花生四烯乙醇胺环糊精包合络合物载体的制作方法

本发明属于用于在包含具有环糊精降解活性的酶的制剂中以环糊精包合物的形式递送脂质大麻素受体激动剂的生化构建体领域。

背景技术：

1、环糊精是非还原性环状葡萄糖寡糖，通常是环麦芽糊精葡聚糖转移酶(e.c.2.4.1.19；cgt酶)催化的淀粉降解的产物。环糊精可以具有多种结构(参见sanger等人，化学评论，98(1998)1787-1802)，包括三种常见的环糊精，其中6、7或8个d-吡喃葡萄糖基残基(分别为α-、β-和γ-环糊精)通过α-1，4糖苷键连接在环中。环糊精的截头圆锥形形状形成空腔或内腔，空腔根据葡萄糖单元的数目而具有不同的直径。所选的环糊精(cd)结构的大小列于表1中。较大的环糊精，诸如环麦芽九糖(6-cd)和环麦芽十糖(ε-cd)以及各种基于环糊精的超分子结构也是可能的(参见张和马，高级药物传输综述(adv drug delivrev)，2013，8月；65(9)：1215-33)。

2、表1：环糊精结构

3、

4、环糊精通常是两亲性的，其内腔的较宽边缘显示2-oh和3-oh基团，而较窄边缘显示6-oh。因此，这些亲水性羟基位于内腔的外侧，而内表面通常为疏水性的，且排列有异头氧原子以及c3-h和c5-h氢原子。在水溶液中，该疏水性内腔可以含有水分子，例如，约3个(α-cd)、7个(β-cd)或9个(γ-cd)不稳定容纳但低熵，因此相对容易被置换的水分子。因此，亲水性环糊精在所述cd内腔内或部分在所述cd内腔内可以结合保留一种或多种大小合适的分子，从而形成环糊精包合体或络合物。例如，可以结合非极性脂肪族和芳香族化合物，包括药物，诸如亲脂性药物，从而增加正常情况下疏水性的化合物的水溶性，或者将某些食品添加剂中不期望的性质诸如气味或味道最小化。因此，环糊精包合物广泛应用于制药、食品和化妆品领域(参见hedges，化学评论，98(1998)2035-2044)。例如，环糊精已用于多种缓释药物制剂中，诸如用于医学化合物与疏水性环糊精衍生物的包合络合物(美国专利号4,869,904)。

5、可以以多种方式化学修饰环糊精。例如，为了改变环糊精的包合特异性、物理和化学性质。例如，可以将cd羟基衍生化。例如，两种修饰的cd已用于许多药品中：sbe-β-cd或磺丁基环糊精(captisol)(一种β-cd的聚阴离子可变取代的磺丁基醚)和hp-β-cd(janssen商业开发的修饰cd)。其他cd衍生物包括舒更葡糖或org-25969，其中γ-cd上的6-羟基已被羧基硫代乙酸酯醚键和羟基丁烯基-β-cd取代。环糊精的替代形式包括：2，6-二-o-甲基-β-cd(dimeb)、2-羟丙基-β-环糊精(hp-β-cd)、随机甲基化的-β-环糊精(rameb)、磺丁基醚β-环糊精(sbe-β-cd)和磺丁基醚-γ-环糊精(sbeγcd)、磺丁基化的β-环糊精钠盐、磺丁基化的β-环糊精钠盐、(2-羟丙基)-α-环糊精、(2-羟丙基)-β-环糊精、(2-羟丙基)-γ-环糊精、dimeb-50七(2，6-二-o-甲基)-β-环糊精、trimeb七(2，3，6-三-o-甲基)-β-环糊精、甲基-β-环糊精、八(6-脱氧-6-碘)-γ-环糊精和八(6-脱氧-6-溴)-γ-环糊精。尽管已开发出此类cd的良好的药理学和毒理学概况，但在给药后，残留的cd可能会干扰药物(包括共同给药的药物)的药代动力学性质，特别是在肠胃外给药后(参见stella和贺，毒理学病理学(toxicol pathol)，2008年，1月，第36卷，第1期，30-42)。

