一种可高效递送药物的杂交型纳米颗粒的制备方法与流程

本发明属于药物(特别是核酸药物)递送的，具体涉及一种可高效递送药物的杂交型纳米颗粒的制备方法。

背景技术：

1、核酸类药物是在基因水平上发挥作用的rna或dna等。目前应用较多的有核酸适配体、反义寡核苷酸、信使rna、微rna、小干扰rna、小激活rna等。核酸类药物临床应用面临稳定性差、靶向性弱、难以跨越体内屏障等难题。反义寡核苷酸aso和小核酸sirna作为注射类药物来发挥功能需要克服血管屏障、实现细胞内吞及溶酶体逃逸，同时还需避免被广泛存在的核酸酶降解。

2、截至目前，全球共有15款小核酸药物获批上市(早期3款药物已退市)，包括9款aso药物、5款sirna药物和1款核酸适配体。从已上市药物也不难看出，aso和sirna是较主流的小核酸药物开发类型。

3、小干扰rna(small interfering rna，sirna)，也被称为沉默rna、短干扰rna或非编码rna，天然存在于动植物细胞基因调控系统中。天然sirna长度一般为21-25bp，是宿主细胞针对外源侵入基因所表达的双链rna(double stranded rna，dsrna)进行切割后生成的具有特定序列的小片段rna，可激发与之互补的目标mrna的沉默。基于以上生物学原理，人工合成的sirna小核酸已经被广泛应用于生物学基础科研中。

4、现有小核酸的装载和递送方式主要包括两种：(1)galnac缀合，(2)lnp包裹。其中galnac-sirna是糖类化合物与小核酸形成的单缀合物，将n-乙酰化的半乳糖胺以三价态的方式共价缀合到不同序列的rna的正义链3’末端，形成多糖-rna单缀合物，利用galnac与肝细胞特异性表达的asgpr之间的结合能力，将小核酸药物精准地递送到肝脏中，并通过细胞内吞作用使小核酸药物进入细胞并发挥功能。而目前fda批准可用于临床的lnp配方含有四种脂质，包括可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质，这些成分可以促进单分散纳米颗粒形成，提高纳米颗粒稳定性，实现高效核酸包封，帮助细胞摄取，并促进核酸药物的内体逃逸。

5、反义寡核苷酸是一种合成性的dna片段，其能同mrnas结合，从而诱发其被切成碎片。反义寡核苷酸(aso)治疗药物通常长度为16-20个核苷酸，由化学修饰的核苷酸组成，位于dna中央部分的两侧，主要通过硫代磷酸连接。aso药物的机制主要分为两大类。一类是基于rnase h1的mrna切割降解机制；另一大类是基于aso碱基互补配对，封闭mrna关键区域，造成空间位阻，从而影响mrna的成熟或者翻译。aso药物在研的递送载体包括lnp和cpp(细胞膜穿透肽)，但是lnp局限性在于组织器官只能递送肝脏、脾脏和肺部。而cpp偶联的aso药物存在很大的安全隐患，目前尚未有cpp偶联的药物验证成功和上市使用。另外，codiak公司作为外泌体制药的先驱已经成功推进aso外泌体递送药物进入临床。但是，codiak采用的技术路径是在外泌体的外面使用linker偶联aso药物，这种方法虽然验证了外泌体递送aso药物的可行性，但是存在linker脱落，系统性暴露aso药物的风险。

6、脂质体和聚合物纳米颗粒等递送系统已被广泛用于提高aso和sirna的稳定性并改善其药代动力学特性，但其仍然存在递送效率低下、免疫原性高等技术瓶颈。开发低系统毒性、高递送效率、可精准靶向的递送系统是aso和sirna药物研发未来提高核酸类药物递送主攻方向。

