淋巴管新生促进因子表达成纤维细胞以及含有该细胞的医药组合物的制作方法

本发明涉及一种淋巴管新生促进因子表达成纤维细胞，特别是一种表达特定的基因或蛋白质(adrenomedullin：肾上腺髓质素(以下，也称为adm)和/或hematopoietically-expressed homeobox protein：造血表达同源盒蛋白(以下，也称为hhex))的淋巴管新生促进因子表达成纤维细胞以及含有该细胞的医药组合物。

背景技术：

1、淋巴管是与血管系统并列延伸并分布于全身的导管网络。在纤维化病的治疗和改善(非专利文献1)、活体的组织液的恒常性维持(非专利文献2)、脂质以及维生素的输送(非专利文献3)、免疫监视的调节中发挥着重要的作用(非专利文献4)。在心脏中，淋巴管为了维持正常的心输出量，也进行体液平衡的维持。

2、近年来，有报告称淋巴管的形成促进效果(以下，称为淋巴管新生)作为用于心肌缺血以及心肌梗塞后的心输出量恢复的治疗靶点是有用的，另外，作为用于减轻浮肿的治疗靶点也备受关注(非专利文献1)。

3、adm是在心血管系统以及淋巴系统的发育中担负重要功能的心脏保护肽。有报告称adm使淋巴管内皮细胞的屏障稳定化，并促进淋巴管新生(非专利文献5)。也有报告称，在临床上，通过向急性心肌梗塞患者静脉内施用adm，从而使心血管系统得到了显著的改善(非专利文献6)。

4、hhex除了作为vegfa(vascular endothelial growth factor：血管内皮生长因子)、vegfr1(vascular endothelial growth factor receptor 1：血管内皮细胞生长因子受体1)以及vegfr2(vascular endothelial growth factor receptor 2：血管内皮细胞生长因子受体2)的直接性转录调节因子而被公知以外，还报告了经由vegfc/flt4/prox1信号调节淋巴管新生(非专利文献7)。

5、另外，间质性肺炎是指，由于新型冠状病毒感染症(covid-19)等病毒感染、年龄增长、吸烟等危险因子或胶原病、结节病等疾病等，导致肺泡的炎症反应进入失控状态(细胞因子风暴)，在肺泡内纤维化加剧，从而使肺的气体交换功能受损的病情(非专利文献8)。在间质性肺炎中，不能确定发病原因的症状被称为特发性间质性肺炎(iips)，本疾病在日本被指定为“疑难病症(特定疾病)”。占iips患者的80～90％的特发性肺纤维化病(ipf)尤其对于现行的治疗表现出抵抗性，诊断后的平均生存期为3～5年，急性恶化后的平均生存期在两个月以内，被认为是比多数癌症更预后不良的疾病。从这样的背景出发，包括ipf在内的间质性肺炎以及肺纤维化病的治疗方法的开发正在被推进，一些医药品正在被临床应用。例如，示出了吡非尼酮(pirfenidone)使用力肺活量(fvc)和六分钟步行距离的减少延迟并且在特定的患者中死亡率可能被改善。示出了尼达尼布(nintedanib)也有使fvc的减少延迟并使死亡率下降的倾向。但是，这些治疗方法没有发现呼吸系统症状的改善，急性恶化率也没有显著改善。因此，很明显肺功能会一直持续恶化。

6、为了克服这些问题，开发了以结缔组织生长因子、白细胞介素(il)-4以及il-13抗体、半乳糖凝集素-3抑制剂、溶血磷脂酸受体拮抗剂、磷酸肌醇-3-激酶通路抑制剂、间充质干细胞(msc)为首的数十种新型治疗药，其中一些正在进行临床试验，但目前还没有有效的治疗方法应对肺纤维化病的急性恶化。

7、近年来，肺纤维化病与哮喘或慢性阻塞性肺部疾病(copd)同样地，慢性且反复性的炎症反应的活化作为病理生理学上的发病原因而被报告。示出了在健康的肺中，炎症性细胞因子对于病毒感染或伤害负责控制肺的炎症反应从而有助于组织的修复或维持恒常性，但在肺纤维化病中，炎症性细胞因子被过度产生，由于炎症反应进入失控状态(细胞因子风暴)，从而诱发肌成纤维细胞病灶的形成，其结果，发生细胞外基质(ecm)的过度沉积，并诱发纤维化(非专利文献9)。启示出淋巴管的结构性及功能性的变化与这种过度的炎症反应所导致的纤维化的诱发有关(非专利文献10)。

8、在肺中，淋巴管由具有不连续的基底膜的单一淋巴内皮细胞(lec)壁构成，作为从末梢组织向淋巴结的抗原或抗原呈递细胞的输送管道或间质液的清除而发挥作用。在纤维化病中淋巴管发生障碍，例如有报告称在射线诱导性ipf动物模型中，淋巴管密度的显著减少与纤维化的诱发相关(非专利文献11)，还有报告称在博来霉素诱导性ipf动物模型中，血小板衍生生长因子受体(pdgfr)-β阳性壁细胞通过抑制肺的损伤以及修复中的重要的分子即透明质酸的排出，从而诱发肺的淋巴管障碍(非专利文献12)。另一方面，在人的ipf中，虽然肺组织内的淋巴管密度增加，但所形成的淋巴管具有结构性、功能性的缺陷，观察到pdgfr阳性壁细胞的局部存在或形成间断性被破坏的淋巴管(非专利文献13)。另外，还有报告称在创伤治愈中，纤维化病诱发性的成纤维细胞导致的转化生长因子(tgf)-β1的过度表达会抑制淋巴管内皮细胞的增殖和功能，并选择性地破坏淋巴管(非专利文献14)。

