一种用于生物组织内细胞去除的方法与流程

本发明涉及生物材料，特别涉及一种用于生物组织内细胞去除的方法。

背景技术：

1、生物组织来源的医用材料目前在临床上应用十分广泛，包括同种异体或者异种来源的生物材料，如真皮基质，肌腱，体内膜（例如如心包膜、肠系膜、横膈膜、腹膜、羊膜，脐带、胎膜、肌膜，筋膜，小肠黏膜下层等）等材料。由于同种异体或者异种来源的材料存在免疫原性，不能直接应用于人体，否则会引起极强的免疫排斥反应，因此需要对原材料进行细胞去除处理，洗去残留的异体或异种细胞和核酸等成分，只保留物种间保守的胶原支架网络，进而可以大幅度的降低免疫排斥反应。

2、生物组织的细胞去除工艺除了需要具备脱细胞完全的基本特质，还需要符合以下条件：（1）保留生物胶原支架的正常三维结构和力学强度，这就要求细胞去除工艺不能单纯的只考虑去除细胞而采用激进的策略导致结构破坏；（2）减少脱细胞试剂的微量残留对于生物材料生物相容性的影响，减少脱细胞材料的体内毒性。尤其是在植入早期，有研究显示，微量的脱细胞试剂残留（＜0.0001%）仍会在植入早期影响体内细胞的附着和生长，导致远期的失效；残留脱细胞试剂降解产物业已被证明仍保留较强的细胞毒性。

3、目前对于生物组织的脱细胞技术主要包括以下几种：（1）物理方法（冻融法、机械搅拌法、压力法等）；（2）生物方法（酶等）；（3）化学方法（处理试剂包括酸、碱、化学表面活性剂、高渗盐水、醇类、磷酸三丁酯等）；这些方法需要根据处理的目标组织的不同而选择不同的强度、剂量或处理时间，可单独应用亦或联合/序贯应用提高脱细胞的效率。其中物理法脱细胞的效率不高，通常用于协助化学法和生物方法。

4、目前主流的生物方法和化学方法已经显露出一定的局限性。

5、生物酶法通常包括蛋白酶（如胰蛋白酶）、酯酶（磷脂酶a)和核酸酶(dna酶和rna酶)。其中以胰蛋白酶较为常见，其可以选择性地裂解细胞黏连蛋白中精氨酸和赖氨酸的羧基端，从而使细胞从组织表面脱落，但浸泡时间过长会破坏组织内的胶原结构，使得生物组织变得疏松多孔，显著降低最大失效载荷和刚度，这对于某些需要较强力学强度的生物材料是一个致命的弊端。此外，从生产的角度而言，酶的活性受较多因素的影响，例如温度，ph和抑制剂等，因此在生产中很难控制其作用稳定性，导致产品的处理均质性较差，不太适合大规模量产。

6、化学方法中，酸和碱的处理会导致胶原纤维的膨胀疏松，破坏胶原支架网络结构，并且酸和碱会中和胶原三螺旋的部分氨基和羧基结构，并且使得组织的葡糖氨基聚糖大量减少，影响组织弹性，导致胶原结构出现较大程度的破坏，显著降低组织的力学强度。

7、目前表面活性剂在生物组织脱细胞工艺中得到了广泛的使用，市面上常用的大多数化学合成表面活性剂通常由石油副产物合成，使其不可生物降解且对人类和环境都有危害。包括离子型和非离子型：非离子型表面活性剂较温和，通过破坏脂-脂或脂-蛋白连接而达到去细胞的目的，能够较好地保持蛋白质的原始结构，但是其脱细胞能力较差，单独使用经常导致细胞和核酸的残留，目前比较常用的非离子型去污剂包括triton x-100等。阴离子型表面活性剂较剧烈，通过破坏脂质-脂质，脂质-蛋白质，dna-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用能彻底破坏细胞膜和核膜的完整性，溶解脂质双分子层结构，去细胞的作用更为全面，但对余留的组织破坏力也比较强，易使细胞外基质中的蛋白质变性；相比之下，两性离子表面活性剂可以在脱细胞过程中保护蛋白质的天然结构。目前比较常用的阴离子型表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、triton x-200等，两性离子表面活性剂包括3-3-胆固醇氨丙基二甲基氨基-1-丙磺酸(chaps)、磺基甜菜碱-10和磺基甜菜碱-16等。

8、目前很多专利已经涉及到使用上述传统的化学表面活性剂进行生物材料的脱细胞处理。例如cn105727367a采用tritonx-100和脱氧胆酸钠用于异种真皮基质的脱细胞处理；cn115607739a采用tritonx-100和十二烷基硫酸钠用于动物真皮的脱细胞处理；例如cn114848912a采用十二烷基硫酸钠溶液、聚山梨酯80溶液、tritonx-100溶液、tritonx-200溶液或脱氧胆酸钠溶液用于真皮基质的脱细胞处理。

