通过修饰的Fc受体的移植细胞保护

本发明涉及再生或肿瘤细胞疗法。在一些实施方案中，再生细胞疗法包括将细胞或细胞系移植到有需要的患者中。在一些实施方案中，细胞系包含表达细胞表面fc受体的多能细胞，所述细胞表面fc受体已被截短以除去胞内信号传导结构域。在其他实施方案中，细胞表面fc受体是截短的cd16、cd32或cd64蛋白(分别为cd16t、cd32t或cd64t)。在其他实施方案中，它们是低免疫原性的、具有o血型或是rh因子阴性的。在其他实施方案中，再生或肿瘤细胞治疗产品在同种异体接受者中表现出延长的存活。在一些实施方案中，再生细胞疗法用于治疗受伤的器官和组织，免疫肿瘤细胞产品用于治疗癌症。在一些实施方案中，本发明的再生细胞疗法利用用于治疗疾病或修复受损组织的胰岛细胞、甲状腺细胞、肝细胞、嵌合抗原受体(car)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质细胞、心肌细胞或视网膜色素内皮细胞。在其他实施方案中，本发明的免疫肿瘤细胞产品利用t细胞、自然杀伤(nk)细胞或其他免疫细胞如先天淋巴细胞(ilc)。ii.技术背景再生细胞疗法是用于再生受损器官和组织的重要的潜在疗法。由于用于移植的器官的可获得性低以及伴随的漫长等待，通过将容易获得的细胞系移植到患者体内来再生组织的可能性可以理解地是具有吸引力的。再生细胞疗法已经在(例如心肌梗塞后)动物模型中显示出在移植后修复受损组织的有希望的初步结果。然而，移植接受者的免疫系统排斥同种异体物质的倾向大大降低了治疗的潜在功效，并减少了围绕此类治疗的可能的积极作用。尽管嵌合抗原受体(car)t细胞疗法在难治性癌症患者的治疗中取得了显著进展，但必须制定策略以使大量实体瘤个体受益。在这种类型的疗法成为不同癌症的广泛接受的标准疗法之前，需要克服一些障碍。在这些障碍中，输注的细胞的持久性差是成功癌症治疗的一个关键挑战。众所周知，输注的car t细胞的持久性差与癌症患者的持久临床缓解呈负相关，并且有限的car t细胞持久性与工程化t细胞产品的免疫原性有关(korde,n.等人,aphase ii trial of pan-kir2dblockade with iph2101in smoldering multiplemyeloma.haematologica 99,e81-83(2014),schmidts,a.&maus,m.v.making car t cellsa solid option for solid tumors.front immunol 9,2593(2018))。在自体car t疗法的一些情况下，已确定特异性免疫反应针对car本身，并在其作用完全实现之前消除细胞治疗剂(hege,k.m.等人,safety,tumor trafficking and immunogenicity of chimericantigen receptor(car)-t cells specific for tag-72in colorectal cancer.jimmunother cancer 5,22(2017),lamers,c.h.等人,treatment of metastatic renalcell carcinoma with caix car-engineered t cells:clinical evaluation andmanagement of on-target toxicity.mol ther 21,904-912(2013))。cd19表达在已经历肿瘤转化的b谱系细胞中得以维持，因此，cd19可用于诊断b细胞白血病，并可作为car t细胞治疗的靶点。现代白血病治疗包括细胞毒性预处理，然后施用抗cd19car t细胞，其靶向所有b细胞，包括白血病和良性群体。因此，针对b细胞白血病进行治疗的患者中的宿主抗移植物免疫反应很大程度上减弱，并且显示出抗体产生的长期抑制。因此，在治疗白血病患者时，car t细胞被更好地保护以免受免疫排斥。在实体器官癌症患者中，针对car t产品的免疫反应得到增强(hege,k.m.等人,safety,tumor trafficking and immunogenicity ofchimeric antigen receptor(car)-t cells specific for tag-72in colorectalcancer.j immunother cancer 5,22(2017))并最大限度地降低了这种疗法的功效。持久性差会阻碍输注的细胞的效应功能，并阻碍长期治疗的成功。自体诱导多能干细胞(ipsc)理论上构成了基于患者特异性细胞的器官修复策略的无限细胞来源。然而，它们的产生带来了技术和制造上的挑战，并且是在概念上阻止了任何急性治疗方式的漫长过程。从制造的角度来看，基于同种异体ipsc的疗法或基于胚胎干细胞的疗法更容易，并且允许产生良好筛选的、标准化的、高质量的细胞产品。然而，由于它们的同种异体来源，此类细胞产品会发生排斥。随着细胞抗原性的降低或消除，可以产生普遍可接受的细胞产品。因为多能干细胞可以分化成三胚层的任何细胞类型，所以干细胞疗法的潜在应用是广泛的。可以通过移植祖细胞来离体或体内进行分化，所述祖细胞在植入部位的器官环境中继续分化和成熟。离体分化允许研究人员或临床医生密切监控该过程，并确保在移植前产生合适的细胞群。然而，在大多数情况下，未分化的多能干细胞由于其形成畸胎瘤的倾向而避免用于临床移植疗法。相反，此类疗法倾向于使用分化细胞(例如，干细胞衍生的心肌细胞移植到心力衰竭患者的心肌中)。此类多能细胞或组织的临床应用将受益于在细胞移植后控制所述细胞的生长和存活的“安全特征”。本领域寻求能够产生用于再生或替代患病或缺陷细胞的细胞的干细胞。可以使用多能干细胞(psc)，因为它们快速繁殖并分化成许多可能的细胞类型。psc家族包括通过不同技术产生并具有不同免疫原性特征的若干成员。患者与衍生自psc的工程改造的细胞或组织的相容性决定了免疫排斥的风险和对免疫抑制的需求。从胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞(esc)表现出与接受者不匹配的组织相容性抗原。这种免疫屏障不能被人白细胞抗原(hla)分型的esc库所解决，因为即使是hla匹配的psc移植物也会因为作为次要抗原的非hla分子的不匹配而发生排斥。同种异体诱导多能干细胞(ipsc)也是如此。低免疫原性多能(hypoimmunogenic pluripotent,hip)细胞和细胞产物具有基因敲除或转基因，以保护它们免受包括t细胞、nk细胞和巨噬细胞在内的免疫系统细胞组分的影响。它们也可能是abo血型o型和rh阴性(hipo-)。免疫排斥是细胞治疗成功的主要障碍，目前正在努力开发逃避细胞排斥的通用的同种异体现成细胞(yoshihara,e.等人,nature 586,606-611(2020)；wang,b.等人,natbiomed eng 5,429-440(2021)；deuse,t.等人,proc natl acad sci u s a 118,(2021))。然而，此类基因编辑的低免疫原性细胞仍然容易受到针对工程化细胞和病毒产品中的非hla表位、细胞类型特异性自身抗原以及异种(klee,g.g.arch pathol lab med 124,921-923(2000))或合成构建体(choe,j.h.等人,sci transl med 13(2021))的抗体杀伤。这样的细胞是由转导过程产生的(lamers,c.h.等人,blood 117,72-82(2011)；jensen,m.c.等人,biol blood marrow transplant 16,1245-1256(2010))。细胞毒性抗体可以是预先存在的或治疗诱导的(wagner,d.l.等人,nat rev clin oncol 18,379-393(2021))并危及细胞疗法的持久性和功效。涉及抗体的两种最相关的杀伤机制是通过自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、b细胞或粒细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc)和通过激活补体级联的补体依赖性细胞毒性(cdc)。所有这些杀伤机制都利用结合靶细胞并激活效应免疫细胞或补体的抗体(图1)。igg抗体可以是adcc和cdc两者的强效介质。igg抗体具有两个与特定表位结合的可变fab区。可结晶的fc区突出并用于结合nk细胞、b细胞、巨噬细胞、粒细胞或补体。识别igg的fc部分的受体分为四个不同的类别：fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriv。fcγri对抗体恒定区表现出高亲和力并具有限制性同种型特异性，而fcγrii和fcγriii对igg的fc区具有低亲和力，但具有更广泛的同种型结合模式，并且fcγriv是最近鉴定的具有中等亲和力和限制性亚类特异性的受体。在生理上，fcγri在早期免疫反应期间发挥作用，而fcγrii和riii在晚期免疫反应期间以围绕多价抗原的聚集体形式识别igg。如果抗体通过其fab区与未受保护的细胞结合，则fc可被nk细胞(主要通过其cd16受体)、巨噬细胞(主要通过cd64、cd16或cd32)、b细胞(主要通过cd32)或粒细胞(主要通过cd32、cd16或cd64)结合，并介导adcc。补体还可以与fc结合并激活其级联，形成膜攻击复合物(mac)用于cdc杀伤。iii.
技术实现要素：
本发明提供表达细胞表面fc受体的细胞，所述细胞表面fc受体已被截短或修饰以去除细胞内信号传导功能或细胞内信号传导结构域。可以将细胞移植到有需要的患者中。在一些实施方案中，本发明的再生或肿瘤细胞疗法利用用于治疗癌症、疾病或修复受损组织的胰岛细胞、甲状腺细胞、嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、肝细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质细胞、心肌细胞或视网膜色素内皮细胞。本发明提供了表达截短的cd16、cd32或cd64的细胞(图2)，其隔离局部抗体的fc部分并因此抑制adcc和cdc。(比较图1和图3)。细胞可以是原代细胞、分化细胞、多能细胞包括低免疫原性多能细胞(hip)、abo血型o恒河猴因子阴性hip细胞(hipo-)诱导的多能干细胞(ipsc)、其为o-的ipsc、胚胎干细胞细胞(esc)或其为o-的esc，其中任何一种进一步包含截短的cd64表达。原代细胞直接从组织中分离出来。在其他实施方案中，细胞可以是用于治疗疾病或修复受损组织的胰岛细胞、甲状腺细胞、嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、肝细胞、多巴胺能神经元、神经胶质细胞、心肌细胞或视网膜色素内皮细胞。cd64仅在巨噬细胞和单核细胞上组成性存在，并且通常不在组织细胞上表达。它通常被称为fc-γ受体1(fcγri)，并以高亲和力结合igg fc区域。靶细胞上的cd64过表达隔离igg fc并将其与靶细胞结合。在没有用于通过cd64进行细胞激活的细胞内途径的细胞中，可能对这样的细胞没有功能影响。对于所有允许cd64的胞质尾部诱导细胞内激活途径的细胞，fc结合会影响细胞并可能扰乱其生理机能。这可以通过截短或修饰fc受体(例如cd64)的胞内信号传导结构域来避免。没有胞内结构域的fc受体不会触发细胞激活，但仍然能够隔离igg fc。对于cd64、cd32和cd16来说也是如此。即使游离的fab区域会结合邻近的靶细胞，fc的占据也会阻止任何adcc或cdc。因此，本发明提供了修饰的细胞，其中所述修饰的细胞表达包含截短或修饰的fc受体蛋白，其中所述fc受体蛋白表达导致所述修饰的细胞对抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)较不敏感，其中截短或修饰减少或消除细胞内信号传导。在本发明的一些方面，fc受体蛋白选自截短的cd16(cd16t)、截短的cd32(cd32t)和截短的cd64(cd64t)。在其他方面，细胞是原代细胞、分化的细胞或多能细胞。在本发明的一些方面，fc受体蛋白选自与seq id no：16具有至少90％序列同一性的cd64t蛋白、与seq id no：14具有至少90％序列同一性的cd16t蛋白和与seq id no：15具有至少90％序列同一性的cd32t蛋白。在一个优选的方面，cd64t蛋白具有seq id no：16的序列。在本发明的一些方面，修饰的细胞衍生自人低免疫原性多能(hip)细胞、人低免疫原性多能abo血型o恒河猴因子阴性(hipo-)细胞、人诱导多能干细胞(ipsc)或人胚胎干细胞(esc)。在其他方面，修饰的细胞来自选自人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠和豚鼠的物种。本发明提供了本文公开的修饰细胞，其还包含自杀基因，所述自杀基因被导致修饰的细胞死亡的触发剂激活。在一些方面，自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(hsv-tk)并且触发剂是更昔洛韦。在优选的方面，hsv-tk基因编码与seq id no：4具有至少90％序列同一性的蛋白。在另一个优选的方面，hsv-tk基因编码包含seq id no：4的序列的蛋白。在另一个方面，自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(ec-cd)并且触发剂是5-氟胞嘧啶(5-fc)。在优选的方面，ec-cd基因编码与seq id no：5具有至少90％序列同一性的蛋白。在另一个优选的方面，ec-cd基因编码包含seq id no：5的序列的蛋白。在另一个方面，自杀基因编码诱导型半胱天冬酶蛋白并且触发剂是二聚化化学诱导剂(cid)。在优选的方面，自杀基因编码与seq id no：6具有至少90％序列同一性的诱导型半胱天冬酶蛋白。在另一个优选的方面，自杀基因编码包含seq id no：6的序列的诱导型半胱天冬酶蛋白。在另一个方面，cid是ap1903。本发明提供本文公开的修饰细胞选自嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、胰岛β细胞、甲状腺细胞、成纤维细胞、肝细胞、心肌细胞和视网膜色素内皮细胞。在一些方面，细胞是car-t或car-nk细胞。本发明提供了一种方法，其包括将本文公开的细胞移植到受试者中，其中所述受试者是人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠。在该方法的一些方面，修饰的细胞选自嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞和视网膜色素内皮细胞。本发明提供了治疗疾病的方法，其包括向受试者施用本文公开的细胞或衍生自其的细胞。在该方法的一些方面，细胞或衍生细胞选自嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、胰岛β细胞、甲状腺细胞、成纤维细胞、肝细胞、心肌细胞和视网膜色素内皮细胞。在其他方面，所述疾病选自i型糖尿病、心脏病、神经系统疾病、内分泌疾病、癌症、眼部疾病和血管疾病。本发明提供了用于产生本文所公开的修饰的细胞的方法，包括在细胞的亲本非修饰形式中表达cd16t、cd32t或cd64t蛋白。在一些方面，修饰的细胞具有人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠或豚鼠来源。在其他方面，修饰的细胞衍生自hip细胞、hipo细胞、ipsc细胞或esc细胞。在该方法的一些方面，cd16t、cd32t或cd64t表达是由将启动子控制下的人cd16t、cd32t或cd64t基因的至少一个拷贝引入修饰的细胞的亲本形式中引起的。在一个优选的方面，启动子是组成型启动子。本发明提供了用于治疗疾病的药物组合物，其包含本文公开的修饰细胞或衍生自其的细胞和药学上可接受的运载体。在一些方面，细胞选自嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质细胞、胰岛细胞、胰岛β细胞、甲状腺细胞、另一种内分泌细胞、成纤维细胞、肝细胞、心肌细胞和视网膜色素内皮细胞。在其他方面，所述疾病选自i型糖尿病、心脏病、神经系统疾病、内分泌疾病、癌症、眼部疾病和血管疾病。本发明提供了一种用于治疗疾病的药物，其包含本文所述的细胞或衍生自本文所述的修饰的细胞的细胞。在一些方面，细胞或衍生细胞选自嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质细胞、胰岛细胞、胰岛β细胞、甲状腺细胞、成纤维细胞、肝细胞、心肌细胞和视网膜色素内皮细胞。在其他方面，所述疾病选自i型糖尿病、心脏病、神经系统疾病、内分泌疾病、癌症、眼部疾病和血管疾病。本发明提供了一种修饰的细胞，其包含cd16t、cd32t或cd64t蛋白，其中蛋白表达导致修饰的细胞对抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)较不敏感。在一些方面，修饰的细胞包含由基因工程产生的增强的cd16t、cd32t或cd64t蛋白水平。在其他方面，细胞选自嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、胰岛β细胞、甲状腺细胞、成纤维细胞、肝细胞、心肌细胞和视网膜色素内皮细胞。本发明提供了如本文公开的修饰的细胞，其中所述细胞包含fc受体嵌合体，所述fc受体嵌合体包含不介导fc受体信号传导途径的胞质结构域，并且其中所述胞质结构域促进通过其fc与所述fc受体嵌合体的胞外结构域结合的抗体的内吞作用。在一些方面，胞质结构域来自转铁蛋白受体。在其他方面，转铁蛋白受体是tfr1或tfr2。在优选的方面，fc受体嵌合体包含cd16、cd32或cd64细胞表面结构域和tfr1或tfr2胞质结构域。本发明提供了如本文所公开的修饰的细胞，其中所述细胞表达重组sirpα接合蛋白。在其他方面，sirpα接合蛋白包含免疫球蛋白超家族结构域、抗体fab结构域或单链可变片段(scfv)。在其他方面，sirpα接合蛋白以通过其解离常数(kd)测量的亲和力结合sirpα，其中kd为约10-7至10-13m。在一些方面，本文公开的修饰的细胞包含b2m-/-表型、ciita-/-表型、cd64t和sirpα-接合分子。在其他方面，sirpα-接合蛋白是cd47。在其他方面，细胞是工程化的nk细胞。iv.附图简要说明图1是adcc和cdc的示意图。当igg型的抗体在靶胰岛细胞表面发现抗原时，它会激活nk细胞或补体以通过抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)杀死靶细胞。图2是本发明的一个方面的示意图，其利用隔离抗体而不改变靶细胞生理学的工程化的fc受体。截短或修饰的cd16、cd32或cd64编码序列(cds)缺乏功能性细胞内信号传导结构域。显示了根据uniprot的蛋白结构域。示出了用于截短或修饰的胞质结构域。图3显示截短的cd64(cd64t)捕获游离igg fc而不在靶细胞中诱导任何信号传导。图4a和4b。图4a显示野生型(wt)人iec表达全长cd64。图4b显示这些iec以浓度依赖性方式捕获阿仑单抗fc。