专利名称:包新形状颗粒高免疫原性乙肝表面抗原的制备方法
本发明是关于一种可用作为疫苗或疫苗中间体的颗粒溶液或悬液。本发明是关于含有新形状颗粒、高免疫原性乙肝表面抗原制备的方法。本发明涉及含有该物质的抗原的灭活过程，灭活是通过加热于高浓度抗原性物质而完成的，高浓抗原性物质就是指在其中不需加入诸如白蛋白之类的蛋白质给以稀释的意思。本发明是关于该抗原组合物制备的方法，此抗原组合物可用于免疫动物，尤其是可免疫人类。
多年前，Alyred M.Prince对于乙肝表面抗原和乙肝病毒的关系曾明确的给以阐明(Pro.Nat.Acad.Sci.U.S.，60814-821，1968)。此抗原主要位居埋于脂蛋白颗粒的膜蛋白上，此脂蛋白颗粒具有大小约为18-24纳米的颗粒和同样大小直径的丝状物。现知，这些颗粒和丝状物形成膜的片断相当于乙肝病毒粒子的围绕物，也就是“Dane”颗粒。
此后，Blumberg etal.在美国专利中(专利号3，636，191)，公布了含有这种颗粒的疫苗。以后，Prince etal.公布了另一种乙肝病毒疫苗，此疫苗含有由“Dane”颗粒和丝状物而来的膜蛋白。这些“Dane”颗粒和丝状物相当于乙肝e抗原或与乙肝e抗原有关，乙肝e抗原见于许多慢性乙肝病毒携带者体内。
由于上述工作的开展，在美国采用了抗乙肝病毒的疫苗，此疫苗含有乙肝表面抗原颗粒。此疫苗是由慢性乙肝病毒感染病人的血浆中取得含颗粒的乙肝表面抗原，再以酶消化法制备而成，上述美国专利(专利号3，636，191)中对此有些叙述。该疫苗是以耗资巨大的纯化过程制备而成，并造成大量免疫原性的丢失。其结果，为了保证有足够的免疫反应，就必须加大所制成的抗原(乙肝表面抗原)的剂量。因为这些因素，使用该疫苗时，其价格相当昂贵，每个剂量约需30美元或更高。因为免疫时必须有初次注射和二次加强注射，故在美国，抗乙肝病毒免疫开支约为100美元。像这样的开支，在世界上需要疫苗数量十分巨大的那些国家和地区是负担不起的。
因此，提供一种含乙肝表面抗原的、本质上更纯形状的、具有大大增强免疫原性的乙肝疫苗成为人们所期望，以便可以使用更小的剂量和较少的开支。当然，同样重要的是感染性病毒进入血浆之始必须是完全灭活的，以保证无感染之危险。
乙肝感染大部分是涉及居住在亚洲和非洲发展中国家的人们，这些国家用于公共卫生事业基金有限。在20世纪，提供这样一种疫苗，保护亿万人民免遭乙肝病毒的感染，继而免遭续发的肝硬变和肝癌的危险，而且提供疫苗的费用又是人们可以负担的起的，这确是一件迫切而有意义的事。在许多发展中国家，假若使用疫苗，其免疫费用必须在每人1美元以下。
在共同未决专利申请中(专利申请号656833)公布了一个制备疫苗或疫苗中间体的方法，此疫苗或疫苗中间体的特征在于含颗粒乙肝表面抗原极大限度地转变为一种在自然界尚未见过的新形态，这些新形状惊人地加强了免疫原性。
根据在那里报告的实验，含该物质的高浓度乙肝表面抗原的制备步骤是
1.由血浆中沉淀乙肝表面抗原，例如，人血浆中含有乙肝表面抗原，加入聚乙二醇将乙肝表面抗原与血清中所含的其它血清蛋白分离开;
2.将分离得到的乙肝表面抗原通过羟基磷灰石柱的负吸附作用，进一步除去大部血清蛋白;
3.将负吸附的乙肝表面抗原经等密度离心处理，以分离存留下的完整的“Dane”颗粒并进一步除去残存、夹杂的血清蛋白;