7、此外，已知外泌体(exosome,ev)是由细胞分泌的、直径范围50-150nm、具有双层磷脂膜的胞外膜泡结构。真核和原核生物细胞均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等哺乳动物体液中。外泌体作为细胞间信息交流的载体，包裹来自上游细胞的蛋白质、rna、糖类、脂类等分子，在被下游细胞内吞后可实现对接收细胞的刺激和调节。自发现以来，外泌体的纳米尺度、低免疫原性、可携带各种生物活性分子的特点使其具有成为天然药物、药物载体、诊断工具的潜力。近年来，外泌体作为新型药物的递送载体引起了生物医药行业的深切关注，且外泌体被用来递送反义寡核苷酸、活性蛋白质和小分子药物等已经被临床试验验证。基于外泌体是天然驯化的生物大分子载体，在体液中广泛存在，免疫源性低，安全性高，还可跨越血脑屏障，且有望实现非肝靶向，将药物更精准递送至“目标地”，同时具备内源和外源改造的潜力，可以实现更丰富的功能等优势，其是非常有潜力取代lnp和galnac的新型递送技术。

8、目前为止，关于外泌体递送药物的研究主要在于利用未杂化的外泌体进行药物递送或者是将特殊的外泌体与脂质体融合以增强或者获得某特定方面效果，例如：

9、中国发明专利公开cn 114729356 a提出了一种靶向stat6的细胞外囊泡-aso构建体，其中详细阐述了一种在外泌体表面装载aso药物的方法。该方法的贡献是首次验证了外泌体外表面装载aso药物实现体内递送的可行性，并且对于aso连接到外泌体表面的方法进行了详细挖掘。但是该专利方法中对于外泌体递送aso药物只局限在外表面装载而未进行外泌体内部装载aso的可行性尝试。外部装载aso药物虽然可行，但是依然存在aso药物脱落不依从外泌体递送而是系统性暴露的风险。

10、中国发明专利公开cn116064394a提出了一种抗肿瘤药物的载药递送系统，其利用肿瘤细胞的外泌体具有天然的归巢能力和良好的血浆稳定性，与细胞膜有更高的亲和力的特性，从病人自身获得肿瘤细胞的外泌体后与脂质体融合，制备得到杂化外泌体，由此构建抗肿瘤药物的载药递送系统。该专利公开的主要贡献在于首次发现癌细胞的外泌体与脂质体融合而成的杂化外泌体能够靶向癌细胞。

11、中国发明专利公开cn111450061a提出了一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统及其制备方法和应用，其中药物递送系统由间充质干细胞外泌体和脂质体通过杂化融合构建而成，该方法贡献在于发现了间充质干细胞外泌体的抑制炎症的效果，降低全身的副反应。

12、现有技术中利用特殊外泌体的方法存在明显的局限，即特殊的外泌体工业级生产几乎无法实现，获取非常困难，生产得率非常低下，导致没有商业利用价值。

13、如上所述，虽然现有技术关于外泌体的研究已存在较多报道，但均未揭示相对易于工业化获取的非特殊的外泌体对其他递送载体例如脂质体递送能力的增强作用以及实现路径。

技术实现思路

1、本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的可高效递送药物特别是核酸药物的杂交型纳米颗粒的制备方法。

2、为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于递送药物的杂交型纳米颗粒的制备方法，包括：

4、提供包封有药物分子的纳米脂质颗粒原液；

5、将所述包封有药物分子的纳米脂质颗粒原液与外泌体混合，进行孵育；

6、对所述孵育后的混合物进行冻融处理，所述冻融处理指将混合物进行多次、连续的先冷冻后解冻操作，其中每次的冷冻时间超过15分钟；

7、对所述冻融处理后的混合物进行离心超滤。

8、优选地，每次的冷冻时间相同或不同，但均不超过60分钟。

9、进一步优选地，每次的冷冻时间相同或不同，选自25～40分钟。

10、优选地，冷冻的次数为少于8次。

11、进一步优选地，冷冻的次数为大于2次。

12、根据一些具体实施方式，冷冻的次数为3次或4次或5次。

13、优选地，冷冻在温度-75～-85℃下进行，解冻在室温下进行。

14、优选地，所采用的外泌体的颗粒浓度为9e11～9e12particles/ml，并且将其与所述包封有药物分子的纳米脂质颗粒原液按照体积比1:0.9-0.95进行混合。