图5a和5b。表达cd64t的野生型(wt)人iec类似地以浓度依赖性方式捕获阿仑单抗fc。图5a显示了wt iec上的cd64t表达。图5b显示iec以浓度依赖性方式捕获阿仑单抗fc。图6a和6b显示了人hip iec上cd64表达的流式细胞术直方图(图6a)。使用阿仑单抗评估游离igg1fc的结合，阿仑单抗是一种在hip iec上没有特异性结合位点的抗cd52抗体。在测试的整个浓度范围内没有igg1fc结合(图6b)。图7a和7b显示经转导以表达cd64转基因的人hip iec上的cd64表达的流式细胞术直方图(hip iecscd64，图7a)。使用阿仑单抗评估游离igg1fc的结合，阿仑单抗是一种在hipiecscd64上没有特异性结合位点的抗cd52抗体。存在igg1的浓度依赖性结合(图7b)。由于不存在fab结合表位，因此这种结合必须通过fc和cd64进行。图8a和8b显示经转导以表达cd64t转基因的人hip iec上的cd64t表达的流式细胞术直方图(hip iecscd64t，图8a)。存在igg1的浓度依赖性结合(图8b)。由于没有fab结合表位，因此这种结合必须通过fc和cd64t进行。图9显示了经转导以表达cd52(其是人抗cd52igg1抗体阿仑单抗的靶表位)的hipiec。hip ieccd52在阻抗nk细胞adcc测定中用不同的阿仑单抗浓度进行攻击，并以浓度依赖性方式被杀死(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图10显示了在阻抗cdc测定中用不同阿仑单抗浓度攻击的hip ieccd52。hip ieccd52以浓度依赖性方式被杀死(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图11显示了经转导以表达cd52(其是人抗cd52igg1抗体阿仑单抗的靶表位)以及cd64t的hip iec。hip ieccd52,cd64t在阻抗nk细胞adcc测定中用不同阿仑单抗浓度攻击，并且完全抵抗杀伤(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图12显示了在阻抗cdc测定中用不同的阿仑单抗浓度攻击的hip ieccd52,cd64t。hipieccd52,cd64t完全抵抗杀伤(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图13a和13b显示了人甲状腺epicstpo(a)和epicstpo,cd64t(b)上甲状腺过氧化物酶(tpo)和cd64t表达的代表性流式细胞术直方图。图14a和14b显示游离igg1fc(阿仑单抗，其在甲状腺epics上没有fab结合位点)在人甲状腺epicstpo(图14a)和epicstpo,cd64t(图14b)上的结合的代表性流式细胞术直方图。只有epicstpo,cd64t能够结合igg1。图15a和15b显示在elisa测定中测量的epicstpo(图15a)和epicstpo,cd64t(图15b)的甲状腺素产生。在存在或不存在1μg/ml抗cd52igg1抗体的情况下，甲状腺素的产生没有差异(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图16.体外表达甲状腺过氧化物酶(tpo)的人甲状腺上皮细胞(epics)通过nk细胞adcc经历递增浓度的抗tpo抗体下抗体介导的排斥反应(amr)(上排)。另外表达cd64t的人甲状腺epic在所有抗体浓度下均受到保护以免受adcc影响(下排)。图17显示了使用不同浓度的抗tpoigg1抗体的阻抗nk细胞adcc测定中的人甲状腺epicstpo。甲状腺epicstpo以浓度依赖性方式被杀死(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图18显示了使用不同浓度的抗tpoigg1抗体的阻抗cdc测定中的人甲状腺epicstpo。甲状腺epicstpo以浓度依赖性方式被杀死(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图19显示了使用不同浓度的抗tpoigg1抗体的阻抗nk细胞adcc测定中的人甲状腺epicstpo,cd64t。甲状腺epicstpo,cd64t受到完全保护以免受杀伤(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图20显示了使用不同浓度的抗tpoigg1抗体的阻抗cdc测定中的人甲状腺epicstpo。甲状腺epicstpo,cd64t受到完全保护以免受杀伤(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图21a、21b和21c:在阻抗cdc测定中将人甲状腺epicstpo和epicstpo,cd64t与来自桥本病患者1(图21a)、2(图21b)和3(图21c)的血清一起孵育。这些患者的抗tpo抗体滴度是正常上限(0.03u/ml)的21倍(图21a)、26.3倍(图21b)和29.6倍(图21c)。甲状腺epicstpo在这些测定中被迅速杀死，但epicstpo,cd64t存活并完全不受影响(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图22a、22b和22c：图22a显示体内抗体杀伤测定的实验设置。将总共5×104个人甲状腺epicstpo或epicstpo,cd64t与106个人nk细胞皮下注射到免疫缺陷nsg小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)中。两组均在第0、1和2天接受3次皮下剂量的抗tpo 1mg。跟踪甲状腺epicstpo(图22b)和epicstpo,cd64t(图22c)的bli信号，其显示甲状腺epicstpo移植物迅速消失，而所有epicstpo,cd64t都存活下来(绘制了所有单个动物的图，并且每组显示了一只代表性动物的bli图像)。图23a和23b显示人β细胞(图23a)或表达cd64t的β细胞cd64t(图23b)上的cd64t表达的代表性流式细胞术直方图。β细胞cd64t表现出强cd64t表达。图24a和24b显示游离igg1fc(阿仑单抗)在β细胞(图24a)和β细胞cd64t(图24b)上的结合的流式细胞术直方图。仅β细胞cd64t显示出明显的igg1fc以浓度依赖性方式结合。图25a和25b显示elisa测定中人β细胞(图25a)和β细胞cd64t(图25b)的葡萄糖感测和胰岛素产生。测定在低(2mm)和高(20mm)葡萄糖条件下进行。β细胞和β细胞cd64t在高葡萄糖条件下产生显著更多的胰岛素。葡萄糖感测和胰岛素产生不受1μg/ml抗cd52igg1抗体的存在或不存在的影响(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图26.当用抗hla-a2igg抗体和nk效应细胞攻击时，人胰岛细胞(hla-a2阳性)经历体外抗体介导的杀伤(上排)。经转导以表达cd64t的胰岛细胞在所有抗体浓度下均受到保护以免受抗hla-a2抗体介导的杀伤(下排)。图27显示了在阻抗cdc测定中用不同浓度的抗hla-a2igg1抗体攻击的人β细胞。表达hla-a2的β细胞以浓度依赖性方式被杀死(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图28显示在阻抗cdc测定中用不同浓度的抗hla-a2igg1抗体攻击的人β细胞cd64t。表达hla-a2的β细胞cd64t完全抵抗cdc杀伤(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图29a、29b、29c和29d：图29a显示体内β细胞存活实验的实验设置。将总共5×104个人β细胞或β细胞cd64t与106个人nk细胞皮下注射到nsg小鼠中。两组均在第0、1和2天接受3次皮下1mg剂量的抗hla-a2igg1。跟踪β细胞(图29b)和β细胞cd64t(图29c)的bli信号。所有β细胞移植物在仅2天内就被排斥。所有β细胞cd64t移植物均未受影响并在研究期间存活。作为对照，将5×104个人β细胞在没有nk细胞且没有抗体的情况下皮下注射到nsg小鼠中(图29d)。用抗hla-a2和nk细胞攻击的β细胞cd64t移植物的存活动力学与没有抗体和nk细胞的β细胞移植物的存活动力学没有区别。这表明β细胞cd64t移植物在体内受到完全保护以免受抗体介导的杀伤。绘制所有单个动物的图，并每组显示一只代表性动物的bli图像。图30显示人car-t(a)和car-tcd64t(b)上抗cd19scfv和cd64t表达的代表性流式细胞术直方图。抗cd19scfv抗体特异性识别抗cd19car(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图31a和31b显示游离igg1fc(抗tpoigg1)与car-t细胞(图31a)和car-tcd64t细胞(图31b)的结合的代表性流式细胞术直方图。只有car-tcd64t能够以浓度依赖性方式结合igg1(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图32显示t细胞、car-t细胞和car-tcd64t的cd19+nalm靶细胞杀伤的动力学。杀伤速度表示为细胞指数从1下降到0.5所需的小时数。显示了不同的t细胞与nalm比率(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图33显示在存在和不存在1μg/ml抗cd52的情况下car-tcd64t的cd19+nalm靶细胞杀伤的动力学。杀伤速度表示为细胞指数从1下降到0.5所需的小时数。显示了不同的car-t细胞与nalm比率(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图34显示了使用1μg/ml的针对hla(抗hla-a2)、非hla(抗cd52、抗cd3)、恒河猴血型抗原d(抗rh(d))以及针对car(抗cd19scfv)的抗体的阻抗nk细胞adcc测定中的人car-t细胞(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。在所有抗体的情况下，均非常快速地杀死car-t细胞。图35显示了使用1μg/ml的针对hla(抗hla-a2)、非hla(抗cd52、抗cd3)、恒河猴血型抗原d(抗rh(d))以及针对car(抗cd19scfv)的抗体的阻抗cdc测定中的人car-t细胞(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。同样，在所有抗体的情况下，均非常快速地杀死car-t细胞。图36显示了使用1μg/ml的针对hla(抗hla-a2)、非hla(抗cd52、抗cd3)、恒河猴血型抗原d(抗rh(d))以及针对car(抗cd19scfv)的抗体的阻抗nk细胞adcc测定中的人car-tcd64t细胞(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。car-tcd64t细胞完全抵抗adcc杀伤。图37显示了使用1μg/ml的针对hla(抗hla-a2)、非hla(抗cd52、抗cd3)、恒河猴血型抗原d(抗rh(d))以及针对car(抗cd19scfv)的抗体的阻抗cdc测定中的人car-tcd64t细胞(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。car-tcd64t细胞完全抵抗cdc杀伤。图38a和38b显示人nk细胞(图38a)和nkcd64t细胞(图38b)上cd64t表达的代表性流式细胞术直方图。只有nkcd64t细胞表达cd64t。图39a和39b显示游离的igg1fc(抗tpoigg1)与nk细胞(图39a)和nkcd64t细胞(图39b)的结合的代表性流式细胞术直方图。只有nkcd64t细胞能够以浓度依赖性方式结合igg1。图40显示了在阻抗nk细胞adcc测定中用不同浓度的抗cd52igg1抗体(阿仑单抗)攻击的人nk细胞。表达cd52的nk细胞以浓度依赖性方式被杀死(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图41显示了在阻抗cdc测定中用不同浓度的抗cd52抗体攻击的人nk细胞。表达cd52的nk细胞以浓度依赖性方式被杀死(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图42显示在阻抗nk细胞adcc测定中用不同浓度的抗cd52igg1抗体(阿仑单抗)攻击的人nkcd64t细胞。表达cd52的nkcd64t细胞完全免受adcc杀伤(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。图43显示了在阻抗cdc测定中用不同浓度的抗cd52igg1抗体(阿仑单抗)攻击的人nkcd64t细胞。表达cd52的nkcd64t细胞完全免受cdc杀伤(平均值±sd，每组和时间点三个独立重复)。v.发明详述a.介绍本发明首次提供了包含截短的cd16、cd32或cd64表达的细胞，以逃避抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)，同时消除细胞内信号传导。细胞可以是原代细胞或多能细胞，包括低免疫原性多能细胞(hip)或abo血型o恒河猴因子阴性hip细胞(hipo-)，其进一步包含增强的cd64表达。所述细胞还可以是用于治疗疾病或修复受损组织的胰岛细胞、甲状腺细胞、嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、ilc、内皮细胞、多巴胺能神经元、心肌细胞或视网膜色素内皮细胞。实体器官移植后抗体介导的排斥反应(amr)于1997年首次被发现作为一种独特的临床病理学实体。几十年后，细胞排斥的概念被广泛接受，并为肾、心、肺、肝和胰腺移植开发了标准化命名法和诊断标准。amr的一个标志是移植物特异性抗体的存在以及移植物损伤。当抗体通过其fab区域与细胞上的hla或非hla抗原结合时，fc被nk细胞(主要通过其cd16受体)结合，并在移植环境中介导抗体介导的细胞毒性(adcc)或amr。补体还可以与fc结合并激活其级联并形成膜攻击复合物(mac)用于cdc杀伤(图1)。存在抗体可以针对的三层抗原。在移植环境中首先也是最相关的是人白细胞抗原(hla)，它是对于t细胞激活至关重要的最具多态性的组织相容性复合物。具有针对其移植物的抗体的患者始终显示在各个器官系统中具有较差的移植物存活率。其次是高度多态性的非hla抗原，例如i类mhc相关序列a(mica)，其是一种在人hla基因内编码的细胞表面糖蛋白(glycol-protein)。它不与β2-微球蛋白结合，也不呈递肽。抗mica抗体与实体器官移植中的加速移植失败相关。mica多态性和在胰岛细胞上的表达与1型糖尿病(t1dm)相关。第三，实体器官移植后产生的针对细胞类型特异性表面抗原的抗体介导amr。尽管使用了有效的全身免疫抑制，这些amr反应仍在移植接受者中发生。在一些自身免疫性疾病中，自身抗体引起或增强靶细胞的破坏，并作为疾病的一部分持续存在。患有自身免疫性甲状腺炎或1型糖尿病(t1dm)的患者分别具有抗甲状腺上皮细胞或抗β细胞抗体的高流行率，并且其可能持续多年。在免疫活性患者中使用长期良性再生方法进行细胞移植的患者最终可能经历某种形式的抗体介导的免疫攻击，具体取决于细胞来源和所治疗的疾病。甲状腺细胞和胰岛细胞表达所有三层抗原，并且最容易对所有形式的amr均受到伤害。因此，这些细胞类型例证了本文公开的抗体逃避技术。考虑了其他细胞类型，包括同种异体人胚胎干细胞衍生的心脏祖细胞和间充质基质细胞衍生物。本发明提供了一种基因编辑策略，其有效保护移植的细胞例如胰岛细胞和甲状腺细胞免受amr的影响。它建立针对抗hla、非hla和细胞类型特异性抗原的抗体的保护。在一些实施方案中，其与额外的低免疫编辑组合以沉默细胞排斥。本发明提供了基于hip概念构建并利用非免疫原性成分的抗体抗性。微生物igg降解酶的全身使用已成功用于消除高度致敏患者中在其肾移植前的总igg和hla抗体(jordan,s.c.等人,n engl j med377,442-453(2017))。最近，这种肽链内切酶被证明裂解与靶细胞结合的igg(peraro,l.等人,mol ther(2021))。然而，针对这些细菌酶的预先存在的抗体在健康人群中广泛存在(akesson,p.等人,j infect dis189,797-804(2004))。它们在链球菌感染期间激增(lei,b.等人,nat med 7,1298-1305(2001)；okamoto,s.等人,vaccine 23,4852-4859(2005))，并且其本身可能增加不想要的免疫原性。人cd64及其截短形式cd64t不具有免疫原性，对igg具有高亲和力(bruhns,p.等人,blood 113,3716-3725(2009))，并且针对几种翻译相关细胞类型中的抗体杀伤非常有效。本发明将该技术应用于再生细胞治疗，特别是用于具有潜在自身免疫成分的疾病，其中存在会破坏移植的细胞的抗体。如果不规避自身免疫，再生细胞疗法将像天然细胞一样被破坏(hollenberg,a.n.等人,mol cell endocrinol 445,35-41(2017))。本发明显示，表达甲状腺过氧化物酶(tpo)和cd64(epicstpo,cd64t)的工程化上皮细胞(epc)受到保护以免受临床相关的抗tpo杀伤的影响。在针对i型糖尿病患者进行的临床试验中的当前干细胞衍生的胰岛细胞目前是由胚胎干细胞产生的(melton,d.the promiseof stemcell-derived islet replacement therapy.diabetologia 64,1030-1036(2021))。它们被移植到hla不匹配的地方。尽管使用封装策略来保护胰岛细胞免受宿主免疫系统的影响，但是，已经观察到针对微封装的移植细胞的抗体。(desai,t.&shea,l.d.,nat rev drug discov 16,338-350(2017)；duvivier-kali等人,am j transplant 4,1991-2000(2004))。cd64t在人β细胞上的强制过度表达足以保护它们免受抗hla adcc和cdc的影响。car-t细胞疗法的大部分成功是使用b细胞肿瘤获得的，其中患者接受淋巴细胞毒性药物治疗，并且car-t细胞直接靶向抗体产生的来源(brudno,j.n.&kochenderfer,j.n.,nat rev clin oncol 15,31-46(2018))。然而，抗体诱导仍然定期观察到(till,b.g.等人,blood112,2261-2271(2008))。针对car-t细胞的抗体反应已被证明阻止car-t细胞在重新输注时扩增(peraro,l.等人,incorporation of bacterial immunoevasins to protectcell therapies from host antibody-mediated immune rejection.mol ther(2021))并阻碍持久性。