4.将离心分离得到的颗粒经加热灭活处理，颗粒加热处理时的浓度为0.5-10mg/ml，温度为101-104℃，2-5分钟。此后，将加入颗粒冷却，例如，将颗粒通过冷水浴冷却。
上述第四步骤中加热灭活的一步必须要使蛋白质浓度不断处于稳定之中，以避免颗粒的变性。
现已令人惊奇地发现，上述第三步得到的物质可以在不加入任何乙肝表面抗原稳定剂的条件下加热灭活，即在含颗粒的乙肝表面抗原中不加入诸如白蛋白之类物质的稀释剂。还进一步发现，加热灭活不仅提供一个不含白蛋白的组合物，而且这一组合物具有新的乙肝表面抗原的形态样式，易于以电子显微镜观察。
可以相信，血清中存在的其它病毒(例如人类血清)，以同样的灭活方法可得到其它抗原体尤其是病毒的高浓抗原性组合物，假若对病原体的灭活是按照本发明的方法，即不加入诸如辛酸钠稳定的白蛋白稳定剂的方法，此高浓抗原性组合物还可作为疫苗或疫苗中间体使用。应注意到提供一个尽可能纯的疫苗，即几乎含外源蛋白(如白蛋白)是有很大优点的。
这样，本发明显然地涉及病毒灭活的改进方法，制成含该病毒和抗原组分的高浓物质并加热灭活之。其中该高浓物质乃由含有上述病毒的血清获得，而血清蛋白应根本上除去。在加热灭活该高浓物质的处理中不需加入蛋白性稀释剂稳定之。在抗原组分的浓缩期间，或在病毒的加热灭活期间，整个过程完成的任何时间最好都不加入蛋白。在此以后，如果愿意的话，可以在高浓物质中加入诸如蛋白的稀释剂;(如血清白蛋白)或加入佐剂。也可加入生理盐水稀释以供注射使用或供进一步的处理使用。病毒的加热灭活是加热含抗原组分的高浓物质，即乙肝表面抗原颗粒，颗粒浓度为0.5-10mg/ml，温度为101-104℃，2-5分钟，此后，将加热了的颗粒冷却，例如，将颗粒置于冰浴之中。
总之，乙肝疫苗的制备，根据本发明的步骤如下
1.由血浆中沉淀乙肝表面抗原，例如，在人的含有乙肝表面抗原的血浆中加入聚乙二醇，将乙肝表面抗原与血清中含有的其它蛋白质分离开;
2.将分离出的乙肝表面抗原通过羟基磷灰石柱负吸附，进一步除去大部血清蛋白;
3.将负吸附的乙肝表面抗原经等密度离心，分离出存留下来的完整的“Dane”颗粒，并进一步除去残存，夹杂的血清蛋白;
4.将如此离心分离得到的颗粒经加热灭活处理。处理时不加入蛋白性稀释剂，颗粒浓度为0.5-10mg/ml，温度为101-104℃，2-5分钟。此后，将加热的颗粒置于冰水中冷却之。
根据本发明，该物质经上述1至3各步处理后，含颗粒乙肝表面抗原的蛋白重量与样本蛋白总重量之比，至少应为95%，最好应为99%。加热灭活期间，在该组合物内，不需加入辛酸钠处理的白蛋白作为稀释剂稳定之。这样，加热灭活过程是在没有稳定剂，也没有其它血浆蛋白的条件下进行的。
加热灭活最好是在101-104℃下进行，将第三步得到的没有稀释的纯颗粒溶液通过一个2mm直径的管子，(例如铜管子或不锈钢管子等)该管浸入101-104℃的热介质中，(例如油浴)加热的总延长时间为2.5-6分钟。应该认识到本发明采用的方法有时要求溶液在管内不断加热至101-104℃，因此，“总加热时间”要长于溶液真实加热至101-104℃的时间。当然，二者之差取决于溶液在管内的流速。