6、环糊精对酶促消化的敏感性存在差异。例如，γ-cd相对容易被α-淀粉酶水解，而α-环糊精不容易被水解。基于cd的治疗剂通常取决于内源性淀粉酶消化cd的活性。然而，患者之间的淀粉酶活性存在显著差异。例如，患有胰功能不全、囊性纤维化、乳糜泻或克罗恩病的患者可能缺少正常量的淀粉酶。类似地，患者，特别是衰老患者，可能存在胃酸产生不足，因而不能在十二指肠中产生适当低ph的条件来正确引发胰淀粉酶的释放。提高抗酸剂、组胺-2阻断剂、质子泵抑制剂或替代性酸阻断剂的常规使用可以产生类似的作用。

7、已鉴定了多种微生物环糊精消化酶。cd降解酶包括环麦芽糖糊精酶(或环糊精酶或cdase，ec 3.2.1.54)、麦芽糖淀粉酶(ec 3.2.1.133)、新支连淀粉酶(ec 3.2.1.135)，其已被报道能够水解cd，并且在一些情况下，能够水解其它底物，诸如普鲁兰糖和淀粉。环糊精酶(cdase)催化cd水解形成α-1，4-键的直链寡糖，因此其可以从cd包合络合物中释放底物。1968年报道了来自软化芽孢杆菌(bacillus macerans)的cd酶，此后许多来自细菌的cd酶得到了表征，诸如来自芽孢杆菌、嗜热厌氧杆菌菌株39e、黄杆菌属和产酸克雷伯菌菌株m5a1的酶。古细菌cd酶已经从archaeoglobus fulgidus、热球菌属(thermococcus sp.)b1001、热球菌属cl1、垂体热丝菌(thermofilum pendens)以及强烈火球菌(pyrococcusfuriosus)表征。黄杆菌属(flavobacterium sp.)的cd酶的结构已被详细表征(参见sun等人，古生菌(archaea)，第2015卷(2015)，文章id 397924，报道了编码来自thermococcuskodakarensis kod1(cd酶-tk)的环糊精酶的基因的鉴定)。

8、花生四烯乙醇胺是一种脂质大麻素受体配体，鉴定为内源性大麻素(也称为(5z，8z，11z，14z)-n-(2-羟乙基)二十碳-5，8，11，14-四烯酰胺；n-花生四烯乙醇胺；或花生四烯酰基乙醇酰胺)的第一化合物。环糊精包合络合物中的花生四烯乙醇胺类似物已经被描述为对于治疗眼内高血压是有用的(wo 1996001558)。花生四烯乙醇胺被理解为cb1受体的部分激动剂；cb2受体的弱部分激动剂，辣椒素受体vr1的部分激动剂(也称为瞬时受体电位阳离子通道亚家族v成员1；或trpv1)和gpr55受体的激动性配体(reggio ph.endocannabinoidbinding to the cannabinoid receptors：what is known and what remainsunknown.curr med chem.2010；17(14)：1468-1486；roberts la，christie mj，connorm.anandamide is a partial agonist at native vanilloid receptors in acutelyisolated mouse trigeminal sensory neurons.br j pharmacol.2002oct；137(4)：421-8)。已经报道了花生四烯乙醇胺及其类似物对cb1和cb2受体的结合亲和力，花生四烯乙醇胺证明对cb1结合的优先亲和力，例如对cb1的ki小于100nm，对cb2的ki大于1000nm(lin，s.，khanolkar，a.d.，fan，p.，goutopoulos，a.，qin，c.，papahadjis，d.，&makriyannis，a.(1998).novel analogues of arachidonylethanolamide(anandamide)：affinities forthe cb1 and cb2 cannabinoid receptors and metabolic stability.journalofmedicinal chemistry，41(27)，5353-5361)。

9、一氧化氮自由基涉及非常宽范围的生理信号传导功能，其中复杂的关系被理解为存在于内源性大麻素系统与氮能信号传导之间(christopher lipina，harinders.hundal，the endocannabinoid system：‘no’longer anonymous in the control ofnitrergic signalling？，journal of molecular cell biology，第9卷，第2期，2017年4月，第91-103页)。一氧化氮是由将l-精氨酸转化为l-瓜氨酸和一氧化氮的一氧化氮合酶家族生理合成的，并且l-瓜氨酸进而再循环以提供l-精氨酸。呼出气中no浓度分数(feno)的测量已被用作测量气道炎症的定量、非侵入性方法。已经描述了用于测量体液中的no的方法和装置，例如通过测量作为一氧化氮的前体和生物标记物的唾液一氧化氮分析物(包括亚硝酸盐)，例如能够检测唾液一氧化氮分析物的浓度范围25至＞400umol/l亚硝酸盐(例如，具有对应于：0至25、25至100、100至200、200至350以及大于400umol/l亚硝酸盐(us9759716)的可见不同的比色子范围)。已经提出体液中的一氧化氮浓度可作为生理花生四烯乙醇胺水平的指标(us20190265258)。在对照条件下已经报道了相对宽范围的血管周围no浓度，其中值的范围是例如约200至1，000nm(chen k，pittman rn，popel as.nitricoxide in the vasculature：where does it come from and where does it go？aquantitative perspective.antioxid redox signal.2008；10(7)：1185-1198.doi：10.1089/ars.2007.1959)。

10、瓜氨酸已经被描述为可用于处理与no缺乏相关的一系列条件(us20010056068)。类似地，l-精氨酸和其他一氧化氮供体已经被描述为在涉及no信号传导的病症的治疗中是有用的(ep0441119；us5595970和us5508045)。

技术实现思路

1、提供了环糊精包合络合物递送载体，其中花生四烯乙醇胺或花生四烯乙醇胺类似物是客体分子。提供这些制剂用于增加内源性一氧化氮水平，因此用于治疗其中增加内源性no水平具有治疗或预防益处的病症，诸如与no缺乏相关的病症、特征在于焦虑的病症或勃起功能障碍。例如，可以使用制剂以增加受试者中可测量的no水平或在男性受试者中提供勃起作用。对于一些制剂，可以维持这些作用，例如实现持续的no水平。除了花生四烯乙醇胺和花生四烯乙醇胺类似物之外，制剂可以包含另外的活性剂，任选地以包合络合物客体分子的形式，诸如no产生剂，包括瓜氨酸和/或精氨酸。

2、可以为环糊精包合络合物提供生物学可接受的载体，从而通过环糊精将客体分子稳定保留在生物学可接受的载体内。还可以在载体中提供具有环糊精降解活性的酶，该酶能够水解保留客体分子的环糊精。可以配制酶，使得在将载体递送至靶标时激活环糊精降解活性，从而从环糊精空腔释放客体分子。

3、在递送载体的替代方面，可以将酶与环糊精包合络合物共配制，或可以将酶与环糊精包合络合物共包装在递送载体中。当将酶共包装时，递送载体还可以包含酶的生物化学可接受的载体。

4、酶可以(例如)是淀粉酶、环糊精酶、麦芽糖淀粉酶或新支连淀粉酶。淀粉酶可以(例如)是哺乳动物唾液淀粉酶或胰淀粉酶，或真菌或细菌来源的淀粉酶。环糊精酶可以(例如)是微生物环糊精酶。

5、环糊精可以(例如)是cd衍生物，诸如疏水性烷基化环糊精或混合的甲基化/乙基化环糊精。

6、环糊精与客体分子的比值可以(例如)是5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5，但是该参数宽范围的替代值也是可能的，包括非整数比值。

7、环糊精可以(例如)是α、β或γ环糊精，但是仍可以使用非常宽范围的替代cd结构。生物学上可接受的载体可以是药学上可接受的载体。递送载体可以配制用于持续释放客体分子和/或其他活性剂。这样，本发明提供了可替代的实施方式，其中可以配制cd递送载体并将其用作药物。

8、提供了用于治疗患有可以通过增加哺乳动物受试者中的内源性一氧化氮水平来治疗或预防的一氧化氮缺乏或疾病的患者的方法。还提供了用于在男性受试者，例如大于50、60或70岁的男性或患有勃起功能障碍的男性受试者中提供勃起作用的方法。