car-t细胞上cd64t的表达使其能够抵抗抗car-t细胞抗体，而不影响其特异性杀伤能力。由于早期免疫清除在非b细胞癌症中更为常见，因此car-tcd64t对于这些适应症可能更有效。fc隔离机制可靠地在多种细胞类型中建立针对抗体的保护，并进一步推进同种异体再生和免疫肿瘤细胞治疗的免疫逃避概念。(参见wo2021076427，其全部内容通过引用并入本文)。cd64是能够捕获游离血清igg的高亲和力人igg受体fcγri。为了实现针对amr的抵抗，利用了cd64的fc结合能力。然而，为了避免工程化细胞因不想要的细胞内信号传导而改变，本发明在不能诱导细胞内信号传导的细胞上提供了截短形式的cd64(cd64t)。在将cd64编码序列(cds)克隆到慢病毒中以用于在多能细胞中表达之前，将其中的细胞内尾部切断。cd64t捕获游离igg fc，而不诱导下游信号传导(图3)。这项技术的一个具体适应症是自身免疫疾病的细胞治疗。抗自体表位的抗体在1型糖尿病中引起β细胞死亡，在自身免疫性甲状腺炎中引起甲状腺细胞死亡。抗体可与ii类hla分子结合。另外，还描述了不依赖于hla的抗体。如果用于再生疗法的细胞具有相同的表位，其也会被这些抗体结合并被杀死。本发明的cd64隔离防止了adcc和cdc。在本发明的一些实施方案中，对低免疫原性多能(“hip”)细胞进行修饰以表达cd16t、cd32t或cd64t(hip/cd16t、hip/cd32t或hip/cd64t细胞)。由于本文概述的几种遗传操作，hip细胞避免了宿主免疫反应。所述细胞缺乏引发免疫反应的主要免疫抗原，并被工程改造成避免吞噬作用和nk细胞杀伤。在一些实施方案中，通过消除诱导多能干细胞(ipsc)中b2m基因的两个等位基因的活性；消除ipsc中ciita基因的两个等位基因的活性；以及增加ipsc中cd47的表达来制备hip细胞。在wo2018132783(通过引用以其整体并入本文)中详细描述了hip细胞。在其他实施方案中，hip细胞表达如pct/us2021/062008中公开的sirpα接合蛋白分子，该专利通过引用以其整体并入本文。在本发明的其它实施方案中，对低免疫原性多能o血型rh-(“hipo-”)细胞进行修饰以表达cd16t、cd32t或cd64t(hipo-/cd16t细胞、hipo-/cd32t或hipo-/cd64t细胞)。由于本文概述的几种遗传或酶促操作，hipo-细胞避免了宿主免疫反应。所述细胞缺乏引发免疫反应的主要血型和免疫抗原，并被工程改造成避免排斥、吞噬或杀伤。这允许衍生用于产生特定组织和器官的“现成”细胞产品。能够在人患者中使用人同种异体hipo-细胞及其衍生物的益处提供了显著的益处，包括避免在同种异体移植中常见的长期辅助免疫抑制疗法和药物的能力。它们还提供了显著的成本节约，因为可以使用细胞疗法而不需要对每个患者进行单独治疗。hipo-/cd16、hipo-/cd32或hipo-/cd64细胞可作为通用细胞来源，用于产生普遍可接受的衍生物。hipo-细胞在美国临时申请第62/846,399号和第62.855,499号中有详细描述，所述专利的每一项通过引用以其整体并入本文。b.定义术语“多能细胞”(pluripotent cell)是指能够自我更新和增殖同时保持未分化状态，并且能够在适当的条件下被诱导分化成特化细胞类型的细胞。如本文中所用，术语“多能细胞”涵盖胚胎干细胞和其它类型的干细胞，包括胎儿、羊膜或体细胞干细胞。示例性的人干细胞系包括h9人胚胎干细胞系。其它示例性的干细胞系包括可通过国立卫生研究院人胚胎干细胞登记处和霍华德休斯医学研究所hues保藏中心(如cowan,c.a.等人,newengland j.med.350:13.(2004)中所述，通过引用以其整体并入本文)获得的那些干细胞系。如本文中所用，“多能干细胞”具有分化成三种胚层：内胚层(例如胃粘膜、胃肠道、肺等)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)中的任一种的潜力。如本文中所用，术语“多能干细胞”还涵盖“诱导多能干细胞”，或“ipsc”，一种衍生自非多能细胞的多能干细胞类型。亲代细胞的实例包括已被通过各种方式重新编程以诱导多能未分化表型的体细胞。此类“ips”或“ipsc”细胞可以通过诱导某些调节基因的表达或通过某些蛋白质的外源应用来产生。诱导ips细胞的方法是本领域已知的，并将在下文中进一步描述。(参见，例如，zhou等人,stem cells 27(11):2667-74(2009)；huangfu等人,nature biotechnol.26(7):795(2008)；woltjen等人,nature 458(7239):766-770(2009)；和zhou等人,cell stem cell8:381-384(2009)；所述文献中的每一篇均通过引用以其整体并入本文)。诱导多能干细胞(ipsc)的产生概述如下。如本文中所用，“hipsc”是人诱导多能干细胞，“mipsc”是鼠诱导多能干细胞。“多能干细胞特征”是指将多能干细胞与其它细胞区分开来的细胞特征。产生能够在适当条件下分化成集体地展示与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞特征。分子标志物的某些组合的表达或不表达也是多能干细胞的特征。例如，人多能干细胞表达至少几种，在一些实施方案中，表达所有来自以下非限制性列表的标志物：ssea-3、ssea-4、tra-1-60、tra-1-81、tra-2-49/6e、alp、sox2、e-钙粘蛋白、utf-1、oct4、rex1和nanog。与多能干细胞相关的细胞形态也是多能干细胞的特征。如本文中所述，细胞不需要通过多能性被重编程为内胚层祖细胞和/或肝细胞。如本文中所用，“多能”(multipotent)或“多能细胞”是指能够产生有限数量的其它特定细胞类型的细胞类型。例如，诱导多能细胞能够形成内胚层细胞。另外，多能血液干细胞可以将自身分化成几种类型的血细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞等。如本文中所用，术语“寡能”(oligopotent)是指成体干细胞分化成仅几种不同细胞类型的能力。例如，淋巴样或骨髓样干细胞能够分别形成淋巴样或骨髓样谱系的细胞。如本文中所用，术语“单能”(unipotent)是指细胞形成单一细胞类型的能力。例如，精原干细胞只能形成精子。如本文中所用，术语“全能”(totipotent)是指细胞形成完整生物体的能力。例如，在哺乳动物中，只有受精卵和第一卵裂期卵裂球是全能的。如本文中所用，“非多能细胞”是指不是多能细胞的哺乳动物细胞。此类细胞的实例包括分化细胞以及祖细胞。分化细胞的实例包括但不限于来自选自骨髓、皮肤、骨骼肌、脂肪组织和外周血的组织的细胞。示例性的细胞类型包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、成肌细胞、神经元、成骨细胞、破骨细胞和t细胞。用于产生诱导多能细胞、内胚层祖细胞和肝细胞的起始细胞可以是非多能细胞。分化细胞包括但不限于多能细胞、寡能细胞、单能细胞、祖细胞和终末分化细胞。在特定的实施方案中，相对于更强效(more potent)的细胞，效力较弱(less potent)的细胞被认为是“分化的”。“体细胞”是形成生物体的机体的细胞。体细胞包括构成生物体中的器官、皮肤、血液、骨骼和结缔组织的细胞，但不包括生殖细胞。细胞可以来自例如人或非人哺乳动物。示例性的非人哺乳动物包括、但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、绵羊、猪、马、牛和非人灵长类动物。在一些实施方案中，细胞来自成年人或非人哺乳动物。在一些实施方案中，细胞来自人新生儿、成年人或非人哺乳动物。如本文中所用，术语“受试者”或“患者”是指任何动物，诸如驯养动物、动物园动物或人。“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，如狗、猫、鸟、牲畜或人。“受试者”和“患者”的具体实例包括但不限于患有与肝、心脏、肺、肾、胰腺、脑、神经组织、血液、骨、骨髓等相关的疾病或病症的个体(尤其是人)。哺乳动物细胞可以来自人或非人哺乳动物。示例性的非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、绵羊、猪、马、牛和非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴和猿)。本文中的“低免疫原性多能”细胞或“hip”细胞是指保留其多能特性，但当转移到同种异体宿主中时引起降低的免疫排斥反应的多能细胞。在优选实施方案中，hip细胞不会引起免疫反应。因此，“低免疫原性”是指与本文概述的免疫工程之前的亲代(即“wt”)细胞的免疫反应相比，显著降低或消除的免疫反应。在许多情况下，hip细胞是免疫沉默的，但仍保留多能能力。在下文中概述了hip特征的测定。本文中的“hip/cd16t”、“hip/cd32t”或“hip/cd64t”细胞是指在细胞表面上分别具有截短的cd16、cd32或cd64蛋白的hip细胞。截短去除了细胞内信号传导结构域。在替代实施方案中，信号传导结构域没有被截短，而是被修饰以消除信号传导功能。此类修饰可以是氨基酸取代或内部缺失。“低免疫原性多能细胞o-”、“低免疫原性多能orh-”细胞或“hipo-”细胞在本文中意指也是abo血型o和恒河猴因子rh-的hipo-细胞。hipo-细胞可能是由o-细胞产生的，经酶促修饰成为o-，或经基因工程改造成为o-。本文中的“hipo-/cd16t”、“hipo-/cd32t”或“hipo-/cd64t”细胞是指在细胞表面上分别具有截短的cd16、cd32或cd64蛋白的hipo-细胞。截短去除了细胞内信号传导结构域。在一个替代实施方案中，信号传导结构域没有被截短，而是被突变以消除信号传导功能。“hla”或“人白细胞抗原”复合物是编码人中的主要组织相容性复合物(mhc)蛋白的基因复合物。这些构成hla复合物的细胞表面蛋白质负责调节对抗原的免疫反应。在人中，有两种mhc，i类和ii类(“hla-i”和“hla-ii”)。hla-i包括三种蛋白质，hla-a、hla-b和hla-c，它们呈递来自细胞内部的肽，hla-i复合物呈递的抗原吸引杀伤t细胞(也称为cd8+t细胞或细胞毒性t细胞)。hla-i蛋白与β-2微球蛋白(b2m)缔合。hla-ii包括五种蛋白，hla-dp、hla-dm、hla-dob、hla-dq和hla-dr，它们将抗原从细胞外呈递到t淋巴细胞。这刺激了cd4+细胞(也称为t辅助细胞)。应当理解，使用“mhc”或“hla”并不意味着是限制性的，因为这取决于基因来自人(hla)还是来自鼠(mhc)。因此，当涉及哺乳动物细胞时，这些术语在本文中可以互换使用。本文中的“基因敲除”意指使特定基因在其所驻留的宿主细胞中失活，导致不产生目标蛋白或导致失活形式。正如本领域技术人员所理解的和下面进一步描述的，这可以通过许多不同的方式实现，包括从基因中去除核酸序列，或者用其它序列中断该序列，改变阅读框架，或者改变核酸的调控组分。例如，可以去除目标基因的编码区的全部或部分或者用“无意义”序列替换其，可以去除或替换调控序列诸如启动子的全部或部分，可以去除或替换翻译起始序列，等等。本文中的“基因敲入”是指向宿主细胞添加遗传功能的过程。这导致编码的蛋白质的水平升高。如本领域技术人员所理解的，这可以通过几种方式实现，包括向宿主细胞中添加一个或多个额外的基因拷贝，或者改变内源基因的调控组分，从而增加所述蛋白质的表达。这可通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子或修饰其它基因表达序列来实现。“β-2微球蛋白”或“β2m”或“b2m”蛋白是指具有下面所示的氨基酸和核酸序列的人β2m蛋白；该人基因的登录号为nc_000015.10:44711487-44718159。“cd47蛋白”蛋白是指具有如下所示的氨基酸和核酸序列的人cd47蛋白；人基因的登录号为nc_000016.10:10866208-10941562。cd47是sirpα的配体(“sirpα接合蛋白”分子)。cd47是一种“自我标记”蛋白，其可以在多种肿瘤类型中广泛过度表达。它正在成为癌症免疫治疗的新型有效巨噬细胞免疫检查点。肿瘤细胞中的cd47发出“别吃我”的信号，其抑制巨噬细胞的吞噬作用。“ciita蛋白”蛋白是指具有如下所示的氨基酸和核酸序列的人ciita蛋白；该人基因的登录号为nc_000003.12:108043094-108094200。细胞上下文中的“野生型”是指在自然界中发现的细胞。然而，在多能干细胞的情况下，如本文中所用，其也意指可含有导致多能性的核酸变化但没有经受本发明的基因编辑程序以实现低免疫原性的ipsc。“同基因的”(syngeneic)在本文中指其中存在免疫相容性(例如不产生免疫反应)的细胞移植物与宿主生物的遗传相似性或同一性。本文中的“同种异体”(allogeneic)是指其中产生免疫反应的细胞移植物与宿主生物的遗传差异。本文中的“b2m-/-”意指二倍体细胞在两条染色体上都具有失活的b2m基因。如本文中所述，这可以通过多种方式来完成。本文中的“ciita-/-”是指二倍体细胞在两条染色体上都具有失活的ciita基因。如本文中所述，这可以通过多种方式来完成。本文中的“cd47tg”(代表“转基因”)或“cd47+”)意指宿主细胞表达cd47，在一些情况下通过具有至少一个额外的cd47基因拷贝来实现。“oct多肽”是指转录因子八聚体家族的任何天然存在的成员，或其保持与最密切相关的天然存在的家族成员相比相似(在至少50％、80％或90％活性的范围内)的转录因子活性的变体，或至少包含天然存在的家族成员的dna结合结构域的多肽,并且还可包含转录激活结构域。示例性的oct多肽包括oct-1、oct-2、oct-3/4、oct-6、oct-7、oct-8、oct-9和oct-11。oct3/4(本文称为“oct4”)包含pou结构域(一种在pit-1、oct-1、oct-2和uric-86中保守的150个氨基酸的序列)。(参见，ryan,a.k.&rosenfeld,m.g.,genes dev.11:1207-1225(1997)，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，与天然存在的oct多肽家族成员相比，诸如与上文所列或genbank登录号np-002692.2(人oct4)或np-038661.1(小鼠oct4)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。oct多肽(例如，oct3/4或oct 4)可来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述oct多肽可以是能够有助于在非多能细胞中诱导多能性的多能因子。“klf多肽”是指krüppel样因子(klf)家族的任何天然存在的成员，包含与果蝇胚胎模式调节因子krüppel相似的氨基酸序列的锌指蛋白，或与最密切相关的天然存在的家族成员相比保持相似(在至少50％、80％或90％活性的范围内)转录因子活性的天然存在成员的变体，或至少包含天然存在家族成员的dna结合结构域的多肽，并且还可以包含转录激活结构域。(参见，dang,d.t.,pevsner,j.&yang,v.w.,cell biol.32:1103-1121(2000)，其通过引用以其整体并入本文)。示例性的klf家族成员包括klf1、klf2、klf3、klf-4、klf5、klf6、klf7、klf8、klf9、klf10、klf11、klf12、klf13、klf14、klf15、klf16和klf17。发现klf2和klf-4是能够在小鼠中产生ips细胞的因子，相关基因klf1和klf5也是如此，尽管效率降低。(参见nakagawa等人,nature biotechnology 26:101-106(2007)，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，与天然存在的klf多肽家族成员相比，例如与上文所列或genbank登录号cax16088(小鼠klf4)或cax14962(人klf4)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。klf多肽(例如，klf1、klf4和klf5)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述klf多肽可以是多能性因子。klf4基因或多肽的表达能够有助于在起始细胞或起始细胞群中诱导多能性。“myc多肽”是指myc家族中任何天然存在的成员。(例如，参见adhikary,s.&eilers,m.,nat.rev.mol.cell biol.6:635-645(2005)，其通过引用以其整体并入本文)。其还包括变体，所述变体在与最密切相关的天然存在的家族成员相比时保持相似转录因子活性(即，在至少50％、80％或90％活性的范围内)。其还包括至少包含天然存在的家族成员的dna结合结构域的多肽，并且还可包含转录激活结构域。示例性的myc多肽包括例如c-myc、n-myc和l-myc。在一些实施方案中，与天然存在的myc多肽家族成员相比，诸如与上文所列或诸如genbank登录号caa25015(人myc)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。myc多肽(例如，c-myc)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述myc多肽可以是多能性因子。“sox多肽”是指sry相关hmg-盒(sox)转录因子的任何天然存在的成员，其特征在于存在高迁移率组(high-mobility group，hmg)结构域或其变体，所述变体在与最密切相关的天然存在的家族成员相比时，保持相似的转录因子活性(即在至少50％、80％或90％活性的范围内)。其还包括至少包含天然存在的家族成员的dna结合结构域的多肽，并且还可包含转录激活结构域。(参见例如dang,d.t.等人,int.j.biochem.cell biol.32:1103-1121(2000)，其通过引用以其整体并入本文)。示例性的sox多肽包括例如sox1、sox-2、sox3、sox4、sox5、sox6、sox7、sox8、sox9、sox10、sox11、sox12、sox13、sox14、sox15、sox17、sox18、sox-21和sox30。已显示sox1产生ips细胞的效率与sox2相似，并且还已显示基因sox3、sox15和sox18产生ips细胞，尽管效率略低于sox2。(参见nakagawa,等人,naturebiotechnology 26:101-106(2007)，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，与天然存在的sox多肽家族成员，诸如与上文所列的那些或诸如genbank登录号caa83435(人sox2)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。