应该认识到，当溶液在管内不断流动着瞬时加热时，必须要提高压力以克服温度100℃以上时，溶液蒸发所产生的阻力。这一问题，可用高压液相色谱泵和一个连在接受瓶上的水静压控制接头来解决。
如果愿意的话，可对第三步得到的纯化抗原，以诸如吐温80的清洁剂(例如等容积的2%吐温80加入等容积水中)进行附加的灭挥处理。这一处理可进一步加强疫苗的安全性。然而，最好除去清洁剂处理这一步，因为，灭活过程没有进行清洁剂处理，产品有更高的免疫原性。
需要时也可以经瞬时加热灭活步骤处理后，将收获的纯化的病毒灭活颗粒溶液加入佐剂使之吸附于磷酸铝盐或氢氧化铝凝胶上。为了在热带国家使用，在加入凝胶铝之前，可将疫苗冷冻干燥，如果需要，可在疫苗加水溶解后，再加入凝胶铝。
此后，用诸如0.15M氯化钠的生理性介质稀释而制成疫苗的最终产品。
乙肝表面抗原疫苗最终产品含蛋白浓度为0.1-10微克/毫升。适宜的注射剂量取决于接受注射人的年令。成年男性的使用乙肝表面抗原的标准剂量在1至10微克之间，可肌肉、皮下或皮内注射。
图1表明以瞬时热处理由小园颗粒产生的丝状物形态a.线形丝状物;b.封闭的环形丝状物;c.分支形丝状物;d.开放的环形丝状物;e.分支的环形丝状物;f.多分支的丝状物。
图2图示本发明制备疫苗的方法。
图3表示上述第1至第3步处理得到的含颗粒乙肝表面抗原以磷钨酸负染色的电镜照片。此颗粒未经本发明瞬时加热的处理，故含有的乙肝表面抗原颗粒的形态主要为18-24mm的球形颗粒。
图4为与图1相似的电镜照片，表示含颗粒乙肝表面抗原经加热处理后，颗粒转变为线形、分支形和环形的丝状物形态。
图5为与图3、图4相似的上清部分的电镜照片，此上清部分由图4所示的溶液离心20分钟，8000g转速，经过滤后而得之上清产物。
图6为与图3到图5相似的电镜照片，此图6的样品是通过由离心20分钟，8000g转速所得之沉淀物，重新悬于原容积的等渗盐水中制成。
图7为与图3到图6相似的电镜照片。图7的样品表示以本发明制备的含颗粒乙肝表面抗原瞬时热处理时，加入3mg/ml辛酸钠处理的血清白蛋白。电镜下得到同样的形态结构，但由于辛酸钠处理的血清白蛋白的同时存在，使含颗粒乙肝表面抗原在电镜下不易见到。
图8显示在小鼠体内，加热灭活对纯化的乙肝表面抗原免疫原性的效应。该抗原形态已表示在图3至图6之中。
此后，在不加入稳定剂或蛋白稀释剂的情况下，将组合物用0.22微米的过滤膜，过滤处理;在如上所述的给以一定压力的情况下，将该组合物过滤液通过一个0.1-10mm直径，最宜为3mm直径的不锈钢管子(此管置于102-105℃油浴中)，加热灭活，101-104℃下，1-15分钟，最宜为2-5分钟。给予的压力必须可足够地克服沸腾蒸汽压，即800到1000mm汞柱或900-1000mm汞柱。
然后，将该加热溶液收集在管子内，管内置于冰水中，使加热物质冷却。一般，在热处理停止后，不断冷却，5分钟内可降至2-4℃。然而，为获得最好结果，可将溶液通过二级管圈，管圈置于不同温差的水浴中，如20-100℃或75-90℃。
然后，在瞬时加热灭活并纯化的含该物质乙肝表面抗原中加入佐剂，适宜使用的佐剂为磷酸铝盐。一般，将事先消毒灭菌的磷酸铝盐在无菌操作下，加入灭活并稀释的抗原中，每一毫升稀释的抗原加磷酸铝盐0.3-0.6mg。此后，无菌下，将含佐剂组合物装于适当的容器包装内，再经“巴氏消毒”，(65℃下10小时)，作为附加的消毒以进一步保证最终产品的安全性。在使用疫苗免疫前，疫苗应保存于2-6℃下，有效期三年。
