4个作用：一为调节ph至7.4，二为浓缩蛋白，三为提高基质凝胶的透明度，四为对进行灭菌消毒，避免使用灭菌消毒剂；

19、(4)将步骤(2)所得富含细胞因子的保留液与步骤(3)所得蛋白液按0.8～1.2:1的体积比混合，即得基质凝胶，具有温敏性和ph敏感性，可用于注射，可用于治疗皮肤创伤或烫伤。

20、本发明的胎盘来源的基质凝胶，富含与胎盘组织类似的细胞因子和蛋白种类，在细胞增殖上具有明显促进作用；无毒性，并且对于伤口的愈合具有促进作用；同样来源的胎盘提取物和同样来源的蛋白支架使得对胎盘组织的利用更充分且为同源性物质。本发明的胎盘来源的基质凝胶的制备方法，不使用灭菌消毒剂，避免了可能对机体有害的消毒灭菌物质的残留；所涉及的工艺参数(如尿素溶液的浓度、胃蛋白酶的浓度等)，均是经多次试验探索出的最佳参数，可以得到效果最佳的基质凝胶；制备时间短，可在一周内完成(1～3天为上清提取，第三天离心产生的沉淀可随即进行凝胶支架的制备，第4天上清离心、透析和沉淀胃酶消化完成离心透析，第五天为上清离心透析和沉淀的透析，第六和七天为上清和沉淀透析和分装的时间，故最短时间7天内可以完成提取任务)。

21、本发明的胎盘来源的基质凝胶及制备方法，具有以下优点：

22、1、沉淀经过胃蛋白消化后用高浓度的尿素溶液(6mol/l)处理，该过程灭菌消毒、浓缩蛋白，使基质凝胶凝胶后透明度显著提高。

23、2、沉淀酶消之前用盐酸浸泡处理，可显著避免组织中残留的弱碱对胃蛋白酶的活性造成影响。

24、3、富含细胞因子的上清液和凝胶支架均来自同一组织，实现了对组织利用的最大化，避免了引入外源性蛋白和因子导致的对人体内部环境模拟的影响。

25、4、确定了沉淀经过胃蛋白酶消化时的温度要控制在25℃，摇床160rpm/min，消化24h即可，统一了操作条件。

26、5、提取细胞因子的上清时的尿素浓度和处理时间选择上进行了优化，3mol/l的浓度介于2mol/l的低浓度尿素和4mol/l的中等浓度尿素之间，既加快了可溶性蛋白的提取，又可避免浓度过高导致的过度变性，且3天为处置最佳时间，过短和过长均影响蛋白产量。

27、6、提取含有细胞因子的上清时选择3500da截流量的透析袋，可保留绝大部分可溶性蛋白，在蛋白支架制备的过程中使用14000da截流量透析袋可在透析时加快不需要的小分子物质的去除，且降低成本。