sox多肽(例如sox1、sox2、sox3、sox15或sox18)可来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述sox多肽可以是多能性因子。如本文中所述，sox2蛋白在ipsc的产生中具有特殊用途。本文中的“分化的低免疫原性多能细胞”或“分化的hip细胞”或“dhip细胞”意指已被工程改造成具有低免疫原性(例如，通过敲除b2m和ciita以及敲入cd47)、然后分化为最终移植入受试者的细胞类型的ips细胞。因此，例如hip细胞可以分化成肝细胞(“dhip肝细胞”)、β-样胰腺细胞或胰岛类器官(“dhipβ细胞”)、内皮细胞(“dhip内皮细胞”)等。平行定义适用于“分化的hip/cd64”和分化的hipo-/cd64细胞。在两种或更多种核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指两种或更多种序列或子序列，当进行比较和比对以获得最大对应性时，它们具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基，如使用下述序列比较算法之一(例如blastp和blastn或本领域技术人员可用的其它算法)或通过目测所测量的。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于被比较序列的区域上，例如在功能结构域上，或者存在于被比较的两个序列的全长上。对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过pearson&lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa 85:2444(1988)的相似性搜索算法，通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group,575science dr.,madison,wis.)，或者通过目测(一般参见ausubel等人，见下文)来进行。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例是blast算法，其描述于altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)中。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”影响生物相关分子的功能或表达。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。它们可以用体外和体内测定靶分子的表达或活性来鉴定。“抑制剂”是例如抑制表达或与靶分子或蛋白质结合的试剂。它们可能部分或全部阻断刺激或者具有蛋白酶抑制剂活性。它们可以降低、减少、阻止或延迟激活，包括使所述靶蛋白的活性失活、脱敏或下调。调节剂可以是靶分子或蛋白质的拮抗剂。“激活剂”是例如诱导或激活靶分子或蛋白质的功能或表达的试剂。它们可以与靶分子结合、刺激、增加、打开、激活或促进靶分子活性。激活剂可以是靶分子或蛋白质的激动剂。“同源物”是在核苷酸序列、肽序列、功能或结构水平上与参考分子相似的生物活性分子。同源物可以包括与参考序列共有一定百分比同一性的序列衍生物。因此，在一个实施方案中，同源或衍生序列共有至少70％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少80％或85％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少95％的序列同一性。在一个更具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。同源或衍生核酸序列也可由它们在高严格杂交条件下保持与参照核酸序列结合的能力来定义。与参考分子具有结构或功能相似性的同系物可以是参考分子的化学衍生物。检测、产生和筛选结构和功能同源物以及衍生物的方法是本领域已知的。“杂交”通常取决于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，变性dna重新退火的能力。探针与可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，较高的相对温度往往会使反应条件更严格，而较低的温度则使反应条件不太严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见ausubel等人,current protocols in molecularbiology,wiley interscience publishers(1995)，所述文献通过引用以其整体并入本文。杂交反应的“严格性”可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是根据探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般来说，较长的探针需要较高的温度来进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。如本文中所定义的，“严格条件”或“高度严格条件”可以通过以下条件来确定：(1)使用低离子强度和高温进行洗涤，例如50℃下的0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺，诸如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mm磷酸钠缓冲液，ph6.5与750mm氯化钠，75mm柠檬酸钠，42℃；或(3)在使用50％甲酰胺、5x ssc(0.75m nacl,0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子dna(50μl/m1)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖的溶液中于42℃过夜杂交，在0.2xssc(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，接着在55℃进行由含有edta的0.1x ssc组成的10分钟高严格性洗涤。在整个本说明书中给出的每一个最大数值限定都旨在包括每一个更小的数值限定，就好像这些更小的数值限定是在本文中明确写出的一样。本说明书中给出的每一个最小数值限定将包括每一个更大的数值限定，就好像这些更大的数值限定在本文中被明确地写出一样。在整个说明书中给出的每个数值范围将包括落入这种更宽数值范围内的每个更窄数值范围，就好像这种更窄数值范围在本文中都被清楚地写出一样。如本文中所用，术语“修饰”是指物理上将经修饰的分子与母体分子区分开的改变。在一个实施方案中，根据本文所述方法制备的cd16、cd32、cd64、cd47、hsvtk、ec-cd或icasp9变体多肽中的氨基酸变化将其与未根据本文所述方法修饰的相应亲本基因或细胞区分开，所述相应亲本诸如野生型蛋白质、天然存在的突变型蛋白质或不包括此类变体多肽的修饰的另一种工程改造的蛋白质。在另一个实施方案中，变体多肽包括一个或多个修饰，其将变体多肽与未修饰的多肽的功能区分开。例如，变体多肽中的氨基酸变化会影响其受体结合分布(receptor binding profile)。在其它实施方案中，变体多肽包含取代、缺失或插入修饰，或其组合。在另一个实施方案中，变体多肽包括一个或多个修饰，与未被修饰的多肽的亲和力相比，所述修饰增加了其对受体的亲和力。在一个实施方案中，变体多肽包括相对于相应的天然或亲代序列的一个或多个取代、插入或缺失。在某些实施方案中，变体多肽包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31-40个、41至50个或者51个或更多个修饰。本文中的“附加型载体”是指可以在细胞的细胞质中存在并自主复制的遗传载体；例如，其未被整合到宿主细胞的基因组dna中。许多附加型载体是本领域已知的，并在下文中描述。基因上下文中的“敲除”是指含有所述敲除的宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物。如本文中所概述的，敲除可以由多种方式导致：去除编码序列的全部或部分，引入移码突变使得不产生功能性蛋白质(截短的或无义序列)，去除或改变调节组分(例如启动子)使得基因不被转录，通过与mrna结合而阻止翻译等。通常，在基因组dna水平上实现敲除，使得细胞的后代也永久地携带所述敲除。基因上下文中的“敲入”是指含有敲入的宿主细胞在细胞中具有更多活性功能蛋白。如本文中所概述的，敲入可以以多种方式进行，通常通过将至少一个拷贝的编码蛋白质的转基因(tg)引入细胞来进行，尽管这也可以通过替换调节组分来进行，例如通过向内源基因添加组成型启动子来进行。一般来说，敲入技术导致额外拷贝的转基因整合到宿主细胞中。vi.本发明的细胞本发明提供了用于产生表达cd16t、cd32t或cd64t的多能细胞的组合物和方法。在本发明的一些方面，细胞将衍生自诱导多能干细胞(ipsc)、o-诱导多能干细胞(ipsco-)、胚胎干细胞(esc)、o-胚胎干细胞(esco-)、低免疫原性多能(hip)细胞、低免疫原性多能o-(hipo-)细胞，或者由其衍生或分化的细胞。在其他方面，细胞是原代细胞，包括基因编辑的原代细胞。本发明的细胞还可以是用于治疗疾病或修复受损组织的胰岛细胞、甲状腺细胞、嵌合抗原受体(car)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、心肌细胞或视网膜色素内皮细胞。a.用于基因改变的方法本发明包括在细胞内或无细胞条件下修饰核酸序列以产生具有cd16t、cd32t或cd64t表达的细胞的方法。示例性技术包括同源重组、敲入、zfn(锌指核酸酶)、talen(转录激活因子样效应物核酸酶)、crispr(成簇的规律间隔短回文重复序列)/cas9和其它位点特异性核酸酶技术。这些技术能使双链dna在所需的位点断裂。这些受控的双链断裂促进了特定基因座位点的同源重组。该过程集中于用核酸内切酶靶向核酸分子诸如染色体的特定序列，所述核酸内切酶识别所述序列并与其结合，并诱导核酸分子的双链断裂。双链断裂可以通过易错的非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)来修复。如本领域技术人员将理解的，许多不同的技术可用于工程改造本发明的多能细胞，以及将ipsc工程改造成为低免疫原性的，如本文所概述的。一般来说，这些技术可以单独使用或组合使用。例如，这些技术可用于产生表达fc受体的细胞，其中受体被截短以去除一些或全部细胞质信号传导结构域。或者，可以通过缺失、取代或无义突变来修饰该结构域。fc结合后，cd64的胞质尾部与酪氨酸激酶的src相关家族(例如fyn和lyn)和syk家族激酶相互作用。它们磷酸化相关fcrγ链(由其自身基因fcer1g编码)上的被称为免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的细胞质氨基酸基序。这介导免疫细胞的激活。因此，本发明提供了修饰与酪氨酸激酶的src相关家族和syk家族激酶相互作用的胞质尾部以防止fcrγ链itam的激活并因此防止下游信号传导。cd64胞质尾部是来自seq id no：7的以下60个氨基酸：rkelkrkkkwdleisldsghekkvissslqedrhleeelkc qeqkeeqlqegvhrkepqgat在一些实施方案中，fc受体的胞质结构域被交换为具有不同生理学的另一个胞质结构域。例如，转铁蛋白受体的胞质结构域(例如tfr1或tfr2)促进持续的内吞作用，从而导致高受体周转率。因此，在某些实施方案中，fc受体是fc受体胞外结构域和转铁蛋白受体胞质结构域之间的嵌合体。这将促进最初与细胞表面上的fc受体结构域结合的igg抗体的内吞作用和崩解。因此，在优选的实施方案中，本发明的细胞表达包含cd16、cd32或cd64细胞表面结构域和tfr1或tfr2胞质结构域的嵌合体。此外，这些技术可用于hip细胞的产生。crispr可用于减少工程化细胞中活性b2m和/或ciita蛋白的表达，利用病毒技术(例如慢病毒)敲入cd47或其他sirpα-接合蛋白的表达。此外，如本领域技术人员将理解的，尽管一个实施方案顺序地利用crispr步骤敲除b2m，随后利用crispr步骤敲除ciita，最后步骤利用慢病毒敲入cd47或其他sirpα-接合蛋白的表达，这些基因可以使用不同的技术以不同的顺序进行操作。如下文更全面讨论的，通常进行重编程基因的瞬时表达以产生/诱导多能干细胞。a.crispr技术在一个实施方案中，使用本领域已知的成簇的规律间隔短回文重复序列)/cas(“crispr”)技术操作细胞。crispr可用于产生起始ipsc或从ipsc产生hip细胞。有大量基于crispr的技术，参见例如doudna和charpentier，science doi:10.1126/science.1258096，其在此通过引用并入本文。crispr技术和试剂盒在市场上有售。b.talen技术在一些实施方案中，本发明的hip细胞是使用转录激活因子样效应核酸酶(talen)方法制备的。talen是与核酸酶结合的限制性酶，其可被工程改造成与几乎任何所需的dna序列结合并实际将其切割。talen试剂盒在市场上有售。c.锌指技术在一个实施方案中，使用锌指核酸酶技术操纵细胞。锌指核酸酶是通过将锌指dna结合结构域与dna切割结构域融合而产生的人工限制性酶。锌指结构域可被工程改造成靶向特定的所需dna序列，这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的独特序列。通过利用内源性dna修复机制，这些试剂可用于精确地改变高等生物的基因组，类似于crispr和talen。d.基于病毒的技术有多种可用于产生本发明的hip细胞(以及用于ipcs的最初产生)的病毒技术，包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和仙台病毒载体的使用。下文中描述了用于产生ipsc的附加型载体。e.使用干扰rna下调基因在其它实施方案中，通过rnai技术下调编码hla分子中使用的蛋白质的基因。rna干扰(rnai)是其中rna分子通常通过导致特定mrna分子降解来抑制基因表达的过程。两种类型的rna分子-微小rna(mirna)和小干扰rna(sirna)-是rna干扰的核心。它们与靶mrna分子结合，增强或降低其活性。rnai帮助细胞抵御寄生核酸，诸如来自病毒和转座子的核酸。rnai也影响发育。sdrna分子是一类包含19-21个碱基的引导(反义)链的不对称sirna。它们包含5’磷酸、2’ome或2’f修饰的嘧啶和6个3’位置处的硫代磷酸酯。它们还包含含有3’缀合的甾醇部分、3’位置处的2个磷酸酯和2’ome修饰的嘧啶的有义链。两条链都含有2’ome嘌呤，其中未修饰的嘌呤的连续延伸长度不超过3。sdrna公开于美国专利第8,796,443号中，该专利通过引用以其整体并入本文。对于所有这些技术，使用公知的重组技术来产生本文概述的重组核酸。在某些实施方案中，重组核酸(编码所需多肽，例如cd47，或者编码破坏序列)可以与表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列通常适合于待治疗的宿主细胞和受试者。对于多种宿主细胞，许多类型的合适表达载体和合适的调控序列在本领域是已知的。通常，一个或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。还设想了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，也可以是组合了不止一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体(诸如质粒)上，或者表达构建体可被插入染色体中。在具体的实施方案中，表达载体包括选择标记基因，以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括表达载体，其包含与至少一种调控序列可操作连接的编码变体多肽的核苷酸序列。本文所用的调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。在某些实施方案中，表达载体被设计用于选择待转化的宿主细胞、期望表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、或由载体编码的任何其它蛋白质(诸如抗生素标志物)的表达。合适的哺乳动物启动子的例子包括例如来自下列基因的启动子：仓鼠的泛素/s27a启动子(wo 97/15664)、猿猴空泡病毒40(sv40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-i启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(mmtv)、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(cmv)的早期启动子。其它异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在另外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可从诸如多瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的uk 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(sv40)等病毒的基因组中获得。在另外的实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。sv40的早期和晚期启动子可以方便地以sv40限制性片段的形式获得，该片段还含有sv40病毒的复制起点。fiers等人，nature 273:113-120(1978)。人巨细胞病毒的立即早期启动子以hindiii e限制性片段的形式方便地获得。greenaway,p.j.等人,gene 18:355-360(1982)。前述参考文献通过引用以其整体并入。b.多能细胞的产生本发明提供了从多能细胞产生非免疫原性多能细胞的方法。因此，第一步骤是提供多能干细胞。小鼠和人多能干细胞(通常称为ipsc；鼠细胞的mipsc或人细胞的hipsc)的产生在本领域中是公知的。如本领域技术人员所理解的，有多种不同的产生ipcs的方法。使用四种转录因子oct3/4、sox2、c-myc和klf4的病毒导入，从小鼠胚胎或成体成纤维细胞进行初始诱导；参见takahashi和yamanaka cell 126:663-676(2006)，其在此通过引用以其整体并入，特别是针对其中概述的技术。从那时起，已经开发了许多方法；综述见seki等人,worldj.stem cells 7(1):116-125(2015),以及lakshmipathy和vermuri,编辑,methods inmolecular biology:pluripotent stem cells,methods and protocols,springer2013，这两篇文献在此通过引用以其整体明确地并入，特别是针对用于产生hipsc的方法(参见例如后一参考文献的第3章)。