用上述方式纯化乙肝表面抗原，如上述的加热办法处理未稀释的含颗粒乙肝表面抗原，其结果，在没有稳定剂同时存在的情况下，含颗粒乙肝表面抗原成形的形态与专利号;656，833专利中所述的形态一致。这一过程不仅避免了加入稳定剂/稀释剂而带来的消费，而且使一种更为容易的监测系统，确认以本发明的方法制成的新形态成为可能，这些新形态在电镜下更易于见到。而初始的含颗粒乙肝表面抗原一般是球形，大小为18-24纳米(图3)，经本发明的方法处理后，该颗粒衍化并大部转变为更多形态丝状物，见于图1，4，6，特别是，从图4到图7，尤其是图5所示。在图4中所见到的丝状物是迄今尚未看到过的。这些含有乙肝表面抗原抗原性的丝状物其特征在于分支或呈环形。它们可呈曲线或直线形的构型。一般说来，丝状物长度至少50纳米，通常在100-1000纳米之间。
当丝状结构分支时，分支结构的长度至少50纳米，通常是100-300纳米。以本发明的方法所得到的丝状物，其中有些丝状物具有分支，每一丝状物结构至少有三个分支，并有一个不规则的结构，其最小长度至少为100纳米，更多的为200-1000纳米。
通过图4到图7的电镜照片，可以观察到本发明的含颗粒乙肝表面抗原包括有环形颗粒、分支形丝状物、线形丝状颗粒和16-25纳米大小的球形乙肝表面抗原颗粒。
形态形式中包括环形颗粒，此颗粒具有自身伸出的丝状部分。这些丝状颗粒的长度经常不少于50纳米，通常在100-300纳米。
当使用清洁剂处理时，不分支丝状物，可用在20℃下，密度为1.210至1.230GM/CC(平均1.224 GM/CC)之间，而进一步得到验证。这样，清洁剂处理的不分支丝状物便可与某些慢性乙肝表面抗原携带者血浆中见到的不分支丝状物相区别，后者的平均密度为1.200。慢性乙肝表面抗原携带者具有所谓的“Dane”颗粒，具有该丝状物，或与该丝状物有关。
“环形”颗粒包括那些实质上形成完全的环，以及那些实质上圈起来的一个区域。该区由含该物质的乙肝表面抗原围绕界限而成，可形成包括椭园形、面包圈形的任何式样，即它可以具有规则的或不规则的形态结构。
这一形态与以前描述过的分子微园颗粒有明显的差别。后者的特征在于有一个由多肽链疏水端组成的中央核心，肽链的亲水端则伸向粗略球状颗粒的表面，而根据本发明制备成的丝状物则没有与中央核心相连接。有些丝状物呈不规则形的环形，环本身可具有许多突出丝状物，但是，正常情况下，突出丝状物不超过三个，通常为二个或一个。当然，本发明的颗粒则肯定没有伴以向外突出丝状物的致密核心。
本发明着重叙述了由乙肝病毒灭活至乙肝疫苗的过程。但是，此过程以叙述过的方式去灭活其它的活病毒时，也是很有用的，这一灭活是在含该同一病毒的浓缩纯化物质和所说病毒的抗原性组分中进行的，这些其它的活病毒，特别包括脂类被覆的病毒，逆转录病毒，腺病毒，带状疱疹病毒，水痘病毒，呼肠孤病毒，粘液病毒，麻疹病毒，腮腺病毒和白血病病毒。根据本发明，在由抗原性物质制备成疫苗的过程中，可将特异性病毒灭活，这些病毒包括流感病毒，(含各种不同的流感病毒株，如X-31株，日本株)，E-B病毒，脊髓前角灰白质炎病毒，白喉，鸡肉瘤病毒，鸟疫病毒，口蹄疾病毒，霍乱，甲肝病毒，人亲T淋巴细胞-3型病毒，狂犬病毒和天花病毒。