9、值得注意的是，有研究显示，目前常用的化学表面活性剂，例如上述提到的种类，即使通过反复多次的清洗，残留的微量表面活性剂成分，无论是非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂，均影响生物材料体内植入时早期的生物相容性，其降解产物具有显著的体内毒性和刺激性，例如十二烷基硫酸钠是一种对人体微毒的阴离子表面活性剂，其生物降解度只有90%，对粘膜和上呼吸道有刺激作用；碳氟表面活性剂虽拥有独特性能，但在人体内易留存，从而使其应用受到一定限制；烷基酚聚氧乙烯醚的降解产物同样被发现可能对人体造成伤害。有报道称，医用生物材料内残留的十二烷基硫酸钠具有较强的细胞毒性，会抑制细胞的生长；来自triton x-100、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠的试剂残留，浓度从0.1%增加到1.0%，既增加了表面活性剂降解片段的强度，也增加了细胞的不良结局。

10、因此，为有效避免常用的生物酶法和化学法（酸碱法或传统的化学表面活性剂法）的应用弊端，目前需要开发一种适合于大规模生产，并且能够产生具有优良生物相容性的产品的生物组织细胞去除工艺。

技术实现思路

1、本发明的目的：为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于生物组织内细胞去除的方法，一种适合于大规模稳定生产的，新型且生物相容性优良的生物组织细胞去除工艺；制备常用的生物组织来源的医用脱细胞材料产品，具有脱细胞彻底，细胞毒性低，组织相容性高等特点，可用于临床上运动系统的软组织的修复和加强。

2、本发明公开涉及一种用于生物组织内细胞去除的方法，其特征在于：包括原材料处理、主脱细胞处理和脱细胞后处理；

3、原材料处理包括：

4、（1）采用同种异体或者异种的生物原材料，生物原材料包括同种异体和/或异种的生物材料，生物原材料为真皮基质、肌腱、体内膜，进行高压水冲洗和多轮浸泡，洗去残留的污物和可溶性的蛋白质；而后称重；

5、（2）利用物理、化学和生物酶法对残留在生物原材料上的无用组织进行彻底清除；

6、（3）将洁净的生物组织来源的原材料进行符合临床应用需求的具体形态塑造的物理精修，

7、当生物原材料为真皮基质时，对真皮基质进行减薄和片层处理；

8、当生物原材料为肌腱时，对肌腱组进行切割成形或破碎处理；

9、当生物原材料为体内膜时，对体内膜进行切割成形处理；

10、（4）具体形态塑造后，使用强碱性溶液、过氧乙酸、乙醇等溶液的一种或多种组合，单独或联合/序贯使用对生物原材料进行病毒灭活处理；

11、主脱细胞处理包括：使用生物表面活性剂和/或生物基表面活性剂进行脱细胞处理，生物表面活性剂为糖脂类、多糖脂、脂肽、中性类脂衍生物中的一种或多种组合，生物基表面活性剂为：氨基酸型表面活性剂和烷基糖苷类表面活性剂中的一种或多种组合；

12、脱细胞后处理包括，去除α-gal抗原处理和/或交联处理；

13、当脱细胞后处理为去除α-gal抗原处理时，采用α-半乳糖苷酶处理材料，降低或去除组织及细胞中的α-gal抗原；α-半乳糖苷酶的浓度为1-100u/ml，处理时间为3小时-48小时，处理温度为4℃-37℃；

14、当脱细胞后处理为交联处理时，采用戊二醛、碳化二酰亚胺(edc)、1,6-己二异氰酸酯py(hd)、京尼平、1,4-二(3,4-羟基苯)-2,3二甲基丁烷(ndga)、环氧化合物、含有二硫化物官能团的二羧酸化合物、酰基叠氨化物及二苯基磷酸盐（dp-中pa)、乙醛酸中的至少一种进行化学交联改性。

15、本发明的再进一步设置：当脱细胞后处理为交联处理时，采用具有较低细胞毒性的碳化二酰亚胺和京尼平进行交联；碳化二酰亚胺的浓度是1-200nm，京尼平的浓度范围是0.01%-10%(wt/v)，处理时间为30分钟~72小时，处理温度为4℃-37℃。

16、本发明的再进一步设置：还包括辅助脱细胞处理，在主脱细胞处理前和/或后以及主脱细胞处理中，采用物理法、生物酶法、化学法其中至少一种进行辅助脱细胞；

17、当采用物理法进行辅助脱细胞时，物理法为搅拌、震荡、反复冻融法、真空法、超声洗涤法、高静水压法、超临界流体法中的至少一种；

18、当采用生物酶法进行辅助脱细胞时，生物酶法为胰酶、中性蛋白酶、dispase酶、胃蛋白酶、dna酶、rna酶、磷脂酶a2中的至少一种进行处理；

19、当采用化学法进行辅助脱细胞时，化学法为有机溶剂，高渗，低渗溶液中的至少一种进行处理。

20、本发明的再进一步设置：当主脱细胞处理中采用糖脂类的生物表面活性剂进行处理时，糖脂类的生物表面活性剂为海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、纤维二糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂中至少一种；