一般来说，ipsc是通过宿主细胞中一种或多种“重编程因子”(通常使用附加型载体引入)的瞬时表达产生的。在这些条件下，少量细胞被诱导成为ipsc(通常，这一步骤的效率较低，因为没有使用选择标记)。一旦细胞被“重新编程”，并成为多能的，它们就失去了一种或多种附加型载体，并利用内源基因产生因子。一种或多种附加型载体的这种丢失导致被称为“零足迹(zero footprint)”细胞的细胞。这是所希望的，因为遗传修饰越少(特别是在宿主细胞的基因组中)越好。因此，所得的hipsc没有永久的遗传修饰是优选的。又如本领域技术人员所理解的，可以使用或已经使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，细胞向多能状态转化的效率下降，“多能性”也会下降，例如，较少的重编程因子可能导致不是完全多能的，而是只能分化成较少的细胞类型的细胞。在一些实施方案中，使用单种重编程因子oct4。在其它实施方案中，使用两种重编程因子oct4和klf4。在其它实施方案中，使用三种重编程因子oct4、klf4和sox2。在其它实施方案中，使用四种重编程因子oct4、klf4、sox2和c-myc。在其它实施方案中，可以使用5、6或7种重编程因子，其选自sokmnlt、sox2、oct4(pou5f1)、klf4、myc、nanog、lin28和sv40l t抗原。通常，这些重编程因子基因在附加型载体(诸如本领域已知的和商购可得的附加型载体)上提供。例如，thermofisher/invitrogen出售用于hipsc的零足迹产生的仙台病毒重编程试剂盒，参见目录号a34546。thermofisher也销售基于ebna的系统，参见目录号a14703。另外，还有许多商购可得的hipsc系；参见例如episomal hipsc系k18945，其为零足迹、无病毒整合的人ipsc细胞系(另见burridge等人，2011，同上)。通常，如本领域已知的，ipsc由诸如cd34+脐带血细胞、成纤维细胞等非多能细胞通过瞬时表达如本文所述的重编程因子而产生。例如，仅使用oct3/4、sox2和klf4，同时省略c-myc，也产生了成功的ipsc，尽管重编程效率降低。一般来说，ipsc的特征在于包括klf4、nanog、oct4、sox2、esrrb、tbx3、c-myc和tcl1在内的某些因子的表达。出于本发明的目的，这些因子的新的或增加的表达可以是通过内源基因座的诱导或调节或者来自转基因的表达。例如，可使用diecke等人,sci rep.2015,jan.28；5:8081(doi:10.1038/srep08081)(在此通过引用以其整体并入，特别是对于用产生mipsc的方法和试剂)的方法来产生小鼠ipsc。还参见，例如，burridge等人,plos one,2011 6(4):18293，其在此通过引用以其整体并入，特别是对于本文概述的方法。在一些情况下，如本文概述的那样测量或确认细胞的多能性，例如通过分析重编程因子或通过如本文和实施例中概述的那样进行分化反应。c.低免疫原性多能(hip)细胞的产生从多能细胞产生hip细胞是在少至三个遗传改变的情况下进行的，所述遗传改变导致细胞活性的最小破坏，但对细胞赋予免疫沉默。如本文中所讨论的，一个实施方案利用mhc i和ii(当细胞是人时，为hla i和ii)的蛋白活性的降低或消除。这可通过改变编码其组分的基因来实现。在一个实施方案中，使用crispr破坏基因的编码区或调控序列。在另一个实施方案中，使用干扰rna技术减少了基因翻译。第三种变化是调节对巨噬细胞吞噬作用的易感性的基因诸如cd47或sirpα-接合蛋白的变化，这通常是使用病毒技术的基因“敲入”。在一些情况下，当crispr被用于遗传修饰时，可以使用含有实现细胞系的高效编辑的cas9构建体的hipsc细胞；参见例如来自life technologies的人附加型cas9ipsc细胞系a33124。1.hla-i减少本发明的hip细胞包括mhc i功能(当细胞衍生自人细胞时为hla i)的降低。如本领域技术人员所理解的，功能的降低可以通过多种方式实现，包括从基因中去除核酸序列，用其它序列中断该序列，或者改变核酸的调控组分。例如，目标基因编码区的全部或部分可被去除或用“无义”序列替换，移码突变可被产生，诸如启动子等调控序列的全部或部分可被去除或替换，翻译起始序列可被去除或替换等。如本领域技术人员所理解的，多能细胞中mhc i功能(当细胞衍生自人细胞时，为hla i)的成功降低可使用本领域已知和如下所述的技术进行测量；例如，使用结合hla复合物的标记的抗体的facs技术；例如，使用与人主要组织相容性i类hla抗原的α链结合的商购可得的hla-a、b、c抗体。a.b2m改变在一个实施方案中，hla-i活性的降低是通过破坏多能干细胞中β-2微球蛋白基因的表达来实现的，本文中公开了所述多能干细胞的人序列。这种改变在本文中通常称为基因“敲除”，在本发明的hip细胞中，这是在宿主细胞的两个等位基因上进行的。一般来说，进行这两种中断的技术是相同的。特别有用的实施方案使用crispr技术来破坏基因。在一些情况下，crispr技术用于将小的缺失/插入引入基因的编码区，使得不产生功能性蛋白质，这通常是移码突变的结果，移码突变导致产生终止密码子，使得产生截短的非功能性蛋白质。因此，有用的技术是使用被设计成靶向小鼠中b2m基因或人中b2m基因的编码序列的crispr序列。基因编辑后，将转染的ipsc培养物解离成单细胞。将单细胞扩增至全尺寸集落，并通过筛选来自crispr切割位点的异常序列的存在来测试crispr编辑。挑选两个等位基因都缺失的克隆。此类克隆不表达b2m，如通过pcr所示的，也不表达hla-i，如通过facs分析所示的(例如参见实施例1和6)。测试b2m基因是否已经失活的测定是已知的，并在本文中有所描述。在一个实施方案中，所述测定是用针对b2m蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)证实了失活改变的存在。另外，可以测试细胞以确认hla i复合物不在细胞表面表达。如上所讨论的，这可以通过使用针对一种或多种hla细胞表面组分的抗体的facs分析来测定。值得注意的是，其他人在试图沉默两个等位基因上的b2m基因时结果不佳。参见例如gornalusse等人,nature biotech.doi/10.1038/nbt.3860)。2.hla-ii减少除了hla i的减少之外，本发明的hip细胞也缺乏mhc ii功能(当细胞衍生自人细胞时为hla ii)。如本领域技术人员所理解的，功能的降低可以通过多种方式实现，包括从基因中去除核酸序列、向基因中添加核酸序列、破坏阅读框架、用其它序列中断该序列或者改变核酸的调控组分。在一个实施方案中，可将目标基因的全部或部分编码区去除或用“无义”序列替代。在另一个实施方案中，可去除或替代调控序列诸如启动子，可去除或替代翻译起始序列，等等。多能细胞或其衍生物中mhc ii功能(当细胞衍生自人细胞时为hla ii)的成功降低可以使用诸如使用针对蛋白质的抗体的蛋白质印迹、facs技术、rt-pcr技术等本领域已知的技术来测量。a.ciita改变在一个实施方案中，hla-ii活性的降低是通过破坏多能干细胞中ciita基因的表达来实现的，所述ciita基因的人序列如本文所示。这种改变在本文中通常称为基因“敲除”。在本发明的hip细胞中，这是在宿主细胞的两个等位基因上进行的。测试ciita基因是否已经失活的测定是已知的，并在本文中有描述。在一个实施方案中，该测定是用针对ciita蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)证实了失活改变的存在。此外，可以测试细胞以确认hla ii复合物不在细胞表面表达。同样，这种测定是按照本领域已知的方法进行的。示例性的分析包括蛋白质印迹或facs分析，其使用与如下所述的与人hla ii类hla-dr、dp和大多数dq抗原结合的商业抗体。一个特别有用的实施方案使用crispr技术来破坏ciita基因。crispr被设计成靶向小鼠的ciita基因或人的ciita基因的编码序列，所述ciita为所有mhc ii分子的必需转录因子。基因编辑后，将转染的ipsc培养物解离成单细胞。将它们扩增至全尺寸菌落并通过筛选来自crispr切割位点的异常序列的存在来测试成功的crispr编辑。具有缺失的克隆不表达ciita(如通过pcr所测定的)并且不表达mhc ii/hla-ii(如通过facs分析所测定的)。3.吞噬作用减少除了hla i和ii(或mhc i和ii)的减少之外，通常使用b2m和ciita敲除，本发明的hip细胞还对巨噬细胞吞噬和nk细胞杀伤的易感性降低。由于一个或多个cd47转基因，产生的hip细胞“逃离”免疫巨噬细胞和先天途径。a.cd47增加在一些实施方案中，巨噬细胞吞噬作用和nk细胞杀伤易感性的降低由hip细胞表面上的cd47增加引起。正如本领域技术人员所理解的，这是通过使用“敲入”或转基因技术以几种方式完成的。在一些情况下，cd47表达的增加由一个或多个cd47转基因引起。因此，在一些实施方案中，在诱导型或组成型启动子(后者是优选的)的控制下，将一个或多个拷贝的cd47基因加入hip细胞。在一些实施方案中，如本文所述或本领域已知的那样，使用慢病毒构建体，cd47基因可以在本领域已知的合适启动子的控制下整合到宿主细胞的基因组中。hip细胞系由b2m-/-ciita-/-ipsc产生。使用杀稻瘟菌素标记选择含有表达cd47的慢病毒载体的细胞。合成cd47基因序列，并将dna克隆到具有杀稻瘟菌素抗性的质粒慢病毒plenti6/v5(thermo fisher scientific，waltham，ma)中。在一些实施方案中，cd47基因的表达可以通过改变内源cd47基因的调控序列(例如，通过将内源启动子替换为组成型启动子或不同的诱导型启动子)来增加。这通常可使用诸如crispr等已知技术来完成。一旦发生改变，可以使用已知的技术，诸如实施例中描述的那些技术，诸如使用抗cd47抗体的蛋白质印迹、elisa测定或facs测定，来测定足够cd47表达的存在。一般来说，本说明书中的“充足性”是指沉默nk细胞杀伤的cd47在hip细胞表面上表达的增加。一旦mhc i被去除，细胞上的天然表达水平太低而不能保护它们免于nk细胞裂解。sirp的参与可以通过工程化分子或替代分子来完成。在本发明的一些方面，接合分子是蛋白质。在其他方面，该蛋白质是融合蛋白。在其他方面，融合蛋白包含cd47胞外结构域(ecd)。在本发明的其他方面，sirp-α接合细胞包含免疫球蛋白超家族结构域。在本发明的其他方面，接合分子包含结合sirpα的抗体fab或单链可变片段(scfv)。在其他方面，fab或scfv以通过其解离常数(kd)测量的亲和力结合sirpα，其中kd为约10-7至10-13m。参见pct/us2021/062008，其通过引用整体并入本文。在本发明的一些方面，接合分子包含结合sirpα的一个或多个抗体互补决定区(cdr)。4.自杀基因在一些实施方案中，本发明提供了包含“自杀基因”或“自杀开关”的低免疫原性多能细胞。它们被整合作为“安全性开关”，如果低免疫原性多能细胞以不期望的方式生长和分裂，则可以引起它们的死亡。“自杀基因”消融方法包括基因转移载体中的自杀基因，该自杀基因编码仅当被特定化合物激活时导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化为高毒性代谢物的酶。结果是特异性地消除表达该酶的细胞。在一些实施方案中，自杀基因是疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因，引发剂是更昔洛韦。在其它实施方案中，自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(ec-cd)基因，引发剂是5-氟胞嘧啶(5-fc)(barese等人,mol.therap.20(10):1932-1943(2012),xu等人,cell res.8:73-8(1998)，这两篇文献都通过引用以其整体并入本文)。在其它实施方案中，自杀基因是可诱导的半胱天冬酶蛋白。诱导型半胱天冬酶蛋白包含至少一部分能够诱导细胞凋亡的半胱天冬酶蛋白。在一个实施方案中，在seq idno：6中举例说明了半胱天冬酶蛋白的一部分。在优选实施方案中，可诱导的半胱天冬酶蛋白是icasp9。其包含具有f36v突变的人fk506结合蛋白fkbp12的序列，通过一系列氨基酸与编码人半胱天冬酶9的基因连接。fkbp12-f36v以高亲和力与小分子二聚剂ap1903结合。因此，本发明中icasp9的自杀功能是通过施用二聚化的化学诱导剂(cid)来触发的。在一些实施方案中，cid是小分子药物ap1903。二聚化导致细胞凋亡的快速诱导。(参见wo2011146862；stasi等人,n.engl.j.med 365；18(2011)；tey等人,biol.blood marrowtransplant.13:913-924(2007)，其每一篇都通过引用以其整体并入本文)。5.cd16t、cd32t或cd64t表达由于cd16t、cd32t或cd64t表达，本发明的细胞对adcc和cdc的易感性降低。所得的细胞由于增加的表达而隔离抗体。在一个实施方案中，细胞包含一种或多种cd16t、cd32t或cd64t转基因。在一些实施方案中，adcc或cdc易感性的降低由细胞表面上cd16t、cd32t或cd64t引起。正如本领域技术人员所理解的，这是使用“敲入”或转基因技术以几种方式完成的。在一些情况下，cd16t、cd32t或cd64t表达由一个或多个转基因引起。因此，在一些实施方案中，将一个或多个拷贝的cd16t、cd32t或cd64t基因加入到受诱导型或组成型启动子(优选后者)控制下的细胞中。在一些实施方案中，如本文所述或本领域已知的那样使用慢病毒构建体。基因可以在本领域已知的合适启动子的控制下整合到宿主细胞的基因组中。使用杀稻瘟菌素标记选择含有表达cd16t、cd32t或cd64t的慢病毒载体的细胞。合成基因序列，并将dna克隆到例如具有杀稻瘟菌素抗性的质粒慢病毒plenti6/v5(thermofisher scientific,waltham,ma)中。在一些实施方案中，可以通过改变与本文所述的截短或突变组合的内源cd16、cd32或cd64基因的调控序列来增加基因的表达。这可以例如通过将内源启动子替换为组成型启动子或不同的诱导型启动子来实现。这通常可使用诸如crispr等已知技术来完成。一旦改变，可以使用已知的技术，诸如实施例中描述的那些技术，诸如使用抗cd16、cd32或cd64抗体的蛋白质印迹、elisa测定或facs测定，来测定足够表达的存在。一般来说，本说明书中的“充足性”是指隔离抗体并抑制adcc或cdc的细胞表面表达的增加。6.hip表型和多能性保持的测定一旦产生了hip细胞，就可以测定它们的低免疫原性和/或多能性的保留，如本文和实施例中通常描述的。例如，使用多种技术测定低免疫原性。一种示例性技术包括移植入同种异体宿主中并监测逃避宿主免疫系统的hip细胞生长(例如畸胎瘤)。对hip衍生物进行转导以表达萤光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对hip细胞的t细胞和/或b细胞反应，以证实hip细胞不会引起宿主动物的免疫反应。t细胞功能通过elispot、elisa、facs、pcr或质谱流式细胞术(cytof)进行评估。使用facs或luminex评估b细胞反应或抗体反应。另外，或者可选择地，可以测定细胞的避免先天免疫反应(例如nk细胞杀伤)的能力。使用本领域已知的技术在体外或体内评估nk细胞溶解活性。类似地，以多种方式测试多能性的保持。在一个实施方案中，如本文一般描述的，通过某些多能性特异性因子的表达来测定多能性。另外或可选择地，hip细胞分化成一种或多种细胞类型作为多能性的指征。d.hipo-cd16t、cd32t或cd64t表达细胞的产生在本发明的一些方面，如上产生的hip细胞将已经是hipo-细胞，因为该过程将始于具有o型血的多能细胞。本发明的其它方面包括a和b抗原的酶促转化。在优选方面，使用酶将b抗原转化为o抗原。在更优选方面，酶是α-半乳糖苷酶。这种酶消除b抗原的末端半乳糖残基。本发明的其它方面包括将a抗原酶促转化为o抗原。在优选方面，使用α-n-乙酰半乳糖胺酶将a抗原转化为o抗原。酶促转化在例如以下文献中进行论述：olsson等人,transfusion clinique etbiologique 11:33-39(2004)；美国专利第4,427,777号、第5,606,042号、第5,633,130号、第5,731,426号、第6,184,017号、第4,609,627号和第5,606,042号；以及国际公布第wo9923210号，每一篇都通过引用以其整体并入本文。本发明的其它实施方案包括通过敲除abo基因外显子7或沉默slc14a1(jk)基因来对细胞进行基因工程改造。本发明的其它实施方案包括敲除rh血型系统(rh)中的c和e抗原、kell血型系统(kel)中的k抗原、duffy血型系统(fy)中的fya和fy3抗原、kidd血型系统(jk)中的jkb抗原或者mns血型系统中的u和s抗原。可以使用本领域已知的或本文中描述的任何敲除方法，诸如crispr、talens或同源重组。e.本发明的优选实施方案本发明的表达cd16t、cd32t或cd64t的hip、hipo-、ipsc、ipsco-、esc或esco-细胞或其衍生物可用于治疗例如1型糖尿病、心脏病、神经病学疾病、癌症、失明、血管疾病和其它对再生医学疗法有反应的疾病。特别地，本发明设想了使用细胞分化成任何细胞类型。因此，本文提供了细胞，所述细胞表达cd16t、cd32t或cd64t并表现出多能性，但当作为多能细胞或它们的分化产物移植到同种异体宿主诸如人患者中时，不会导致宿主adcc或cdc反应。此外，cd16、cd32或cd64细胞内信号传导功能因截短或突变而降低或消除。一方面，本发明的细胞包含编码具有cd16t、cd32t或cd64t表达的嵌合抗原受体(car)的核酸。car可包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞外car结构域与选自cd19、cd20、cd22、cd38、cd123、cs1、cd171、bcma、muc16、ror1和wt1的抗原结合。在某些实施方案中，胞外结构域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，car跨膜结构域包含cd3ζ、cd4、cd8α、cd28、4-1bb、ox40、icos、ctla-4、pd-1、lag-3和btla。在某些实施方案中，car胞内信号传导结构域包含cd3ζ、cd28、4-1bb、ox40、icos、ctla-4、pd-1、lag-3和btla。在某些实施方案中，car包含抗cd19scfv结构域、cd28跨膜结构域和cd3ζ信号传导胞内结构域。在一些实施方案中，car包含抗cd19scfv结构域、cd28跨膜结构域、4-1bb信号传导胞内结构域和cd3ζ信号传导胞内结构域。在本发明的另一方面，通过体外分化本文所述的任一种细胞产生表达cd16t、cd32t或cd64t的分离的car-t细胞。在一些实施方案中，细胞是细胞毒性低免疫car-t细胞。