例1
将从慢性乙肝表面抗原携带者采集的含乙肝表面抗原和e抗原的血浆PH调至4.6，用Westphalia循环离心机(Continous flow centrifuge)以10，000转/分速度离心澄清。在上清液中加聚乙二醇600(PEG600)，使其浓度在4℃时达4%，搅动20分钟。使其自然沉降2小时得到沉淀，将沉淀溶在原体积1/5的蒸馏水中，调PH至7.5-8。再将PH降至5.0，离心得到沉淀。然后将上清液PH调至4.6，再加聚乙二醇，使其终浓度达3%。
将沉淀置于4℃下过夜，在中和条件将其溶解，将PH降至如前的5.0，将悬液澄清。再将材料的PH值调至6.8，加入0.005M磷酸盐缓冲液，用等体积羟基磷灰石作柱料，进行2-3次吸附层析，再用0.02M和0.05M磷酸盐缓冲液洗脱吸附在柱料的物质。最后将初始上清液与通过羟基磷灰石的洗脱液混合，离心澄清，用Amicon中空纤维园筒超滤器浓缩至初始血浆体积的0.3%。用固体溴化钾将乙肝表面抗原的密度调至1.25毫克/毫升。将其移至具有密度为1.3克/毫升溴化钾垫的一个1.05到1.2克/毫升溴化钾线性密度梯度上，在Beckman离心机用Ti-14转头，以28，000转/分速度离心18小时，将水泵入转头中心以分级分离离心后管内各部分，将密度1.17克/毫升到1.22克/毫升部分取出。
将纯化的抗原浓度调至1毫克/毫升(基于OD280，E1厘米＝3.73)，通过一个0.22微米孔径的Millipore超滤器过滤。然后将其在950毫米水银柱压力下通过一个2毫米直径的不锈钢螺旋管，将管悬在102℃的油浴中，使其在102℃下持续2分钟，升温到102℃需40秒，因此共需持续2分40秒，稀释，加入灭菌的磷酸铝，最后在65℃下用明矾吸附疫苗10小时，进一步灭活病毒。
比较例2
重复例1程序直至在102℃加热灭活步骤前停止，从而得到例1所述含1.18毫克/毫升蛋白的乙肝表面抗原。用多价或单价人抗血清蛋白对照，根据凝胶扩散研究该抗原纯度等于或大于95%。试验表明该提取物不再含可观察到量的人血清蛋白。将一部分样品用2%磷钨酸负染色后在195，000倍的电镜下观察。电镜图示在图3。
例3
将一部分例2的样品通过一个直径2毫米的不锈钢管，该管浸在102℃的油浴中，40秒是达到102℃所需时间，故需持续2分钟40秒。其中该蛋白组合物在102℃下热处理2分钟。加热后样品是略带乳白色，说明有些凝集。取部分样品，负染色后在电镜下拍片。如图4所示，加热后出现了线性分支，一般呈环形丝状的表面抗原颗粒。这些颗粒在初始制备液中没出现。这些颗粒是由于膜融和产生，而不是样品凝集的结果。因为既使将其超声振荡30分钟，也不会影响其形态。
通过离心将丝状和球状颗粒彼此分离，测定其相对免疫原性。
例4
将热处理的例3的样品在8，000g下离心20分钟，将分离的上清液中加入50微克/毫升的吐温20(Tween)，再通过孔径为0.22微米的Millipore滤膜过滤，加吐温可减小样品在过滤时的损失。然后将过滤后样品负染色，再在电镜下观察，电镜图示在图5。
例5
将例4过滤的沉淀物重悬在等渗盐溶液，使悬液体积为初始体积，负染色，在电镜下观察，电镜图示在图5。
例6在有清蛋白存在下瞬时加热灭活