21、其中当采用阴离子表面活性剂鼠李糖脂或非离子型表面活性剂槐糖脂进行脱细胞处理时，鼠李糖脂或槐糖脂的浓度为0.1%-10%；生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10，处理时间为30分钟-14天，处理温度为4℃-37℃。

22、本发明的再进一步设置：当使用氨基酸型表面活性剂进行主脱细胞处理时氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂：

23、氨基酸型表面活性剂根据取代基的位置分为n-取代的氨基酸型表面活性剂、c-取代的氨基酸型表面活性剂、n-和c-取代的氨基酸型表面活性剂；

24、氨基酸型表面活性剂根据疏水尾巴的数目分为直链氨基酸型表面活性剂、gemini（二聚体）型氨基酸型表面活性剂、甘油脂型氨基酸型表面活性剂、双头基两亲分子（bola）型氨基酸型表面活性剂；

25、氨基酸型表面活性剂根据头基的类型分为阳离子型，阴离子型，两性离子型以及非离子型；

26、其中阳离子型的氨基酸型表面活性剂为椰油酰基精氨酸乙酯和酰基蛋白质的季铵盐的至少一种；

27、其中阴离子型的氨基酸型表面活性剂，亲水基常见为肌氨酸、甘氨酸、谷氨酸中的至少一种，亲脂基常见为椰油酰基、月桂酰基、十四酸、油酸及其卤化物和酯类中至少一种；

28、其中两性离子型的氨基酸型表面活性剂为月桂酰赖氨酸（ll）和烷氧基（2-羟丙基）精氨酸的至少一种。

29、本发明的再进一步设置：当氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂，优选的三类基团组合的氨基酸型表面活性剂，组合规则是一个亲水基+亲油基+一个无机盐基，该类氨基酸型表面活性剂浓度为0.1%-15%，生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10，处理时间为5分钟-7天，处理温度为4℃-37℃。

30、本发明的再进一步设置：当使用烷基糖苷类表面活性剂进行脱细胞处理时，烷基糖苷类表面活性剂（alkyl polyglucoside，简称apg），根据apg碳数的差异分为apg0810、apg1214、apg0814、apg0816、apg1216、apg1218，烷基糖苷类表面活性剂浓度为0.1%-10%，生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10，处理时间为5分钟-7天，处理温度为4℃-37℃。

31、本发明的再进一步设置：当联合使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理时，可联用和/或序贯使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理。

32、本发明的再进一步设置：还包括有终末处理包括如下步骤：

33、一、打孔和漂洗：对得到产品间断打孔，孔径可为0.1-5cm之间，间距可为0.1-5cm之间；对打孔后的产品或者未打孔的产品，用无菌pbs溶液洗涤-5-10次；终末纯化水100～1000％水洗，漂洗生物材料10-20次；

34、二、包装储存：采用冻干保存或生理盐水浸泡湿态保存；

35、三、消毒灭菌：采用环氧乙烷或辐照处理，对产品进行终末灭菌处理。

36、本发明的具体有益效果为：生物表面活性剂，微生物或植物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物，其优势在于活性高、乳化性能好、空间结构复杂、表面张力低、具有高化学稳定性和热稳定性；

37、生物基表面活性剂，生物技术或化学方法合成的表面活性剂，模拟了烷基苷、蛋白质等天然两亲分子结构，相比较常规的皂基类和硫酸盐体系表面活性剂，具有刺激性小、生物降解性好、抗菌性好等特点，保证了人体的安全性，同时，还具有极好的表面性能，其中，氨基酸型表面活性剂和烷基糖苷类表面活性剂，这两者均表现出的优秀生物降解性和生物相容性、高安全性等优良特性；例如氨基酸型表面活性剂能被人体内的酶分解为脂肪酸和氨基酸，有研究发现，在大鼠、家兔进行亚急性试验、慢性毒性试验、粘膜刺激性等试验后，n-酰基氨基酸钠比十二烷基硫酸钠刺激性更很小，安全性更高；

38、将生物表面活性剂和/或以生物质为基础的表面活性剂应用到生物组织来源的脱细胞医用材料的规模生产中，并结合现有的辅助脱细胞工艺等步骤，制备符合注册条件的医用脱细胞材料产品，基于本发明的规模化生产的产品，具有脱细胞彻底，力学强度优良，生物相容性优，无免疫原性等特点。