在各种实施方案中，体外分化包括在包含一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养携带car构建体的细胞，所述生长因子或细胞因子选自bfgf、epo、flt3l、igf、il-3、il-6、il-15、gm-csf、scf和vegf。在一些实施方案中，培养基还包含选自bmp激活剂、gsk3抑制剂、rock抑制剂、tgfβ受体/alk抑制剂和notch激活剂的一种或多种。在特定的实施方案中，通过体外分化产生的本发明的分离的car-t细胞被用作癌症的治疗。在本发明的另一方面，提供了通过施用包含治疗有效量的本文所述的任何分离的car-t细胞的组合物来治疗癌症患者的方法。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，施用步骤包括静脉内施用、皮下施用、结内施用、瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用和腹膜内施用。在某些情况下，施用还包括推注或连续输注。在一些实施方案中，癌症是选自白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血癌。在各种实施方案中，癌症是实体瘤癌症或液体瘤癌症。另一方面，本发明提供了制备本文所述的分离的car-t/cd16t、cd32t或cd64t细胞中的任一种的方法。所述方法包括体外分化本发明的任一种细胞，其中体外分化包括在包含一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养它们，所述生长因子或细胞因子选自bfgf、epo、flt3l、igf、il-2、il-3、il-6、il-7、il-15、gm-csf、scf和vegf。在一些实施方案中，培养基还包含选自bmp激活剂、gsk3抑制剂、rock抑制剂、tgfβ受体/alk抑制剂和notch激活剂的一种或多种。在一些实施方案中，体外分化包括在饲养细胞上培养hipo-细胞。在其他实施方式中，体外分化包括在模拟微重力下进行培养。在某些情况下，在模拟微重力下培养至少72小时。在一些方面，本文提供了从表达cd16t、cd32t或cd64t的细胞分化的分离的、工程改造的低免疫心脏细胞(低免疫原性心脏细胞)。在一些方面，本文提供了治疗患有心疾患或心脏病的患者的方法。所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的任一种分离的、工程改造的低免疫心脏细胞的群体，所述细胞衍生自本文所述的本发明的细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，施用包括植入患者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。在一些实施方案中，心脏病况或疾病选自儿童心肌病、年龄相关性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎性心肌病、其它心肌病、心肌炎、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏、动脉炎症或心血管疾病。在一些方面，本文提供了通过体外分化从hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞的群体产生低免疫心脏细胞群的方法，其中内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，而cd47或另一种sirpα接合蛋白在hipo-细胞中的表达增加。所述方法包括：(a)在包含gsk抑制剂的培养基中培养hipo-细胞群；(b)在包含wnt拮抗剂的培养基中培养hipo-细胞群，以产生前心脏细胞群；以及(c)在包含胰岛素的培养基中培养前心脏细胞群，以产生低免疫心脏细胞群。在一些实施方案中，gsk抑制剂是chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，gsk抑制剂的浓度范围为约2μm至约10μm。在一些实施方案中，wnt拮抗剂是iwr1、其衍生物或其变体。在一些情况下，wnt拮抗剂的浓度范围为约2μm至约10μm。在一些方面，本文提供了从hipo-细胞分化的分离的、工程改造的过表达cd16、cd32或cd64的内皮细胞。在其它方面，本发明的分离的工程改造的内皮细胞选自毛细血管内皮细胞、血管内皮细胞、主动脉内皮细胞、脑内皮细胞和肾内皮细胞。在一些方面，本文提供了治疗患有血管病况或疾病的患者的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用包含治疗有效量的本发明的分离的工程改造的内皮细胞群的组合物。所述方法包括施用包含治疗有效量的本文所述的任一种分离的、工程改造的过表达cd16、cd32或cd64的内皮细胞群的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含治疗有效的运载体或赋形剂。在一些实施方案中，施用包括植入患者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。在一些实施方案中，所述血管病况或疾病选自血管损伤、心血管疾病、血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、高血压、缺血性组织损伤、肢体缺血、中风、神经病和脑血管疾病。在一些方面，本文提供了通过体外分化从表达cd16t、cd32t或cd64t的细胞群产生低免疫内皮细胞群的方法，其中内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，并且hipo-细胞中cd47表达增加。所述方法包括：(a)在包含gsk抑制剂的第一培养基中培养hipo-细胞群；(b)在包含vegf和bfgf的第二培养基中培养hipo-细胞群，以产生前内皮细胞群；以及(c)在包含rock抑制剂和alk抑制剂的第三培养基中培养前内皮细胞群，以产生低免疫内皮细胞群。在一些实施方案中，gsk抑制剂是chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，gsk抑制剂的浓度范围为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，rock抑制剂为y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，rock抑制剂的浓度范围为约1μm至约20μm。在一些实施方案中，alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，alk抑制剂的浓度范围为约0.5μm至约10μm。在一些实施方案中，第一培养基包含2μm至约10μm的chir-99021。在一些实施方案中，第二培养基包含50ng/ml vegf和10ng/ml bfgf。在其它实施方案中，第二培养基还包含y-27632和sb-431542。在各种实施方案中，第三培养基包含10μm y-27632和1μm sb-431542。在某些实施方案中，第三培养基还包含vegf和bfgf。在特定情况下，第一培养基和/或第二培养基不含胰岛素。在一些方面，本文提供了从表达cd16t、cd32t或cd64t的细胞分化的分离的、工程改造的低免疫多巴胺能神经元(dn)。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，cd47或另一种sirpα接合蛋白表达得以增加，所述神经元是o和rh-血型。在一些实施方案中，所述分离的多巴胺能神经元选自神经元干细胞、神经元祖细胞、未成熟多巴胺能神经元和成熟多巴胺能神经元。在一些方面，本文提供了治疗患有神经变性疾病或病况的患者的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用包含治疗有效量的任一种分离的低免疫多巴胺能神经元群的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，分离的低免疫多巴胺能神经元群在可生物降解的支架上。施用可以包括移植或注射。在一些实施方案中，所述神经变性疾病或病况选自帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症。在一些方面，本文提供了通过体外分化产生表达cd16t、cd32t或cd64t的多巴胺能神经元群的方法。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，cd47或另一种sirpα接合蛋白表达得以增加，血型是o型和rh-型。在一些实施方案中，所述方法包括(a)在包含选自音猬因子(shh)、bdnf、egf、bfgf、fgf8、wnt1、视黄酸、gsk3β抑制剂、alk抑制剂和rock抑制剂的一种或多种因子的第一培养基中培养细胞群，以产生未成熟多巴胺能神经元群；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养所述未成熟多巴胺能神经元群，以产生多巴胺能神经元群体。在一些实施方案中，gskβ抑制剂是chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，gskβ抑制剂的浓度范围为约2μm至约10μm。在一些实施方案中，alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，alk抑制剂的浓度范围为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，所述第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。在一些实施方案中，该方法还包括将低免疫多巴胺能神经元群与非多巴胺能神经元分离。在一些实施方案中，该方法还包括冷冻保存分离的低免疫多巴胺能神经元群。在一些方面，本文提供了从表达cd16t、cd32t或cd64t的细胞分化的分离的工程改造的低免疫胰岛细胞。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，cd47或另一种sirpα接合蛋白表达得到增加，血型是o型和rh-型。在一些实施方案中，分离的低免疫胰岛细胞选自胰岛祖细胞、未成熟胰岛细胞和成熟胰岛细胞。在一些方面，本文提供了治疗糖尿病患者的方法。所述方法包括施用包含治疗有效量的分离的本文所述表达cd16t、cd32t或cd64t的胰岛细胞中任一种的群体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，分离的低免疫胰岛细胞的群体在可生物降解的支架上。在一些情况下，施用包括移植或注射。在一些方面，本文提供了通过体外分化从表达cd16t、cd32t或cd64t的细胞群产生低免疫胰岛细胞群的方法。在一些实施方案中，在hipo-细胞中，内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，cd47或另一种sirpα接合蛋白表达得以增加，血型是o型和rh-型。所述方法包括：(a)在第一培养基中培养表达cd16t、cd32t或cd64t的细胞群以产生未成熟胰岛细胞群，所述第一培养基包含选自胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子(tgf)、成纤维细胞生长因子(egf)、表皮生长因子(egf)、肝细胞生长因子(hgf)、音猬因子(shh)和血管内皮生长因子(vegf)、转化生长因子-β(tgfβ)超家族、骨形态发生蛋白-2(bmp2)、骨形态发生蛋白-7(bmp7)、gsk3β抑制剂、alk抑制剂、bmp 1型受体抑制剂和视黄酸的一种或多种因子；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养未成熟胰岛细胞群，以产生低免疫胰岛细胞群。在一些实施方案中，gsk抑制剂是chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，gsk抑制剂的浓度范围为约2μm至约10μm。在一些实施方案中，alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，alk抑制剂的浓度范围为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。在一些实施方案中，该方法还包括将表达cd16t、cd32t或cd64t的胰岛细胞群与非胰岛细胞分离。在一些实施方案中，该方法还包括冷冻保存分离的低免疫胰岛细胞群。在一些方面，本文提供了从表达cd16t、cd32t或cd64t的细胞分化的分离的、工程改造的低免疫视网膜色素上皮(rpe)细胞，其中内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，cd47或另一种sirpα接合蛋白表达已被增加，血型为o型和rh-型。在一些实施方案中，所述分离的低免疫rpe细胞选自rpe祖细胞、未成熟rpe细胞、成熟rpe细胞和功能性rpe细胞。在一些方面，本文提供了治疗患有眼部病况的患者的方法。所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的本文所述分离的表达cd16t、cd32t或cd64t的rpe细胞群体中的任一种的群体。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，分离的低免疫rpe细胞群在可生物降解的支架上。在一些实施方案中，施用包括对患者视网膜的移植或注射。在一些实施方案中，所述眼部病况选自湿性黄斑变性、干性黄斑变性、青少年性黄斑变性、莱伯氏先天性混浊、色素性视网膜炎和视网膜脱落。在一些方面，本文提供了通过体外分化从细胞群产生表达cd16t、cd32t或cd64t的视网膜色素上皮(rpe)细胞群的方法。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源性ii类反式激活因子(ciita)基因活性已被消除，并且cd47或另一种sirpα接合蛋白表达在hipo-细胞中得以增加。所述方法包括：(a)在包含选自激活素a、bfgf、bmp4/7、dkk1、igf1、头蛋白(noggin)、bmp抑制剂、alk抑制剂、rock抑制剂和vegfr抑制剂的任一种因子的第一培养基中培养hipo-细胞群，以产生前rpe细胞群；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养前rpe细胞群，以产生低免疫rpe细胞群。在一些实施方案中，alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，alk抑制剂的浓度范围为约2μm至约10μm。在一些实施方案中，rock抑制剂是y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，rock抑制剂的浓度范围为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，所述第一培养基和/或第二培养基缺少动物血清。在一些实施方案中，该方法还包括将低免疫rpe细胞群与非rpe细胞分离。在一些实施方案中，该方法还包括冷冻保存分离的低免疫rpe细胞群。在一个方面，人多能干细胞(psc)通过cd16t、cd32t或cd64t表达抵抗adcc或cdc。在一些实施方案中，它们是低免疫多能干细胞(hipsc)。通过a)破坏每个等位基因处的b2m基因(例如b2m-/-)，b)破坏每个等位基因处的ciita基因(例如ciita-/-)，以及c)通过cd47基因的过表达(cd47+，例如通过引入一个或多个额外拷贝的cd47基因或激活基因组基因)，使它们具有低免疫原性。这使得hipsc群成为b2m-/-ciita-/-cd47tg。在一个优选方面，所述细胞是非免疫原性的。在另一个实施方案中，如上所述，使hip细胞成为非免疫原性b2m-/-ciita-/-cd47tg，并通过包括诱导型自杀基因而被进一步修饰，当需要时该诱导型自杀基因被诱导在体内杀死细胞。在其它方面，当通过敲除abo基因外显子7或沉默slc14a1(jk)基因使hip细胞成为o型血，并通过敲除rh血型系统(rh)的c和e抗原、kell血型系统(kel)中的k抗原、duffy血型系统(fy)中的fya和fy3抗原、kidd血型系统(jk)中的jkb抗原或mns血型系统中的u和s抗原使细胞成为rh-型血时，产生了过表达cd16、cd32或cd64的hipo细胞。f.hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞的维持一旦产生，就可以如维持ipsc的状态所知的那样将hipo-cd16t、cd32t或cd64t细胞维持在未分化状态。例如，使用防止分化和保持多能性的培养基在基质胶上培养hip细胞。g.hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞的分化本发明提供了分化成不同细胞类型以用于随后移植入受试者的hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞。如本领域技术人员所理解的，分化方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。将细胞在悬浮液中分化，然后置于凝胶基质形式(诸如基质凝胶、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式)中，以促进细胞存活。如本领域已知的那样，通常通过评估细胞特异性标志物的存在来测定分化。在一些实施方案中，将hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞分化成肝细胞，以解决肝细胞功能丧失或肝硬化。有许多技术可用于将hipo-细胞分化成肝细胞；参见例如pettinato等人,doi:10.1038/spre32888,snykers等人,methods mol biol 698:305-314(2011),si-tayeb等人,hepatology 51:297-305(2010)和asgari等人,stem cell rev(:493-504(2013)，所有这些文献在此通过引用以其整体明确地并入，特别是对于用于分化的方法和试剂。如本领域已知的那样，通常通过评估肝细胞相关和/或特异性标志物(包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原)的存在来测定分化。也可以从功能(诸如氨的代谢、ldl的储存和摄取、icg的摄取和释放以及糖原的储存)上测量分化。在一些实施方案中，hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞分化成β样细胞或胰岛类器官，用于移植以治疗i型糖尿病(t1dm)。细胞系统是解决t1dm的有前途的方法，参见例如ellis等人，doi/10.1038/nrgastro.2017.93，其通过引用并入本文。