9、本发明人至今为止已经发现了能够高效诱导心脏的淋巴管新生并大幅改善心力衰竭的心肌收缩力的心脏来源血管内皮细胞粘附分子-1(vascular cell adhesionmolecule-1(vcam-1，cd106))阳性成纤维细胞(非专利文献15)，还发现了制作成体心脏来源vcam-1阳性成纤维细胞的方法(专利文献1)。

10、现有技术文献

11、专利文献

12、专利文献1：国际公开第2020/045547号

13、非专利文献

14、非专利文献1：循环(circulation.)2016；133:1484-1497

15、非专利文献2：纽约医学院公报(bull n y acad med.),1938；14:231-251

16、非专利文献3：美国生理学-内分泌学与新陈代谢(am j physiol endocrinolmetab.),2009；296:e1183-e1194

17、非专利文献4：免疫学前沿(front immunol.),2016；7:613

18、非专利文献5：肽(peptides),2008；29:2243-2249

19、非专利文献6：心血管药理学杂志(j cardiovasc pharmacol.),2010；56:413-419

20、非专利文献7：自然沟通(nat commun.),2018；9；article number 2704非专利文献8：内科学年鉴(ann intern med.),2020；172(9):629-632

21、非专利文献9：呼吸道重症监护医学论文集(semin respir crit care med.),2006；27:600-612

22、非专利文献10：淋巴研究与生物学(lymphat res biol.),2009；7:197-203

23、非专利文献11：淋巴研究与生物学(lymphat res biol.),2014；12:238-250

24、非专利文献12：血液(blood),2012；119:5931-5942

25、非专利文献13：淋巴研究与生物学(lymphat res biol.),2010；8:199-207

26、非专利文献14：美国生理学-心脏与循环生理学(am j physiol-heart circphysiol.),2008；295:2113-2127

27、非专利文献15：公共科学图书馆综合(plos one.),2020；15:e0237810

28、非专利文献16：肺药理学与治疗学(pulm pharmacol ther.),2012aug；25:281-285

29、非专利文献17：干细胞转化医学(stem cells transl med.)2017；6(10):1905-1916

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、本发明的课题在于，提供一种具有淋巴管新生能力的成纤维细胞以及含有该细胞的医药组合物。

3、用于解决问题的手段

4、本发明人为了解决上述课题而进行了研究，发现与tnf-α(tumor necrosisfactor-α：肿瘤坏死因子-α)以及il-4(interleukin 4：白细胞介素-4)接触的成纤维细胞会显著提高adm和/或hhex的基因表达水平，从而完成了本发明。

5、即，本发明包括以下第一方面(发明a)。

6、(a1)一种医药组合物，含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞。

7、(a2)根据(a1)所述的医药组合物，所述成纤维细胞为来源于成体的成纤维细胞。

8、(a3)根据(a1)或(a2)所述的医药组合物，所述细胞的adm和/或hhex的基因表达量与作为对照的成纤维细胞相比，高1.20倍以上。

9、(a4)根据(a1)～(a3)中任一项所述的医药组合物，用于治疗纤维化病。

10、(a5)根据(a1)～(a4)中任一项所述的医药组合物，用于改善淋巴管新生能力下降的状态。

11、(a6)根据(a1)～(a5)中任一项所述的医药组合物，用于改善组织液的恒常性的障碍。

12、(a7)根据(a1)～(a6)中任一项所述的医药组合物，用于减轻浮肿。

13、(a8)根据(a1)～(a7)中任一项所述的医药组合物，用于改善脂质和/或维生素的输送能力的障碍。

14、(a9)根据(a1)～(a8)中任一项所述的医药组合物，用于激活免疫监视机构。

15、(a10)根据(a1)～(a9)中任一项所述的医药组合物，为注射用组合物。

16、(a11)根据(a1)～(a9)中任一项所述的医药组合物，所述细胞是被构筑为平面状或立体状的细胞组织而构成的。

17、(a12)根据(a1)～(a11)中任一项所述的医药组合物，所述成纤维细胞为来源于心脏的成纤维细胞。

18、另外，本发明包括以下第二方面(发明b)。

19、(b1)一种治疗对象中纤维化病的方法，包括将含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

20、(b2)一种改善对象中淋巴管新生能力下降的状态的方法，包括将含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

21、(b3)一种改善对象中组织液的恒常性的障碍的方法，包括将含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

22、(b4)一种减轻对象中浮肿的方法，包括将含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

23、(b5)一种改善对象中脂质和/或维生素的输送能力的障碍的方法，包括将含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

24、(b6)一种激活对象中免疫监视机构的方法，包括将含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

