用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法的制作方法

本发明属于生物医疗美容产品，具体涉及一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的多能干细胞，具有自我复制和分化潜能的干细胞共性，可刺激组织生长和修复，增强组织的再生能力，影响免疫调节，在细胞治疗领域有着极为广阔的应用前景。间充质干细胞具有强大的旁分泌作用，干细胞的旁分泌效应，能够表达、合成、分泌各类生长因子、细胞因子、调节因子、趋化因子、信号肽等多种生物活性因子。

2、细胞上清液是细胞培养的营养液，细胞增殖过程中的营养吸收和活性因子的分泌都是在上清液中进行交换和完成的。所以，培养间充质干细胞的培养上清液中含有多种有效的细胞因子和外泌体。

3、细胞因子：由干细胞合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，是上清液中富含细胞活性关键的信息传递物质，对体内受到损伤的组织和细胞的功能恢复起到重要作用。

4、细胞生长因子是通过改变细胞微环境来增强细胞生长、分化和组织修复的化学信使，外泌体已被证明在细胞间通讯和细胞复制、分化以及凋亡的调节中起重要作用。来源于干细胞的外泌体在皮肤领域中可能具有潜在的治疗作用。

5、外泌体：是干细胞分泌的微小的囊泡(宽30至150nm)，它们类似细胞间的“通信兵”，可以在细胞之间转移dna、rna或蛋白质(包括细胞因子)，从而影响受体细胞的功能。

6、外泌体在疤痕修复中的应用：外泌体介导的巨噬细胞、纤维细胞和成纤维细胞/肌成纤维细胞之间的细胞间通讯对于瘢痕形成至关重要。多项临床前研究证实干细胞衍生的外泌体有助于促进胶原蛋白和弹性蛋白产生，防止皮肤纤维化从而达到修复疤痕，促进伤口愈合目的。

7、外泌体在皮肤再生中的应用：通过外泌体调节人真皮成纤维细胞(hdf)的特性可能具有抗衰老疗法的潜力。来源于hdf球状体的外泌体通过上调tgf-β和下调tnf-α，导致裸鼠光老化模型中i型原胶原的产生增加和基质金属蛋白酶-1的表达降低，从而起到抗衰老作用。胚胎干细胞来源的外泌体通过调节hdf中的tgf-β2受体改善衰老特征。

8、外泌体在色素沉着中的应用：角质形成细胞来源的外泌体在黑色素细胞产生色素中起着重要作用。多项研究发现角质形成细胞来源的外泌体可以通过分泌一些因子或增加rna的表达，如增加mir-330-5p、mir-675等的表达来减少黑色素产生和减少酪氨酸酶基因表达减少等，从而发挥淡化色素沉着作用。

9、间充质干细胞的培养上清液中含有大量细胞活性物质细胞因子，主要功能是加速修复，促进细胞活化，让细胞存活率更高，从而达到“逆生长”的效果。最值得一提的是，单一细胞因子所起的是单一刺激作用，譬如生长因子，作用过强和过于持久时，会引起组织过度生长，但是由于干细胞上清液里细胞因子种类丰富，既有强化的，也有抑制的，所以其是平衡调节细胞生长活化的，而外泌体除了自有的调节功能外，它的囊泡运输机制可以顺利穿越人体组织屏障，打开细胞信号通道，调控细胞的功能，使细胞因子等能更好地作用于细胞。上清液中的细胞因□和外泌体拥有细胞分泌出来的蛋□质,可以调节细胞的增殖及分化，恢复细胞的活跃程度，也称作“活性因子”或“修复因子”。萃取提炼之后具有重建功能细胞、延缓衰老、抗皱美容的效果。可以做到如下功能：1、针对受损毛细血管修复，让肌肤从里到外焕然新生；2、从表皮到真皮层发生根本改善，恢复肌肤水嫩细腻；3、改善衰老造成的面部色素沉积。

10、间充质干细胞的培养上清液中含有的活性因子具有不同的生物学活性及作用，具有促进表皮干细胞增殖，促进皮肤新陈代谢，增强皮肤细胞的活力，促进细胞物质成份交换以增强皮肤对其他营养物质的吸收，以及机体代谢废物的排放。这些功能对于美容抗衰老功能巨大，可以促进皮肤创伤修复，促进皮下胶原再生，抑制细胞凋亡，增强抗氧化能力等。