另外，pagliuca等人报道了从hipsc至β细胞的成功分化(参见doi/10.106/j.cell.2014.09.040，其在此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的用于从人多能干细胞大规模产生功能性人β细胞的方法和试剂)。此外，vegas等人显示了从人多能干细胞产生人β细胞，然后进行封装以避免宿主的免疫排斥；(doi:10.1038/nm.4030，在此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的用于从人多能干细胞大规模产生功能性人β细胞的方法和试剂)。如本领域已知的那样，通常通过评估β细胞相关或特异性标志物(包括但不限于胰岛素)的存在来测定分化。还可从功能上测量分化，例如测量葡萄糖代谢，通常参见muraro等人，doi:10.1016/j.cels.2016.09.002，其在此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的生物标志物。一旦产生了dhipo-/cd16t、cd32t或cd64tβ细胞，就可以将它们移植(作为细胞悬液或在本文所述的凝胶基质内)到门静脉/肝、网膜、胃肠粘膜、骨髓、肌肉或皮下囊(subcutaneous pouches)中。在一些实施方案中，将所述hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞分化成视网膜色素上皮(rpe)，以治疗威胁视力的眼部疾病。已经使用kamao等人，stem cell reports 2014:2:205-18(在此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的用于分化技术和试剂的方法和试剂)中概述的技术将人多能干细胞分化成rpe细胞；另参见mandai等人，doi:10.1056/nejmoa1608368，对于用于产生rpe细胞片和移植到患者体内的技术，也以其整体并入。可以如本领域已知的那样，通常通过评估rpe相关和/或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化。参见例如kamao等人，doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.007，其在此通过引用以其整体并入，特别是结果部分第一段中概述的标志物。在一些实施方案中，将所述hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞分化成心肌细胞以治疗心血管疾病。用于将hipsc分化为心肌细胞的技术是本领域已知的，并在实施例中进行了论述。可以如本领域已知的那样，通常通过评估心肌细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化；参见例如loh等人，doi:10.1016/j.cell.2016.06.001，其在此通过引用以其整体并入，特别是对于分化包括心肌细胞在内的干细胞的方法。在一些实施方案中，将hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞分化成内皮集落形成细胞(ecfc)以形成新血管来治疗外周动脉疾病。分化内皮细胞的技术是已知的。参见例如prasain等人，doi:10.1038/nbt.3048，其通过引用以其整体并入，特别是对于用于从人多能干细胞产生内皮细胞的方法和试剂，以及移植技术。可如本领域已知的那样，通常通过评估内皮细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化。在一些实施方案中，将hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞分化成甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡类器官，其可分泌甲状腺激素来治疗自身免疫性甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术是本领域已知的。参见例如kurmann等人，doi:10.106/j.stem.2015.09.004，其在此通过引用以其整体明确地并入，特别是对于用于从人多能干细胞产生甲状腺细胞的方法和试剂，以及移植技术。可如本领域已知的那样，通常通过评估甲状腺细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化。h.分化的hipo-/cd16t、cd32t或cd64t细胞的移植如本领域技术人员所理解的，使用本领域已知的技术移植分化的hipo-/cd16t、cd32t或cd64t衍生物，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。一般来说，将本发明的细胞通过静脉内途径或通过注射在患者的特定部位来进行移植。当移植到特定位置时，可将细胞悬浮在凝胶基质中以防止在它们固定时分散。为了更全面地理解本文所述的发明，提出了以下实施例。应该理解的是，这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不能解释为以任何方式限制本发明。vii.实施例hip和hipo-细胞如wo2018/132783、pct/us19/42123、pct/us19/42117和临时申请第62/698,973、62/698,978、62/698,981、62/698,984、62/846,399和62/855,499号中所公开地产生。pct/us20/55120中公开了当cd64在多能细胞上过表达时针对nk细胞和adcc杀伤的保护。前述文献中的每一个都通过引用整体并入本文。实施例1：cd64t表达通过fc结构域隔离抗体图3是显示cd64t捕获游离igg fc而不在靶细胞中诱导任何信号传导的示意图。人野生型(wt)ipsc衍生的内皮细胞(iec)被转导以表达cd64或cd64t。将十万个iec铺在涂有明胶的六孔板中，并在37℃、5％co2下孵育过夜。第二天，更换培养基并将在重新工程化的ef1a启动子控制下的20μl携带截短的cd64的转基因的慢病毒颗粒(1x108ifu/ml)或200μl携带全长cd64的慢病毒颗粒(1x107ifu/ml)(定制产品，gentarget，san diego,ca)添加到1.5ml培养基中。36小时后，添加1ml细胞培养基。再过24小时后，进行完全的培养基更换。两天后通过流式细胞术测量cd64或cd64t表达(图4a和5a)。使用pe标记的小鼠抗人cd64抗体(bd biosciences，sanjose，ca，目录号558592)进行cd64或cd64t的流式细胞术分析。使用人源化igg1抗cd52抗体阿仑单抗(ichorbio,wantage ox12 9ff,uk)测量抗体fc结合能力。该抗体不识别ipsc上的表位，而是仅在cd64或cd64t存在的情况下结合(分别为图4a和5a)。使用qdot 655标记的山羊抗人igg(h+l)f(ab')2二抗(目录号q-11221mp，thermo fisherscientific，carlsbad，ca)对fc结合进行定量。流式细胞术显示随着cd64和cd64t抗体浓度的增加，阿仑单抗fc结合增加(分别为图4b和5b)。实施例2：表达cd64t的hip iec受到保护以免受adcc和cdc的影响hip iec不表达cd64(图6a)。由于它们也不表达任何cd52，因此它们不通过其fab或fc结合抗cd52igg1(阿仑单抗)(图6b)。hip iec经转导以表达cd64(图7a)。这种hip iecscd64能够通过其fc以浓度依赖性方式结合igg1(图7b)。为了避免细胞内信号传导，hip iec经转导以表达细胞内截短的cd64(cd64t)(图8a)。这种hip iecscd64t能够通过其fc以浓度依赖性方式结合igg1(图8b)。然后hip iec和hip iecscd64t经转导以额外表达cd52，其是高细胞毒性igg1抗体阿仑单抗的靶标。人原代nk细胞购自stemcell technologies(70036，vancouver,canada)，并在进行测定之前在添加10％fcs hi和1％pen/strep的rpmi-1640中培养。在cdc测定中，靶细胞与新鲜的abo相容人血清一起孵育。在xcelligence sp平台和mp平台(acea biosciences，san diego,ca.)上进行实时杀伤测定。使用涂有胶原蛋白(sigma-aldrich)的特殊96孔e板(acea biosciences)。将总共4×104个人iec、epic、β细胞或car-t细胞铺板于100μl培养基中。细胞指数达到0.7后，将4×104个人nk细胞添加到adcc测定中，或将50μl血型相容的人血清添加到cdc测定中。患者血清样品在使用前用dtt处理以消除血型igm抗体。对于nalm6杀伤测定，铺板4×104个nalm6细胞并使用4×104个car-t细胞作为效应细胞。使用以下抗体并将其在与nk细胞在50μl培养基或在所示的血清中混合后添加：人源化抗cd52igg1(阿仑单抗，ichorbio，目录号ich4002)、人源化抗hla-a2igg1(克隆3pf12，absolute antibody，目录号ab00947-10.0)、人源化抗rh(d)igg1(克隆f5，creativebiolabs，目录号famab-0089wj)，人源化抗tpoigg1(克隆b8，creative biolabs，目录号famab-0014jf)、人源化抗cd3igg1(creative biolabs，定制产品)、人源化抗cd19scfv(fmc63)igg1(克隆136.20.1，creative biolabs，目录号hpab-0440-yj-m/h)。使用0.0001μg/ml至1μg/ml的不同浓度。作为阴性对照，细胞用2％triton x-100的培养基处理(数据未显示)。使用rtca软件(acea)对数据进行标准化和分析。在adcc和cdc杀伤测定中，hip iecscd52分别被nk细胞(图9)或补体(图10)以浓度依赖性方式杀死。发现hip iecscd52,cd64t完全受到针对adcc(图11)和cdc(图12)的保护。实施例3：工程化人甲状腺上皮细胞逃避抗体介导的自身免疫杀伤桥本甲状腺炎是一种其中细胞毒性自身抗体导致甲状腺组织破坏的原型疾病。抗tpo抗体(主要是igg1亚类)在90％的患者中以高浓度存在(rapoport,b.&mclachlan,s.m.,thyroid autoimmunity.jclin invest 108,1253-1259(2001)；doullay,f.等人,autoimmunity 9,237-244(1991))。它们介导adcc(bogner,u.等人,j clin endocrinolmetab 59,734-738(1984)；stathatos,n.&daniels,g.h.,autoimmune thyroiddisease.curr opin rheumatol 24,70-75(2012)；stassi,g.&de maria,r.autoimmunethyroid disease:new models of cell death in autoimmunity.nat rev immunol 2,195-204(2002))和cdc(rebuffat,s.等人,j clin endocrinol metab 93,929-934(2008)；chiovato,l.等人,j clin endocrinol metab 77,1700-1705(1993))。这削弱了甲状腺的功能(pearce,e.n.,等人,n engl j med 348,2646-2655(2003))。本发明提供了对tpo抗体具有抗性的甲状腺上皮细胞(epics)以用于当移植到甲状腺功能减退患者体内时从先天免疫反应中存活下来并重建器官功能。使用永生化人甲状腺上皮细胞(epics，inscreenex，braunschweig，germany，目录号ins-ci-1017)和原代人胰岛细胞(takara，mountain view，ca，目录#y10106)。由于epics在体外没有表现出对促甲状腺激素(tsh)的生理反应，因此它们的甲状腺过氧化物酶(tpo)水平远低于生理表达水平。因此，使用慢病毒转导方法人为地增加它们的tpo表达。将十万个人甲状腺epics铺在明胶包被的六孔板上，并在37℃、5％co2下孵育过夜。第二天，更换培养基并将200μl携带人tpo重新工程化的ef1a启动子转基因的慢病毒颗粒(1x107ifu/ml)(gentarget)添加到1.5ml培养基中。36小时后，添加1ml细胞培养基。这些epicstpo显示出良好的tpo表达，但不表达cd64(图13a)。然后，epicstpo经转导以也表达cd64t并且产生epicstpo,cd64t(图13b)。虽然甲状腺epicstpo不结合任何人igg1，即使在高浓度下也是如此(图14a)，但epicstpo,cd64t有效结合游离人igg1fc(图14b)。通过elisa测量甲状腺素的产生。将96孔板用明胶包被，并将每孔3×104个人甲状腺epicstpo或epicstpo,cd64t接种在100μl h7h培养基中并在37℃、5％co2中孵育24小时。第二天，更换h7h培养基并补充1mu/ml天然牛促甲状腺激素蛋白(tsh，目录号tsh-1315b，creative biomart，shirley，ny)。每个epic组的三个孔还补充有1μg/ml抗cd52igg1(阿仑单抗，克隆campath-1h，biorad)。72小时后，收集上清液并根据制造商的说明使用甲状腺素(t4)竞争性elisa试剂盒(目录号eiat4c，invitrogen)评估甲状腺素水平。结果以使用和不使用阿仑单抗的组之间的光密度(od)的变化表示。无论是否存在igg1抗体，甲状腺epicstpo和epicstpo,cd64t均产生甲状腺素(图15a和b)。将具有和不具有cd64t表达的epics(tpo)铺板在xcelligence平台上用于体外阻抗测定(图16)。它们附着在塑料培养皿上并以多层方式生长。因此，xcelligence机器计算的细胞指数没有达到内皮细胞已知的形成甚至单层的稳态水平。随着这些细胞在多层簇中生长，细胞指数不断增加。在该测定中，使用浓度不断增加的兔抗tpo抗体(abcam，cambridge，ma，目录#ab203057)来诱导抗体介导的杀伤。添加40,000个人nk细胞作为效应细胞。因为兔ig fc确实与人cd16结合，所以epics(tpo)以浓度依赖性方式被杀死。然而，工程化的epics(tpo，cd64t)在该测定中使用的所有抗体浓度下都有效地逃避了抗体介导的杀伤。尽管兔igg fc结合人cd64和cd64t，但我们接下来使用人源化抗tpoigg1抗体。在nk细胞adcc测定(图17)和cdc测定(图18)中，这种人igg1抗体有效杀死甲状腺epicstpo。然而，甲状腺epicstpo,cd64t受到完全保护而免受adcc(图19)和cdc(图20)的影响。来自患有桥本甲状腺炎并具有正常上限水平(0.03u/ml)的21倍、26.3倍和29.6倍的抗tpo抗体滴度的血清样品在cdc测定中快速杀死甲状腺epicstpo(图21a-c)。甲状腺epicstpo,cd64t受到完全保护而免受患者血清中的杀伤，因此能够承受临床相关的自身免疫条件。6-12周龄的nsg(nod.cg-prkdcscid il2rgtm1wjl/szj,005557)小鼠购自jacksonlaboratories(sacramento,ca)。在每幅图中呈现了实施例中使用的动物数量。nsg接受者在第0、1和2天皮下注射5×104个epicstpo或epicstpo,cd64t、100万个人nk细胞和1mg剂量的抗tpo(图22a)。所有epicstpo移植物快速消失(图22b)，而所有epicstpo,cd64t移植物存活(图22c)。实施例4：工程化人β细胞逃避hla抗体介导的杀伤1型糖尿病(t1dm)是另一种自身免疫性疾病，其由t细胞介导并伴有抗体反应。我们的目的是测试cd64t表达是否可以使它们抵抗hla抗体杀伤。人ipsc衍生的胰岛β细胞购自takara(chipsc22，目录号y10106)，并在cellartis hips beta细胞培养基试剂盒(takara，目录号y10108)中培养。根据制造商的方案将细胞接种到12孔板中。一些细胞用cd64t慢病毒颗粒(gentarget)转导。人ipsc衍生的胰岛细胞(β细胞)不表达cd64(图23a)。然后，人ipsc衍生的β细胞经转导以表达cd64t(图23b)。虽然β细胞不能结合igg1(图24a)，但β细胞cd64t能够捕获并结合游离的igg fc(图24b)。通过elisa测量胰岛素的产生。将24孔板包被明胶，并将每孔5×104个ipsc衍生的β细胞和β细胞cd64t细胞(目录号y10108，takara bio，san jose，ca)接种于500μl cellartishipsβ细胞培养基中并在37℃、5％co2下孵育24小时。第二天，cellartis hipsβ细胞培养基更换为不含葡萄糖的rpmi 1640(目录号11879-020，gibco)持续2小时。2小时后，将培养基更换为不含葡萄糖的rpmi并补充2mm葡萄糖(目录号g7528，sigma aldrich)。每个β细胞组的三个孔还补充有1μg/ml抗cd52igg1(阿仑单抗，克隆campath-1h，目录号mca6101，biorad)。20分钟后，收集上清液并将培养基更换为不含葡萄糖的rpmi并补充20mm葡萄糖。再次将1μg/ml阿仑单抗添加至每组3个孔中。20分钟后，收集上清液并根据制造商的说明使用人胰岛素elisa试剂盒(目录号kaq1251，invitrogen)测定人胰岛素的水平。结果以使用和不使用阿仑单抗的组之间的光密度(od)的变化表示。β细胞(图25a)和β细胞cd64t(图25b)都显示出完整的葡萄糖感测和胰岛素产生。这些数据显示胰岛素elisa中的光密度(od)测量结果。在低葡萄糖培养基(2mm)中，与高葡萄糖培养基(20mm)相比，β细胞和β细胞cd64t均显示较低的胰岛素产生。在1μg/ml抗cd52(阿仑单抗)抗体的存在下，胰岛素产生没有变化。然后将具有和不具有cd64t表达的胰岛细胞(胰岛β细胞)铺板在xcelligence平台上(图26)。它们附着在塑料培养皿上，但也成簇生长，并且细胞指数随着时间的推移不断增加。尽管存在聚集生长模式，但该测定在检测靶细胞杀伤方面仍然非常灵敏。胰岛细胞显示hla a2型。因此，我们使用具有人igg1fc的人源化抗人hla-a2(absolute antibody，boston,ma，目录号#ab00947-10.0)来诱导抗体介导的杀伤。人nk细胞(40,000个)被用作效应细胞。与抗hla-a2浓度的增加相对应，胰岛细胞被杀死的速度越来越快。相反，胰岛β细胞(cd64t)细胞受到保护而免受抗hla-a2抗体介导的杀伤。在cdc测定中，随着抗hla-a2igg1抗体浓度的增加，表达hla-a2的β细胞被越来越快地杀死(图27)。然而，β细胞cd64t在cdc测定中完全抵抗hla抗体介导的杀伤(图28)。