一种GP-pKlotho纳米药物及其制备方法和应用

本发明属于生物材料，尤其涉及一种gp-pklotho纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、急性肾损伤(aki)是一种高发病率和高死亡率的危重病，特别是对于重症监护病房(icu)入院的患者。aki主要由败血症，缺血/再灌注和肾毒素引起，其特征是肾功能迅速丧失，导致代谢废物的积累，电解质和体液失调。

2、慢性肾脏病(ckd)是一种常见的肾脏疾病，其特点是肾功能逐渐丧失，最终导致肾衰竭，研究发现ckd的发病率、死亡率以及与其相关的危险因素，如高血压、糖尿病、肥胖等显著相关。ckd的发生发展机制，包括肾小球滤过膜的损伤、肾小管功能障碍、炎症反应等。现有证据表明，标准的肾脏疗法在改善aki或ckd方面的疗效有限。因此，有必要采取创新的方法来预防或治疗aki或ckd肾脏病。

3、人类klotho基因(genbank：baa23382.1)编码含有1012个氨基酸的含有单一跨膜区的膜蛋白。在健康的人中，能正常表达klotho蛋白，klotho蛋白是一种由kl基因编码的膜蛋白，它在肾脏中的表达与肾脏疾病有关。klotho蛋白在肾脏中的主要功能是调节磷酸盐代谢和维持肾小管的功能。

4、klotho蛋白的治疗作用主要体现在以下几个方面：抗纤维化作用：研究发现，klotho蛋白能够抑制肾小管上皮细胞的纤维化过程。纤维化是ckd进展的重要机制之一，klotho蛋白的增加可以减少肾小管纤维化，保护肾脏功能。抗氧化作用：klotho蛋白具有抗氧化作用，能够减少氧化应激对肾脏的损伤。氧化应激是ckd发展中的重要因素之一，klotho蛋白的增加可以减轻氧化应激对肾脏的损伤。调节磷酸盐代谢：klotho蛋白能够调节肾小管对磷酸盐的重吸收，从而维持血清磷酸盐水平的平衡。磷酸盐代谢紊乱是ckd患者常见的问题之一，klotho蛋白的增加可以改善磷酸盐代谢紊乱，减少磷酸盐对肾脏的损伤。总的来说，klotho蛋白治疗肾脏疾病的原理主要是通过抗纤维化、抗氧化和调节磷酸盐代谢等作用，保护肾脏功能，减少肾脏疾病的进展。但在aki或ckd后klotho蛋白表达被显著抑制。然而，klotho蛋白在aki或ckd后的具体治疗方法和机制未发现用于急性肾损伤的纳米药物的应运。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种gp-pklotho纳米药物的制备方法，本发明的目的之二在于提供一种所述制备方法所制备的gp-pklotho纳米药物，本发明的目的之三在于提供所述gp-pklotho纳米药物在治疗缺血再灌注引起的急性肾损(ir-aki)伤或慢性肾病(ckd)中的应用，本发明目的之四在于提供一种包含gp-pklotho纳米药物的药物制剂，本发明的目的之五在于提供所述药物制剂在治疗ir-aki或ckd中的应用；解决现有klotho药物在治疗急性/慢性肾脏疾病时，存着klotho蛋白表达被显著抑制，治疗效果不佳的问题。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种gp-pklotho纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、将化合物1(化学式为：)置于过量的无水己烷中沉淀后，将胍功能化单体和二氯甲烷溶液置于冻融循环中脱气并加入化合物1溶液中；将混合溶液加热至室温搅拌30-90分钟，加入过量乙基乙烯醚终止聚合反应；然后过滤，洗涤，真空干燥，得到化合物2(化学式为：)。

5、s2、化合物2以1：1的比例加入三氟乙酸后溶解在二氯甲烷中，反应完成后搅拌4小时，真空干燥为有机化合物3(简称gp)；

6、s3、合成的化合物3(化学式为：)在二氯甲烷中再溶解，并在无水乙醚中沉淀，过滤，洗涤和干燥；将化合物3和klotho质粒(pklotho)按照质量比为2mg：1ug比例置于培养基中培养10-30分钟，合成gp-pklotho纳米化合物。

7、进一步的，步骤s1二氯甲烷溶液中提前加入grubbs催化剂进行催化反应。

8、进一步的，步骤s1中化合物2为淡黄色粉末其反应收率为90％～98％。

9、进一步的，步骤s2反应完成后用甲醇共沸蒸馏法脱除多余的三氟乙酸。

10、进一步的，步骤s3中洗涤和干燥步骤为：将化合物3溶解在水中充分溶解后，转移到截留分子量(mwco)为3000g/mol透析管中，置于超纯水中进行透析1～5天后将化合物3冻干，得到白色粉末。

11、进一步的，化合物1、化合物2和化合物3分别通过1h nmr和凝胶渗透色谱(gpc)进行表征，以评估化学成分和分子量分布。

12、利用上述gp-pklotho纳米药物的制备方法所制备的gp-pklotho纳米药物。

13、上述gp-pklotho纳米药物在制备急性肾病/慢性肾病药物中的应用。

14、一种gp-pklotho纳米药物制剂，包括上述gp-pklotho纳米药物和一种或多种药学上可接受的药物载体或化合物。

15、上述gp-pklotho纳米药物制剂在制备急性肾病/慢性肾病药物制剂中的应用。

16、本发明的有益效果在于：

17、1、本发明所公开的gp-pklotho纳米药物，通过动物实验确定小鼠aki或ckd后gp-pklotho的治疗最适浓度为1mg/kg，gp-pklotho的毒性实验结果显示，在正常老鼠给药(20mg/kg)四周后与对照相比并无明显差异，结果表明该gp-pklotho纳米药物在20mg/kg静脉给药对小鼠没有明显的毒性，这表示gp-pklotho纳米药物是一种安全可用于静脉注射的一种纳米材料。本发明合成的gp-pklotho纳米药物可以修复aki或ckd后引起的肾损伤，旨在允许肾aki或ckd后gp-pklotho释放在肾脏，从而避免全身毒性，具体机制为：gp-pklotho药物的原理是将编码抗原蛋白质的dna通过密码子优化后，包裹gp，形成gp-pklotho，通过gp保护klotho dna不被dna酶降解，被细胞内吞后能从溶酶体高效逃逸，顺利进入细胞核，通过在细胞核中转录出大量的klotho mrna后，在细胞质翻译出klotho蛋白，从而使接种者体内获得大量的klotho蛋白，抵抗或缓解aki或ckd后肾损伤，本发明具有研发生产快，免疫强，安全性较高，可在常温下长期保存的优点。

18、2、本发明所公开的gp-pklotho纳米药物，是一种安全可用于静脉注射的dna纳米材料，可以用来治疗缺血肾的低血压和心血管手术手术引起的急性肾损伤和慢性肾损伤(肾ir-aki或ckd后klotho mrna和蛋白的翻译/转录收到限制)，旨在允许肾ir-aki或ckd后gp-pklotho释放klotho的dna，表达klotho蛋白。具体机制为，gp-pklotho通过静脉注射后被动靶向肾脏近端上皮细胞，在细胞中释放klotho的dna，klotho的dna进入细胞核，与未注射组相比优化过的klotho的dna翻译出5-15倍的klotho mrna，klotho蛋白增加3-8倍，对治疗缺血肾的低血压和心血管手术手术引起的急性肾损伤和慢性肾损伤具有较强的治疗优势。

19、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。