11、间充质干细胞上清液液经过冻干工艺后不含水分，不会滋生微生物，无需添加防腐剂、增稠剂、更不添加香精、色素、酒精等，杜绝一切有可能的刺激，适宜于脆弱、敏感肌肤。

12、通过低温锁鲜固态冻干工艺，融合多重功效精华成分，将其配方中的水分完全抽离后，采用冻干技术有效保存其活性，将细胞生长因子、外泌体、小分子肽、透明质钠酸等数种经典精粹封存于固态精华之中，真正实现了零防腐剂和零添加配方，将有效活性成分固态形式保存，在这过程中去除水份，保留精华成分，遇溶媒之后成为释放有效成分的精华液，让肌肤更好地吸收。起到的作用有：

13、补水保湿。科学选配能够透皮吸收，可以渗透到肌底补水养护，软化皮肤的角质层，恢复老化皮肤的角质异常，恢复角质层保湿功能正常。

14、深层修护。有时候熬夜的皮肤必然受损，多种成份糅合，巩固修复损伤细胞，促进细胞的新陈代谢，减少老化痕迹。

15、抗氧化和抗老化。熬夜会导致体内自由基增多，与此同时，皮肤中的自由基平衡也会被打破，引起肌肤衰老，皮肤衰老的表现是松弛、出现皱纹，该成分可以即时细纹修复，紧致提拉。

16、强韧肌肤屏障。核心成分有效的针对熬夜皮肤问题进行作用，增强皮肤的屏障作用，达到活肤的功效。

17、现阶段，间充质干细胞的培养上清液在美容抗衰老领域应用前景广阔，但在应用中还存在以下问题：1)难以长期保存；本专利通过低温冻干方法有效解长期保存的问题。2)一般间充质干细胞的培养上清液中含有外来培养细胞培养基，其中还有酚红等外来培养基成份，也可能含有死细胞裂解成份，这些外来添加剂和细胞裂解毒素容易对皮肤造成伤害；通过本专利方法得到的间充质干细胞上清液不含有酚红和外来添加剂、也不含防腐剂，成份安全。3)间充质干细胞批次之间的质量不稳定，难以保证细胞产品的使用效果和安全性；本专利细胞制备工艺稳定，从培养基到所使用试剂辅料多次通过实验验证细胞批次间的稳定性。4)冻干制备活性因子的功能效力。本专利冻干成份按照一定成份配比，在其低温冻干过程中生物活性成份被保护稳定起来，使用时和溶媒配合使用，能有效保护各活性因子的功能。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法。

2、本发明的第一目的，提供一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液的制备方法，包括如下步骤：

3、(1)原代培养：从脐带中分离华通氏胶组织并剪成组织块，铺至培养瓶中，然后加入培养基进行贴壁培养至脐带间充质干细胞长满50-60％培养瓶底面积，得到p0代脐带间充质干细胞；优选的，将组织块均匀铺到t225通气细胞培养瓶中，每瓶加入10ml培养基，置于37℃、5％ co2细胞培养箱中培养，每2-3天补加培养基3-4ml；

4、(2)传代培养：a)弃去培养基，然后依次加入洗涤液洗涤、加入消化液消化、加入终止消化液终止消化、离心收集细胞沉淀，以及用培养基将细胞沉淀重悬后，接种至新的培养瓶中进行传代培养；b)待脐带间充质干细胞长满70-80％培养瓶底面积时重复步骤a)，经连续5次传代培养，得到p5代脐带间充质干细胞；优选的，洗涤液为hbss，洗涤次数为2次；消化液为不含动物源成份的重组胰酶biological industries recombinant trypsin edtasolution，室温消化2min至细胞变圆；终止消化液为含1％人血白蛋白的复方电解质溶液，由复方电解质溶液(河北天成)和人血白蛋白(20％)配制而成，该终止消化液既能终止细胞消化，又能保持细胞良好活性和高存活率，相比较其他溶液，能提高细胞活率和增殖效率(如表4所示)；所述接种密度为5000个/cm2，接种后置于37℃、5％ co2培养箱中传代培养；