然后我们给nsg小鼠皮下注射5×104个人β细胞或β细胞cd64t以及一百万个人nk细胞(图29a)。在第0、1和2天皮下注射三个1mg剂量的抗hla-a2。所有注射的细胞均为luc+。为了成像，将d-萤光素萤火虫钾盐(375mg/kg；biosynth ag，staad，switzerland)溶解在pbs(ph7.4，gibco)中，并将250μl注射到麻醉小鼠的腹膜内。在ami ht(光谱仪器成像)中对动物进行成像。感兴趣区域(roi)生物发光以每球面度每平方厘米每秒的最大光子数(p/s/cm2/sr)为单位进行量化。使用aura image软件(spectral instruments)测量来自roi的最大信号。所有β细胞移植物在2天内消失(图29b)，而所有β细胞cd64t移植物抵抗了抗体介导的杀伤(图29c)并且与没有抗体攻击的β细胞的存活相似(图29d)。实施例5：工程化人car-t细胞逃避hla-、非hla-和car-定向的抗体杀伤临床car-t细胞疗法诱导抗体反应，其在实体瘤患者中甚至更为明显。因此，抗体保护被工程改造到car-t细胞中。人t细胞经转导以表达有或没有额外的cd64t表达的cd19scfv-4-1bb-cd3ζ构建体。使用携带cd19scfv-4-1bb-cd3ζ构建体(promab，目录号pm-car1002-v)的转基因的慢病毒颗粒从人pbmc产生人抗cd19car-t细胞。用il-2刺激pbmc过夜并以含有硫酸鱼精蛋白和1μg/ml il-2(peprotech)的每个孔105个细胞的密度接种于96孔u形底板中。将慢病毒以20的moi添加到孔中。一些孔另外用cd64t慢病毒颗粒以20的moi(gentarget)转导。在25℃下以1800rpm进行spinfection 30分钟。之后，将细胞放回湿润的5％co2培养箱中过夜。2天后更换培养基，并将细胞以每毫升106个的密度接种在t细胞培养基(optmizer，thermo fisher scientific)中。cd3/cd28珠(thermo fisher scientific)用于t细胞扩增。在bd aria fusion上针对car+和car+/c64t+群体对细胞进行分选，并用于进一步测定。car-t细胞显示出car受体(抗cd19scfv)的显著表达，但不表达cd64t(图30a)。然后car-t细胞经转导以表达cd64t并且这样的car-tcd64t仍然表达car并且另外表达cd64t(图30b)。虽然car-t细胞不结合任何游离igg1(使用抗tpo抗体，图31a)，但car-tcd64t能够捕获并结合游离igg1fc(图31b)。评估了car-t、car-tcd64t和常规t细胞针对cd19阳性nalm靶细胞的杀伤功效(图32)。虽然对照t细胞没有显示杀伤，但car-t和car-tcd64t在各种效应细胞与靶细胞比率下都是同样有效的杀伤者。此外，car-tcd64t的肿瘤杀伤能力不受fc结合抗体的存在的影响(图33)。进行了使用针对hla表位(hla-a2)、非hla表位(cd52、cd3)、血型抗原(rh(d))和car受体(抗cd19scfv)的细胞毒性抗体的adcc(图34)和cdc测定(图35)，并且在所有测定中car-t细胞均被杀死。然而，在adcc(图36)和cdc测定(图37)中，car-tcd64t能够逃避使用所有五种抗体的抗体介导的杀伤。cd64t表达不影响人car-t细胞的细胞毒性，但使它们对抗体产生抵抗力而无论其特异性如何。实施例6：工程化人nk细胞逃避adcc和cdc杀伤为了显示抗体保护可以被工程化到nk细胞中，人nk细胞经转导以表达cd64t。外周人nk细胞不表达cd64t(图38a)。nkcd64t显示高cd64t表达(图38b)。虽然nk细胞不结合任何游离igg1(使用抗tpo抗体，图39a)，但nkcd64t细胞能够捕获并结合游离igg1fc(图39b)。进行了使用抗cd52抗体阿仑单抗的adcc(图40)和cdc测定(图41)，并且nk细胞被快速杀死。然而，nkcd64t细胞在adcc(图42)和cdc测定(图43)中均能够逃避抗体介导的杀伤。cd64t表达使nk细胞能够抵抗抗体介导的杀伤。viii.示例性序列：seq id no：1-人β-2-微球蛋白msrsvalavlallslsgleaiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdiseq id no：2-人ciita蛋白，n末端160个氨基酸mrclaprpagsylsepqgssqcatmelgpleggylellnsdadplclyhfydqmdlageeeielysepdtdtincdqfsrllcdmegdeetreayaniaeldqyvfqdsqleglskdifkhigpdevigesmempaevgqksqkrpfpeelpadlkhwkpseq id no：3-人cd47mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnenilivifpifaillfwgqfgiktlkyrsggmdektiallvaglvivivivgailfvpgeyslknatglglivtstgilillhyyvfstaigltsfviailviqviayilavvglslciaacipmhgpllisglsilalaqllglvymkfveseq id no：4-单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)masypchqhasafdqaarsrghsnrrtalrprrqqeatevrleqkmptllrvyidgphgmgkttttqllvalgsrddivyvpepmtywqvlgasetianiyttqhrldqgeisagdaavvmtsaqitmgmpyavtdavlaphvggeagsshappaltlifdrhpiaallcypaarylmgsmtpqavlafvalipptlpgtnivlgalpedrhidrlakrqrpgerldlamlaairrvygllantvrylqgggswwedwgqlsgtavppqgaepqsnagprphigdtlftlfrapellapngdlynvfawaldvlakrlrpmhvfildydqspagcrdallqltsgmvqthvttpgsipticdlartfaremgeanseq id no：5-大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(ec-cd)msnnalqtiinarlpgeeglwqihlqdgkisaidaqsgvmpitensldaeqglvippfvephihldttqtagqpnwnqsgtlfegierwaerkallthddvkqrawqtlkwqiangiqhvrthvdvsdatltaltalkamlevkqevapwidlqivafpqegilsypngealleealrlgadvvgaiphfeftreygveslhktfalaqkydrlidvhcdeiddeqsrfvetvaalahhegmarvtashttamhsyngaytsrlfrllkmsginfvanplvnihlqgrfdtypkrrgitrvkemlesginvcfghddvfdpwyplgtanmlqvlhmglhvcqlmgygqindglnlithhsartlnlqdygiaagnsanliilpaengfdalrrqvpvrysvrggkviastqpaqttvyleqpeaidykrseq id no：6-截短的人半胱天冬酶9gfgdvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsseq id no：7-人cd64nm_000566mwflttlllwvpvdgqvdttkavitlqppwvsvfqeetvtlhcevlhlpgssstqwflngtatqtstpsyritsasvndsgeyrcqrglsgrsdpiqleihrgwlllqvssrvftegeplalrchawkdklvynvlyyrngkafkffhwnsnltilktnishngtyhcsgmgkhrytsagisvtvkelfpapvlnasvtspllegnlvtlscetklllqrpglqlyfsfymgsktlrgrntsseyqiltarredsglywceaatedgnvlkrspelelqvlglqlptpvwfhvlfylavgimflvntvlwvtirkelkrkkkwdleisldsghekkvisslqedrhleeelkcqeqkeeqlqegvhrkepqgatseq id no：8-人cd52nm_001803mkrflfllltisllvmvqiqtglsgqndtsqtsspsasssmsggi flffvanaiihlfcfsseq id no：9-人cd16fcgr3anp_000560.6maegtlwqilcvssdaqpqtfegvkgadpptlppgsflpgpvlwwgslarlqteksdevsrkgnwwvtemgggagerlftssclvglvplglrislvtcplqcgimwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhneslissqassyfidaatvddsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsgsyfcrglfgsknvssetvnititqglavstissffppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktnirsstrdwkdhkfkwrkdpqdkseq id no：10-人cd16fcgr3bnp_001231682.2mwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwysvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhnenlissqassyfidaatvndsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkdrkyfhhnsdfhipkatlkdsgsyfcrglvgsknvssetvnititqglavstissfsppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktniseq id no：11-人cd32fcgr2a>np_001129691.1mtmetqmsqnvcprnlwllqpltvllllasadsqaaappkavlkleppwinvlqedsvtltcqgarspesdsiqwfhngnlipthtqpsyrfkannndsgeytcqtgqtslsdpvhltvlsewlvlqtphlefqegetimlrchswkdkplvkvtffqngksqkfshldptfsipqanhshsgdyhctgnigytlfsskpvtitvqvpsmgssspmgiivavviatavaaivaavvaliycrkkrisanstdpvkaaqfeppgrqmiairkrqleetnndyetadggymtlnpraptddddkniyltlppndhvnsnnseq id no：12-人cd32fcgr2b>np_003992.3mgilsflpvlatesdwadckspqpwghmllwtavlflapvagtpaappkavlklepqwinvlqedsvtltcrgthspesdsiqwfhngnlipthtqpsyrfkannndsgeytcqtgqtslsdpvhltvlsewlvlqtphlefqegetivlrchswkdkplvkvtffqngkskkfsrsdpnfsipqanhshsgdyhctgnigytlysskpvtitvqapssspmgiivavvtgiavaaivaavvaliycrkkrisalpgypecremgetlpekpanptnpdeadkvgaentitysllmhpdaleepddqnriseq id no：13-人cd32fcgr2c>np_963857.3mgilsflpvlatesdwadckspqpwghmllwtavlflapvagtpaappkavlklepqwinvlqedsvtltcrgthspesdsipwfhngnlipthtqpsyrfkannndsgeytcqtgqtslsdpvhltvlsewlvlqtphlefqegetivlrchswkdkplvkvtffqngkskkfsrsdpnfsipqanhshsgdyhctgnigytlysskpvtitvqapssspmgiivavvtgiavaaivaavvaliycrkkrisanstdpvkaaqfeppgrqmiairkrqpeetnndyetadggymtlnpraptddddkniyltlppndhvnsnnseq id no：14-截短的人cd16mwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhneslissqassyfidaatvddsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsgsyfcrglfgsknvssetvnititqglavstissffppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvseq id no：15-截短的人cd32mtmetqmsqnvcprnlwllqpltvllllasadsqaaappkavlkleppwinvlqedsvtltcqgarspesdsiqwfhngnlipthtqpsyrfkannndsgeytcqtgqtslsdpvhltvlsewlvlqtphlefqegetimlrchswkdkplvkvtffqngksqkfshldptfsipqanhshsgdyhctgnigytlfsskpvtitvqvpsmgssspmgiivavviatavaaivaavvaliyseq id no：16-截短的人cd64mwflttlllwvpvdgqvdttkavitlqppwvsvfqeetvtlhcevlhlpgssstqwflngtatqtstpsyritsasvndsgeyrcqrglsgrsdpiqleihrgwlllqvsrvftegeplalrchawkdklvynvlyyrngkafkffhwnsnltilktnishngtyhcsgmgkhrytsagisvtvkelfpapvlnasvtspllegnlvtlscetklllqrpglqlyfsfymgsktlrgrntsseyqiltarredsglywceaatedgnvlkrspelqvlglqlptpvwfhvlfylavgimflvntvlwvtiseq id no：17-tfr1胞质结构域(位置1-67)mmdqarsafsnlfggeplsytrfslarqvdgdnshvemklavd eeenadnntkanvtkpkrccsgsicseq id no：18-tfr1跨膜结构域(位置68-88)ygtiavivffligfmigylgyseq id no：19-tfr1胞外结构域(位置89-760)ckgvepktecerlagtespvreepgedfpaarrlywddlkrklsekldstdftgtikllnensyvpreagsqkdenlalyvenqfrefklskvwrdqhfvkiqvkdsaqnsviivdkngrlvylvenpggyvayskaatvtgklvhanfgtkkdfedlytpvngsivivragkitfaekvanaeslnaigvliymdqtkfpivnaelsffghahlgtgdpytpgfpsfnhtqfppsrssglpnipvqtisraaaeklfgnmegdcpsdwktdstcrmvtsesknvkltvsnvlkeikilnifgvikgfvepdhyvvvgaqrdawgpgaaksgvgtalllklaqmfsdmvlkdgfqpsrsiifaswsagdfgsvgatewlegylsslhlkaftyinldkavlgtsnfkvsaspllytliektmqnvkhpvtgqflyqdsnwaskvekltldnaafpflaysgipavsfcfcedtdypylgttmdtykelieripelnkvaraaaevagqfviklthdvelnldyerynsqllsfvrdlnqyradikemglslqwlysargdffratsrlttdfgnaektdrfvmkklndrvmrveyhflspyvspkespfrhvfwgsgshtlpallenlklrkqnngafnetlfrnqlalatwtiqgaanalsgdvwdidnefseq id no：20-tfr2胞质结构域(位置1-83)merlwglfqraqqlsprssqtvyqrvegprkghleeeeeedge egaetlahfcpmelrgpeplgsrprqpnlipwaaagrraapseq id no：21-tfr2跨膜结构域(位置84-104)ylvltalliftgafllgyvafseq id no：22-tfr2胞外结构域(位置105-801)rgscqacgdsvlvvsedvnyepdldfhqgrlywsdlqamflqflgegrledtirqtslrervagsagmaaltqdiraalsrqkldhvwtdthyvglqfpdpahpntlhwvdeagkvgeqlpledpdvycpysaignvtgelvyahygrpedlqdlrargvdpvgrlllvrvgvisfaqkvtnaqdfgaqgvliypepadfsqdppkpslssqqavyghvhlgtgdpytpgfpsfnqtqfppvassglpsipaqpisadiasrllrklkgpvapqewqgsllgspyhlgpgprlrlvvnnhrtstpinnifgciegrsepdhyvvigaqrdawgpgaaksavgtaillelvrtfssmvsngfrprrsllfiswdggdfgsvgstewlegylsvlhlkavvyvsldnavlgddkfhaktsplltsliesvlkqvdspnhsgqtlyeqvvftnpswdaevirplpmdssaysftafvgvpavefsfmeddqaypflhtkedtyenlhkvlqgrlpavaqavaqlagqllirlshdrllpldfgrygdvvlrhignlnefsgdlkargltlqwvysargdyiraaeklrqeiysseerderltrmynvrimrvefyflsqyvspadspfrhifmgrgdhtlgalldhlrllrsnssgtpgatsstgfqesrfrrqlalltwtlqgaanalsgdvwnidnnf本文公开或引用的所有出版物和专利文件均通过引用整体并入。前述描述仅出于说明和描述的目的而呈现。该描述并不旨在将本发明限制为所公开的精确形式。本发明的范围旨在由所附权利要求书限定。

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