15、优选地，所述孵育在温度30～40℃下进行，且时间不超过6小时。

16、进一步优选地，所述孵育时间为0.5～1h或者1-1.5h或者1.5-2小时。

17、进一步优选地，所述孵育在温度35～40℃下进行。

18、优选地，所述孵育采用恒温水浴的方式。

19、优选地，所述离心超滤采用截留分子量为80～120kda的超滤管，超滤前，先将用缓冲液稀释所述冻融处理后的混合物。

20、进一步优选地，所述离心超滤采用截留分子量为95～110kda的超滤管。

21、优选地，所述离心超滤的离心力为2800～3200g，离心后收集被截留的部分。

22、进一步优选地，所述离心超滤采用pbs缓冲液作为洗涤液，并在离心超滤后采用pbs缓冲液作为杂交型纳米颗粒的存储液。

23、根据一些具体实施方式，所述离心超滤包括以下步骤：

24、(1)将孵育液和pbs缓冲液加入超滤管的上室，2800～3200g离心0.8～5min，去除超滤管的下室中的液体；

25、(2)向超滤管的上室中加入pbs缓冲液，2800～3200g离心0.8～5min，去除超滤管的下室中的液体；

26、(3)重复步骤(2)3～5次；

27、(4)向超滤管的上室中加入pbs缓冲液，2800～3200g离心，直到超滤管的上室中的液体的体积与冻融后的物料离心超滤处理前体积大致相同，超滤管的上室中的液体即为超滤后的杂交型纳米颗粒。

28、离心超滤的目的是将反复冻融后的物料中除了装载有药物分子的杂化外泌体之外的颗粒物质去除，例如未结合外泌体的包封有药物分子的纳米脂质颗粒、空载的脂质纳米颗粒、未装载药物分子的外泌体和被破坏的外泌体、游离的药物分子等。

29、经离心超滤纯化后的杂交型纳米颗粒基本无免疫原性，药物分子递送效率更高。

30、本发明中，所述药物分子为核酸分子。通过本发明的杂交型纳米颗粒递送的核酸分子在递送至细胞中后被有效释放，并高效抑制对目标基因的表达，显著提高目标基因敲低效率。

31、优选地，所述药物分子为mrna、sirna或aso，或者sirna与小分子药物的组合，或者aso与小分子药物的组合，或者mrna与小分子药物的组合。

32、本发明中，所述外泌体为相对易于工业化获取的非特殊的外泌体，例如乳源性外泌体、hek细胞外泌体、免疫细胞外泌体、植物外泌体中的一种或多种。

33、优选地，所述外泌体可选择性地工程化修饰大分子蛋白质和/或小分子药物。通过工程化修改实现多种类型药物的同时递送，具有广阔的临床应用前景。

34、本发明第二方面还提供一种杂交型纳米颗粒，其由上述制备方法制备得到。

35、由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：

36、本发明首次提出采用特定方法将外泌体与lnp进行杂化融合制备得到杂化纳米颗粒，并由此构建出适于各类药物分子或者多种药物分子的组合的杂交型纳米颗粒。该杂交型纳米颗粒作为一种新的载药系统提供了新型载药效果，不仅兼具外泌体和lnp递送各自优点，且可有效克服lnp免疫原性问题，并且与此同时具有出乎意料的强的刚性，实现雾化给药，耐受温度高，于非冷冻条件甚至常温保存，稳定性好。相比通过lipo脂质体转染外泌体构建的递送sirna的外泌体，本发明的杂交型纳米颗粒可以递送的范围从sirna扩展到各种其他药物分子。此外，该杂交型纳米颗粒不依赖于特殊的外泌体，外泌体来源广泛，生产成本可控，具有较高的商业利用价值。