将例3所述含3毫克/毫升人血清清蛋白，并用辛酸盐稳定的制备物瞬时加热。又产生了多晶型丝状物。(见图7)。
例7制备加佐剂的蛋白组合物
分别在30微升例2和例3的组合物，40微升例4的组合物和90微升例5的组合物加入10毫升灭菌的普通盐水，得到每毫升4微克蛋白悬液(基于OD280计算)。由于加热这些悬液略呈乳白色，这种蛋白浓度的悬液被认为是最合适的。通过BIORAD蛋白试验可测得更准确的蛋白含量。用等体积的荷兰Voor de Volksgesundheid of Bilthoven的Rijks研究所制备的含1.2毫克/毫升的磷酸铝凝胶调整其浓度，每0.3毫克明矾磷酸盐可吸附1微克/0.5毫升剂量的蛋白。
用盐水稀释，含1/4和1/16各种抗原的悬液同样如上述吸附到明矾佐剂上，得到的剂量约为0.25到0.6微克。
用0.5毫升各例所述制剂，腹膜内接种到三组雌ICR瑞士小鼠中，每组20只，每只体重20到22克。这样，每种样品制剂接种60只鼠，三个稀释液每个接种20只。用对照佐剂给10只鼠接种。将所有小鼠的心血排空，将血分别收集到各试管中，在室温下凝血，搁置4℃下过夜，然后离心回收血清(以3，000转/分离心15分钟)。用AUSAB
试验箱(美国伊利诺州，芝加哥Abbott试验室)进行定量平行线放射免疫试验测定各种血清，与每毫升含100个国际单位(IU)的WHO国际HBIG标准比较。样品的放射活性超出了稀释液曲线范围，而且每分钟计数(CPM)小于负对照，说明计数要用1∶10和1∶10的稀释液进行。用AUSRIA
试验箱以U.S.F.D.A.提供的HBSAg/ad标准进行定量平行线放射免疫试验测定样品的乙肝表面抗原免疫原性。得到的结果与用德国国家HBSAg/al标准测定的结果一致。
下面表1表示从例2到例5不同样品的蛋白含量和抗免疫原性以及它们的比率，即“抗免疫原比活性”。可以看出，热处理降低抗免疫原比活性约50%。这是富含如图6所示例5所述的丝状抗原的证据。
图8表示用四种制剂的稀释液一次注射后28-30天产生了至少1毫国际单位/毫升乙肝表面抗原的抗体的小鼠百分数。依据这个标准衡量，热处理的制剂明显地增加了免疫原性。估计使50%小鼠血清新换所需用量经热处理后可增加7.4倍效价的免疫原性，如下表2资料所示，例5的丝状部分是具有29.5倍效价的免疫原最强的部分。
表1
热处理对抗免疫原比活性的影响
例号材料 乙肝表抗蛋白(1)抗免疫原性(2)抗免疫原比活性(3)
(毫克/毫升) (毫克/毫升) 及占处理前的百分数
2 未处理的 1.44 0.55 0.38 100
乙肝表抗
3 102℃下加 1.44 0.27 0.19 50
热2分钟
RX乙肝
表抗
4 102℃下加 0.74 0.23 0.31 81
热2分钟
8000g上清液
5 102℃下加热 0.35 0.02 0.06 16
2分钟8000g
沉淀
(1)用BIORAD蛋白试验
(2)用与德国HBSAg/ad标准比较的AUSRIA试验进行平行线放射免疫试验(RIA)。
(3)抗免疫原比活性抗免疫原性/乙肝表抗蛋白
表3 加热失活的乙肝表抗对小鼠免疫原性的影响
(A)对50%小鼠血清转换所需量(ED)的影响
例号 材料 估计的(ED) 效价
Log 10 纳克/小鼠 纳克/小鼠
2 未处理的乙肝表抗 2.91 813 1.0