5、(3)饥饿培养：待p5代脐带间充质干细胞长满培养瓶70-80％面积时，弃去培养基进行饥饿培养，所得培养液离心去除细胞沉淀后，即得到所述用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液；优选的，弃去培养基后，用pbs缓冲液清洗2-3次，然后每培养瓶加入15mlhbss，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养24h；

6、所述原代培养和传代培养中采用的培养基均为无血清培养基，所述无血清培养基包括：基础培养基biological industriesmscxf basal medium、重组因子mscsuppl.mix和血清替代物helios ultragro-pure gi，所述的基础培养基、重组因子和血清替代物的体积比为500:3:10。其原代培养的脐带间充质干细胞细胞数量、细胞活率和增殖效率远高于其他品牌培养基，见表12、图1。

7、本发明所述上清液的制备方法，在细胞培养至相对较低融合度70-80％(与传统方法的90％以上相比)时即开始传代，并采用了特定组成的不含动物源成份无血清干细胞培养基，得到的脐带间充质干细胞的细胞活率和增殖效率显著提高(如表6所示)，在此基础上，在细胞生长最旺盛的时期对其进行饥饿培养，进而能够获取包括细胞因子和外泌体在内的丰富的分泌活性因子。

8、1、本发明上清液含有的细胞因子种类及功效如下：

9、表皮生长因子(egf)：向表皮细胞发出增殖信号，促进细胞的新陈代谢。

10、肝细胞生长因子(hgf):具有促进血管内皮细胞增生和新生血管形成的作用,可促进组织细胞的发生、生存和再生，抑制细胞凋亡；调节胶原纤维的合成和炎性反应，在促进创伤愈合与防止组织纤维化中起重要的作用。

11、酸性成纤维细胞生长因子(afgf)：促进上皮细胞增殖的同时，还促进从成纤维细胞中产生胶原蛋白、透明质酸和肝蛋白。

12、超氧化物歧化酶(sod):催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。

13、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)：成纤维细胞生长因子，作用于上皮细胞、肌细胞等，促进细胞增殖。

14、毛母细胞增殖因子(fgkgf)：作用于毛母细胞促进增殖。

15、血管内皮生长因子(vegf)：对新生血管的形成发挥作用。

16、转化生长因子(tgf-β)：被称为β型变异生长因子，对组织的产生、细胞分化，胚胎发育都发挥极其重要的作用，具有抗炎效果。

17、类胰岛素一号增长因子(igf-1)：被称为胰岛素样生长因子，促进细胞的增殖。

18、血小板衍生生长因子(pdgf)：促进成纤维细胞的增殖。

19、2、本发明上清液含有的外泌体内容物、作用机制及功效如下：

20、细胞信号蛋白wnt4\wnt11：通过wnt信号抑制nf-kb信号通路，防止成纤维细胞与角质化细胞凋亡，促进细胞生长。进而起到促进皮肤相关的成纤维细胞、角质化细胞再生的作用，同时分泌胶原蛋白、弹性纤维蛋白和基质成分，达到修复皮肤的功能。

21、细胞信号蛋白wnt4：通过wnt/β-catenin信号通路激活，诱导血管内皮生成。micorna:mir-126、mir-130a：进入血管内皮细胞，促进血管新生。stat3蛋白：调控细胞生长、迁移和血管生成。micorna:mir-125a、mirna-31：mir-125a靶向抑制dii4表达，促进内皮细胞的生成，从而调节内皮细胞血管生成；mirna-31靶向抑制fih进而增强hifi通路，促进血管生成。以上各组分共同作用，促进皮肤细胞生长营养供给所需的血管生成。

22、micorna:mir-124a、mirna125b、mirna21、mirna-146a、mirna-181c、mirna-let-7b：通过抑制mapk级联反应，减少tnf-α、1β、il-6炎症因子的表达，同时促进il-10表达调控炎症水平，进而起到抑制过度炎症反应的作用。

23、micorna:mir21，mir125b，mir-23a：抑制tgf-β/smad2信号通路，从而抑制成肌纤维细胞，进而起到抑制疤痕形成的作用。

24、本发明的第二目的，提供一种冻干粉，其是在前述方法制备的用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液的基础上进一步通过添加赋形剂和冻干保护剂组分制成的易于保存的制剂形式。其中，冻干保护剂组分优选海藻糖、甘露醇、透明质酸钠和人血清白蛋白，进一步优选的，所述冻干粉按质量百分比计，其制备原料包括：海藻糖5-8％、甘露醇5-10％、透明质酸钠0.5-1％、人血清白蛋白0.2-0.5％，余量为用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液。

25、本发明的第三目的，提供一种用于损伤修复的精华液，其是在前述方法制备的冻干粉的基础上进一步通过添加溶媒将其溶解制成。溶媒起到溶解冻干粉同时保护有效成份、同时兼具滋养皮肤的功效。优选的，冻干粉的质量与溶媒的体积比为0.13g:5ml；溶媒包括以下原料组分：透明质酸钠0.6-0.8％、甘油5-8％、胶原蛋白0.5-0.8％、纯水90.4-93.9％。其中，透明质酸钠补水保湿、抗衰老、抗紫外线、促进伤口愈合、抗菌消炎；甘油保湿滋润抗皱；胶原蛋白保湿滋养、紧肤亮肤、抗氧化、防衰老；纯水作为溶剂。

26、本发明的第四目的，提供前述用于损伤修复的精华液在制备医疗美容产品中的应用。本发明用于损伤修复的精华液制成医疗美容产品时，使用方法包括：1、微针注射法：采用微针注射至面部或者有损伤皮肤真皮层中，多点密集均匀注射；2、面部涂抹法：每天早晚洁面后，将精华液涂抹在面部，连续使用2个月。以上方法可以起到滋养皮肤，促进皮肤修复和再生，美容和抗衰老的功效，在医疗美容领域有良好的应用价值。

27、本发明的有益效果为：

28、1、本发明所述的制备方法，在细胞生长最旺盛的时期对其进行饥饿培养：1)利用细胞在饥饿条件下的分泌效应，得到不含细胞培养基和细胞组分的干细胞活性因子复合体系，制备的上清液中不含外来培养基和细胞组分，从而避免了外来添加剂和细胞裂解毒素对皮肤造成的伤害；2)通过饥饿的方法得到的上清液中含有大量细胞活性物质，该上清液里含有多达几百种细胞因子；单一细胞因子所起的是单一刺激作用，譬如生长因子，作用过强和过于持久时，会引起组织过度生长，而本发明上清液里细胞因子种类丰富，既有强化的，也有抑制的，所以其是平衡调节细胞生长活化的。此外还含有外泌体，其除了自有的调节功能外，它的囊泡运输机制可以顺利穿越人体组织屏障，打开细胞信号通道，调控细胞的功能，使因子等能更好地作用于细胞而发挥协同作用。

29、2、本发明通过将上清液制成冻干粉的形式，解决了上清液难以长期保存的问题，可以有效延长分泌活性因子的活性和保存时间，从而延长了该产品的使用时限，使其在医疗美容领域有良好的应用价值。

30、3、本发明原代培养和传代培养中采用的培养基均为不含动物源成份无血清培养基体系，培养基成份相对限定，能保证培养间充质干细胞批次之间的质量稳定性(如表10所示)，提高细胞产品的安全性。

31、4、本发明在冻干粉制备中特别加入了海藻糖、甘露醇、透明质酸钠、人血清白蛋白在内的赋形剂和冻干保护剂组分，其中，海藻糖有效地保护蛋白质分子的天然结构，防止蛋白质在冷冻干燥时变性，对生物大分子起到保护作用，使具有稳定性、安全性和低吸湿性，延长产品保质期；甘露醇起到冻干赋形剂的作用；透明质酸钠补水保湿、抗衰老、抗紫外线、促进伤口愈合、抗菌消炎；人血清白蛋白维持渗透压、营养和保护活性因子。在此基础上，本发明对冻干粉的原料配比和工艺均进行了反复优化，能够最大程度地保护上清液中各种分泌活性因子的活性。

32、5、本发明所述精华液的使用效果测试显示，通过一定的仪器(譬如超声，滚针等)导入皮肤表皮层，定期使用(一般20-30天使用一次)，可有效促进皮肤新陈代谢，增加皮肤功能性再生，恢复皮肤年轻态。一般40天以后即可看到明显的皮肤改善，包括肉眼可见痘印痘坑变淡(见图3a-4b)，肤质变得细腻、紧致，小细纹明显减少或消失，白皙度光泽度提高，可见本发明具有优异的修复抗衰效果。