25、(b7)一种治疗对象中器官衰竭的方法，包括将含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

26、另外，本发明包括以下第三方面(发明c)。

27、(c1)一种含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物的作为注射剂的使用，所述注射剂用于施用于衰竭器官组织和/或其周围区域、或纤维化组织和/或其周围区域。

28、(c2)一种含有adm和/或hhex高表达的成纤维细胞的医药组合物的作为移植材料的使用，所述移植材料用于移植到衰竭器官组织和/或其周围区域、或纤维化组织和/或其周围区域。

29、本发明包括以下第四方面(发明d)。

30、(d1)一种adm高表达的成纤维细胞的制造方法，包括：使tnf-α以及il-4与成纤维细胞接触；以及在adm能够成为高表达的条件下培养接触后的所述成纤维细胞。

31、(d2)根据(d1)所述的方法，所述成纤维细胞为vegf-c高表达的成纤维细胞。

32、(d3)根据(d1)或(d2)所述的方法，所述成纤维细胞为cd106阳性的成纤维细胞。

33、(d4)根据(d3)所述的方法，包括使用抗cd106抗体来选择或浓缩adm高表达的成纤维细胞。

34、(d5)根据(d1)～(d4)中任一项所述的方法，所述成纤维细胞为来源于肺的成纤维细胞。

35、(d6)一种adm高表达的成纤维细胞，通过(d1)～(d5)中任一项所述的制造方法而得到。

36、(d7)一种成纤维细胞群，含有(d6)所述的细胞。

37、本发明包括以下第五方面(发明e)。

38、(e1)一种adm高表达的成纤维细胞。

39、(e2)根据(e1)所述的成纤维细胞，为vegf-c高表达的成纤维细胞。

40、(e3)根据(e1)或(e2)所述的成纤维细胞，为cd106阳性的成纤维细胞。

41、(e4)根据(e1)～(e3)中任一项所述的细胞，所述细胞的vegf-c和/或adm的基因表达量与作为对照的成纤维细胞相比，分别高1.20倍以上。

42、(e5)根据(e1)～(e4)中任一项所述的细胞，所述成纤维细胞为来源于肺的成纤维细胞。

43、(e6)一种成纤维细胞群，含有(e1)～(e5)中任一项所述的细胞。

44、(e7)一种细胞群，含有cd106阳性的肺来源成纤维细胞，所述cd106阳性的肺来源成纤维细胞的比例(细胞数基准)相对于所述细胞群中含有的全部成纤维细胞超过18.01％。

45、本发明包括以下第六方面(发明f)。

46、(f1)一种医药组合物，含有(d6)以及(e1)～(e5)中任一项所述的细胞或(d7)以及(e6)～(e7)中任一项所述的细胞群。

47、(f2)根据(f1)所述的医药组合物，用于治疗肺部疾病。

48、(f3)根据(f2)所述的医药组合物，所述肺部疾病为肺纤维化病或间质性肺炎。

49、(f4)根据(f1)所述的医药组合物，用于改善淋巴管新生能力下降的状态。

50、(f5)根据(f1)～(f4)中任一项所述的医药组合物，为注射用组合物。

51、(f6)根据(f1)～(f4)中任一项所述的医药组合物，所述细胞或所述细胞群是被构筑为平面或立体状的细胞组织而构成的。

52、本发明包括以下第七方面(发明g)。

53、(g1)一种治疗对象中肺部疾病的方法，包括将(d6)以及(e1)～(e5)中任一项所述的细胞、(d7)以及(e6)～(e7)中任一项所述的细胞群、或(f1)所述的医药组合物施用或移植到该对象。

54、(g2)根据(g1)所述的方法，所述肺部疾病为肺纤维化病或间质性肺炎。

55、(g3)一种改善对象中淋巴管新生能力下降的状态的方法，包括将(d6)以及(e1)～(e5)中任一项所述的细胞、(d7)以及(e6)～(e7)中任一项所述的细胞群、或(f1)所述的医药组合物施用或移植到该对象。

56、本发明包括以下第八方面(发明h)。

57、(h1)一种(d6)以及(e1)～(e5)中任一项所述的细胞、(d7)以及(e6)～(e7)中任一项所述的细胞群、或(f1)所述的医药组合物的作为注射剂的使用，所述注射剂用于施用于肺组织和/或其周围区域。

58、(h2)一种(d6)以及(e1)～(e5)中任一项所述的细胞、(d7)以及(e6)～(e7)中任一项所述的细胞群、或(f1)所述的医药组合物的作为移植材料的使用，所述移植材料用于移植到肺组织和/或其周围区域。

59、发明的效果

60、根据本发明，能够提供一种含有具有淋巴管新生能力的成纤维细胞的医药组合物，即含有adm和/或hhex高表达细胞的医药组合物，还能够提供一种使用该医药组合物治疗纤维化病的方法或改善淋巴管新生能力下降状态的方法、组织液的恒常性、脂质和/或维生素的输送、免疫监视的调节、治疗器官衰竭的方法。另外，能够提供一种adm高表达的成纤维细胞以及使用该细胞治疗肺部疾病的方法。