3 在102℃加热2 2.04 110 7.4
分钟RX乙肝表抗
4 在102℃加热2 2.46 288 2.8
分钟8000g上清液
5 在102℃加热2 1.44 27.6 29.5
分钟8000g沉淀
(B)对应答者中有意义的乙肝表抗抗体水平的影响
例号 材料 估计达到1.5log1毫国际单位/毫升 效价
的材料用量
Log 10 纳克/小鼠 纳克/小鼠
2 未处理的乙肝表抗 3.18 1500 1.0
3 在102℃加热2 2.40 250 6.0
分钟RX乙肝表抗
4 在102℃加热2 2.46 288 5.2
分钟8000g上清液
5 在102℃加热2 1.95 89 16.8
分钟8000g沉淀
从上面资料得出的结论是加热上述方法分离得到的纯乙肝表抗颗粒增加它的免疫原性，从而得到极高的抗体水平。定量参数是从估计产生几何构型有意义的乙肝表抗抗体水平1.5 Log 10毫国际单位/毫升(30毫国际单位)所需的量衍生的。用这个参数，将其在102℃加热2分钟估计能增加免疫原性6倍。因此，本发明含蛋白物质的特征是具有比主要含直径18-24纳米的球型乙肝表抗颗粒的免疫原性高4～6倍，优选的为高6～8倍。当然，通过把本发明的丝状结构颗粒与直径18-24纳米球形颗粒分离开，得到的组合物免疫原性高20～30倍，这在例5所述资料中已得到证实。
令人惊奇地发现在102℃灭活本发明提纯的乙肝表抗2分钟，不仅如期望的降低了残留感染性，而且出乎意料地急骤增加了免疫原性。这种增强的免疫原性使我们可能制造低蛋白含量的疫苗，从而降低了生产成本，使疫苗价格大大下降。
例8比较估计用其它类似纯化技术和灭活技术得到的热灭活疫苗
用上述纯化程序，将乙肝表抗用聚乙二醇沉淀两次，再通过负吸附到羟磷灰石上，然后等密度离心。这种部分纯化的材料定名为样品A。
另一种部分纯化的乙肝表抗组合物定名为样品B，它是用Brumelhuis等人的方法制备的。(见Eds.P.Maupas和P.Guesry在1981年荷兰Elsevier举行的血清学讨论会会刊发表的文章“加热灭活乙肝疫苗来制备乙肝疫苗”)。
用磷酸盐缓冲盐水将样品A稀释到1毫克/毫升，2毫克/毫升，4毫克/毫升和6毫克/毫升，然后如下述热处理。依据Brummelhuis的方法将样品B重悬调至浓度为每毫升含20微克乙肝表抗，然后再热处理。
将样品A和B置于内径为2毫米的金属管内，接一段短的硅橡胶管，用金属螺夹封住。将其浸在102℃的热稳定油浴中2分钟以灭活样品。然后将其移至冰水浴冷却。
将灭活样品如图3到图6用磷钨酸负染色，然后在电镜下拍片，样品A(1-6毫克/毫升)的电镜图显示它具与图4-6一样的多态丝状物。根据荷兰红十字会的方法制备的灭活样品，样品B除含乙肝表抗外还至少含3毫克/毫升的其它血清蛋白，它们的电镜图显示不具乙肝表抗丝状颗粒。还发现如例6中加辛酸钠稳定后的清蛋白1～3毫克/毫升不改变向多态的转化(见图7)，免疫原性仍然增强。结论是，乙肝表抗的纯化方式及热处理时的浓度决定了是否需要瞬时热处理，从而使乙肝抗原颗粒转化成图4～6所示新的，不一般的多态。因此，热处理本身并不是改变形态的决定因素，得到新的改善其免疫原性的形态是取决于纯化技术与所用热灭活方式的结合。
进一步叙述本发明的最佳实施方案。在开始研究时是用诸如清蛋白的合适的蛋白稀释纯化抗原得到多态抗原，加清蛋白等是为了使抗原热处理时不变性失活。而本发明发现可以不予先稀释加热灭活抗原。因而，最佳实施方案就是将纯化而未稀释的乙肝表抗加热灭活。
本发明的原则是通过瞬时加热、灭活纯的浓膜制备物来加强类脂膜免疫原的免疫原性，从而降低它的用量。因此对诸如在酵母，细胞培养等真核接触中生产的乙肝重组DNA疫苗及流感，狂犬病，麻疹，疱疹病毒，如HTLVⅠ，Ⅱ和Ⅲ的逆转录病毒，寄生虫疫苗及其它现在已有和正在研究的疫苗本发明是均适用的。
权利要求
1、热灭活含病毒和它抗原成分的浓物质的方法，其特征是该浓物质不用其它蛋白类材料稀释。热灭活温度为101-104℃，1到15分钟。
2、根据权利要求
1所述的方法，其中所说的浓物质没用任何稳定材料所稀释。
3、根据权利要求
1所述的方法，其中所说的浓物质是通过将其它血清蛋白从含该病毒的血清中除去而得到的。
4、根据权利要求
3所述的方法，其中所说的制备该浓物质的步骤是除去其它血清蛋白时不用任何蛋白稀释含该浓物质的病毒。
5、根据权利要求
3所述的方法，其中灭活的浓物质中含颗粒状的抗原至少为1毫克/毫升。
6、根据权利要求
1所述方法，将该浓物质加热灭活后立即冷却。
7、根据权利要求
6所述方法，其中含颗粒状的乙肝表面抗原是通过下列步骤得到的
(1)将血浆与聚乙二醇接触，从血浆沉淀乙肝表面抗原，从而将乙肝表面抗原与其它血清蛋白分离;
(2)将分离出的乙肝表面抗原通过羟基磷灰石的负吸附进一步除去血清蛋白;
(3)将吸附的乙肝表面抗原等密度离心。
8、根据权利要求
7所述方法，其中的颗粒置于一个直径0.1到10毫米的管中，将该管悬在热介质中，在800-1000毫米水银柱压力下，于101到104℃加热1到15分钟。
9、用权利要求
1的方法生产的蛋白类物质。
10、用权利要求
6的方法生产的蛋白类物质。
11、用权利要求
7的方法生产的蛋白类物质。
12、根据权利要求
1的方法，其中加热时间为2到5分钟。
13、根据权利要求
5的方法，其中含颗粒的抗原是乙肝表面抗原。
14、根据权利要求
5的方法，其中含颗粒的抗原浓度为0.5到10mg/ml。
15、根据权利要求
1的方法，其中物质的含颗粒的乙肝表面抗原含量至少为95%(重量比)。
16、根据权利要求
1的方法，其中物质的含颗粒的乙肝表面抗原含量至少为99%(重量比)。
17、根据权利要求
1的方法，其中所述热灭活是在压力为800到1000mm汞柱条件下进行的。
18、根据权利要求
1的方法，其中所述热灭活是在压力为900到1000mm汞柱条件下进行的。
专利摘要
本发明揭示一种制备含自然界未发现的乙肝表面抗原颗粒的蛋白类物质的方法，该颗粒在加热含该抗原蛋白的任何病毒也无法得到的。该方法包括将不用其它蛋白物质或稳定剂稀释的浓物质，以至少1毫克/毫升的浓度在101到105℃下加热1到15分钟，然后冷却之。
文档编号A61K39/29GK86102113SQ86102113
公开日1986年11月19日 申请日期1986年3月31日
发明者阿尔夫里德·梅尔·普伦斯, 克旺格·索·基姆 申请人:纽约血中心公司, 尤金泰克国际公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan