制备HMG-CoA还原酶抑制剂及其中间体的酶促羟基化方法

专利名称：制备HMG-CoA还原酶抑制剂及其中间体的酶促羟基化方法
技术领域：
本发明涉及制备用作HMG-CoA还原酶抑制剂和/或在制备HMG-CoA还原酶抑制剂中用作中间体的化合物的酶促羟基化方法。
本发明提供了制备式Ⅰ化合物、其部分或完全氢化的类似物或者它们的一种盐的方法， 其中R是烷基或芳基;
Z是开链部分
或内酯 R2是氢、烷基、铵、烷基铵或碱金属;
该方法包括如下步骤将式Ⅱ化合物、其部分或完全氢化的类似物或者它们的一种盐，与一种能够催化所说式Ⅱ化合物羟基化从而产生所说式Ⅰ化合物的微生物或者来源于所说微生物的酶或者具有来源于所说微生物的酶结构的酶接触，并实现所说的羟基化作用， 其中R、Z和R2的定义与通式Ⅰ中相同;
其中所说的微生物选自诺卡氏菌属、Amycolata、Saccharopolyspora、链霉菌属、Amycolatopsis、Saccharothrix、或吉尔霉属，条件是当式Ⅱ化合物是康帕克汀(Compactin)时，微生物不是Amycolata、诺卡氏菌属或链霉菌属。
本发明的酶促羟基化方法提供了获得式Ⅰ化合物的有效手段，所述式Ⅰ化合物本身具有HMG-CoA还原酶抑制活性，和/或在制备其它HMG-CoA还原酶抑制剂中所述式Ⅰ化合物可用作中间体。本发明方法可在温和的反应条件下进行，通过应用本发明羟基化方法，可减小或消除副产物。
本发明方法进一步描述如下本文中所用的术语“酶促过程”或“酶促方法”是指一种应用酶或微生物的过程和方法。
本文中所用的术语“烷基”，不管单独出现还是作为其它基团的一部分，是指在其正链上含有1至12个碳原子、优选1至6个碳原子的直链和支链的、任意被取代的烃类，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、上述基团的各种支链异构体等等。取代基的实例可包括一或多个选自下列的基团卤素(尤其是氯)、三卤甲基、烷氧基(例如其中的两个烷氧基取代基形成缩醛)、芳基如未取代的芳基(例如苯基)、烷基芳基或卤代芳基、环烷基如未取代的环烷基或烷基环烷基、羟基或被保护的羟基、羧基、烷氧羰基、烷氨基、二烷基氨基如二甲基氨基、烷酰氨基如乙酰氨基、氨基、芳酰氨基、硝基、氰基、巯基或烷硫基。优选的烷基取代基是羟基。
本文中所用的术语“链烯基”，不管单独出现还是作为其它基团的一部分，是指进一步含有至少一个碳碳双键的任意被取代的直链或支链的如上述对于烷基所述的烃基基团。
本文中所用的术语“环烷基”，不管单独出现还是作为其它基团的一部分，是指优选含有1至3个环并且每环含有3至12个碳原子(优选3至8个碳原子)的任意被取代的饱和碳环体系，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二烷基、金刚烷基。任意的取代基实例包括一或多个如上所述的烷基，或者一或多个作为烷基取代基的上述基团。
本文中所用的术语“芳基”是指在环部分含有6至12个碳原子的被取代或者未被取代的单环或双环芳族基团，例如苯基、联苯基、萘基、取代的苯基、取代的联苯基或取代的萘基。取代基(优选3个或更少)的实例包括一或多个下述基团烷基如未被取代的烷基、卤代烷基或环烷基烷基、卤素、烷氧基如未被取代的烷氧基或卤代烷氧基、羟基、芳基如苯基或卤代苯基、芳氧基如苯氧基、烷酰氧基或芳酰氧基、烯丙基、环烷基、烷氨基、二烷基氨基、酰氨基如烷酰氨基或芳酰氨基、氨基、硝基、氰基、链烯基、巯基、烷酰基或芳酰基、其中亚甲基可被低级烷基(即有1至6个碳原子的如上所述的烷基)取代的亚甲二氧基、芳基链烯基、和/或烷硫基。
本文中所用的术语“卤”或“卤素”是指氯、氟、溴或碘。
本文中所用的术语“盐”是指与无机和/或有机碱形成的酸性和/或碱性盐。优选的是无毒且药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例包括由阳离子如钠、钾、铝、钙、锂、镁、锌和四甲铵形成的那些盐以及由胺例如氨、乙二胺、N-甲基葡糖胺、丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N＇-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对氯苯基-2-吡咯烷-1＇-基-甲基苯并咪唑、二乙胺、哌嗪和三(羟甲基)-氨基甲烷形成的那些盐。
术语“药学上可接受的阳离子”是指形成药学上可接受的盐的阳性抗衡离子，例如上述的那些离子。
术语“ATCC”是指一个生物体保藏单位美国典型培养物保藏中心的代码，该微生物保藏机构位于美国的12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852。
按照本领域熟练技术人员公知的方法，可以获得本发明羟基化方法中所采用的式Ⅱ化合物。例如，在美国专利第4450171号中，公布了这些化合物。
具有下述式Ⅰa的式Ⅰ化合物、其部分或完全氢化的类似物或者它们的碱金属盐是优选的， 其中R是烷基，R2如式Ⅰ中所定义。
尤其是优选的实例是甲基普伐他汀(Methyl Pravastatin)、其部分或完全氢化的类似物或者它们的碱金属盐
就用作起始原料而言，具有下述式Ⅱa的式Ⅱ化合物、其部分或完全氢化的类似物或者它们的碱金属盐是优选的 其中R是烷基，R2如式Ⅱ中所定义。
尤其优选的实例是甲基康帕克汀(Methyl Compactin)、其部分或完全氢化的类似物或者它们的碱金属盐
甲基康帕克汀其中不存在一或多个双键的本文中所述的式Ⅰ化合物或者任何化合物，可以按照本领域熟练技术人员公知的方法，通过氢化其中存在所述双键的相应化合物而得到。
本发明方法的任何产物，可以通过公知的方法分离和纯化，例如通过过滤除去细胞或细胞物质(如果合适)、萃取法、结晶法、薄层色谱法、柱色谱法、高效液相色谱法等。
上述所示结构的甲基康帕克汀和甲基普伐他汀，在文中是指这些化合物的酸形式;若这些化合物的羧基以碱金属盐形式存在，则这些化合物是指其盐形式。
正如下文所讨论的，在进行本发明羟基化方法时，优选使用水相介质。因此，为制备或者用作起始原料，优选其中Z为如上所定义的开链部分的那些化合物，因为这些化合物相对于其中Z为内酯部分的相应化合物而言，具有更大的水溶性。其中Z是内酯部分的式Ⅱ化合物，在用于本发明方法中之前，例如可以先水解成开链形式。
本发明方法中所采用的酶或微生物，可以是任何能够催化进行本文所述转化反应的酶或微生物，而不论其来源或纯度。作为催化酶源的合适微生物菌属包括诺卡氏菌属、Amycolata、Saccharopolyspora、链霉菌属、Amycolatopsis、Saccharothrix或吉尔霉属。
适合用于本发明的菌种实例包括Amycolata autotrophica如ATCC 35204、加里福尼亚链霉菌如ATCC 15436、Amycolatopsis mediterranei如ATCC 21411、Saccharothrix australensis如ATCC 31497、桃吉尔霉如ATCC 38591、Saccharopolyspora hirsuta如ATCC 27875、27876或20501、Saccharopolyspora erythraea如ATCC 11635等。特别优选的是Amycolata autotrophica如ATCC 35204和Saccharopolyspora hirsuta如ATCC 20501。
关于使用的微生物，可以使用任何能够催化如本文所述转化反应的微生物细胞物质进行本发明的方法。所使用的细胞可以是完整的湿细胞或干细胞例如经冷冻干燥、喷雾干燥或热干燥的细胞。也可以以经处理的细胞物质例如破裂的细胞或细胞提取物的形式使用细胞。细胞或细胞物质，例如分离的真菌菌丝体，可以以游离状态应用，或者例如通过物理吸附或收集使之固定在支持物上而应用。当进行本发明方法时，可以采用一或多种微生物菌种。
可以继所采用的微生物生长之后进行本发明方法，例如，在存在或不存在式Ⅱ化合物起始原料时使微生物生长，收集并且优选的是洗涤(如用水洗)微生物物质，然后使获得的微生物物质与式Ⅱ化合物起始原料接触。本发明方法也可以通过就地发酵和反应而进行，即在存在正旺盛生长的微生物时反应。
反应可以在静态下进行，或者通过动态进行。当将式Ⅱ化合物起始原料加至正旺盛生长的培养物中时，所述动态优选是例如经瓶振摇培养物或通气和搅拌。在此情形下，可以采用消泡剂。
可由本领域熟练技术人员进行微生物的生长，例如使用含有营养素如碳和氮源及微量元素的合适的培养基。可同化的碳源实例包括葡萄糖、甘油、麦芽糖、糊精、淀粉、乳糖、蔗糖、糖蜜、大豆油、棉子油等。可同化的氮源实例包括大豆粉、花生粉、棉子粉、鱼粉、玉米浆、胨、稻麸、肉膏、酵母、酵母提取物、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等。可向培养物培养基中加入无机盐例如氯化钠、磷酸盐、碳酸钙等。还可加入少量金属盐或重金属。
微生物生长的不同阶段中可采用相同或不同的培养基。本文中实施例部分描述的培养基是微生物生长的优选培养基，本发明方法中所使用的任何微生物的生长均可采用这些培养基。
当被使用时，酶优选来自于上述微生物，或者可以经合成或其它方法制备酶。例如，酶可从经遗传工程操作的宿主细胞中获得。当经遗传工程操作的宿主细胞本身或者其经改性的细胞能够产生具有源于上述微生物菌属的酶结构的酶时，也可以考虑使用这些细胞。
本发明方法可在水相介质如缓冲的水相介质中进行。水相通常为水，优选去离子水或合适的水缓冲溶液，尤其是磷酸盐缓冲液。对于本发明羟基化方法，优选使用水相介质。
本发明中的反应也可在有机介质或在有机介质和水相介质混合物的介质中进行。有机或有机/水相介质的使用可增加水溶性小的式Ⅱ化合物起始原料(例如其中Z是内酯部分的式Ⅱ化合物)的溶解度。水溶性小的起始原料可以例如溶解在有机溶剂如甲醇或乙醇中，再将该溶液加到转化反应的水相介质中。形成该有机介质的液体在水中可以是不混溶的，或者优选在水中可以是混溶的。有机介质的实例包括甲苯、己烷、苯、丙酮、二甲亚砜、环己烷、二甲苯、三氯三氟乙烷、醇类如甲醇、乙醇或丁醇等等。
在加至反应介质之前，优选将起始原料溶解在例如水或醇中。
反应介质中，每毫升液体介质优选含有约0.5～3mg式Ⅱ化合物起始原料。反应介质的pH优选为约6.0～7.5之间。
为进行本发明羟基化反应，可以加入水或有机醇，例如链烷醇如甲醇或乙醇。基于式Ⅱ化合物起始原料计，上述物料的使用量优选为1摩尔过量，更优选更多摩尔过量。
当在本发明方法中被采用时，所加入的微生物细胞的量对于每mg式Ⅱ化合物起始原料而言，优选为约10～1000mg。当在本发明方法中被采用时，所加入的酶的量对于每mg式Ⅱ化合物起始原料而言，优选为约1～100mg。
反应介质优选保持在约27～40℃的温度，更优选保持于约28～34℃。反应时间依赖于微生物细胞所产生的酶的数量或者所用酶本身以及其比活性而变化。典型反应时间一般在约2.5～72小时之间。通过升高反应温度和/或向反应溶液中增加酶量，可以降低反应时间。
HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，EC1.1.1.34)是胆甾醇生物合成中的关键酶。该酶的抑制剂发现能用作抗胆甾醇药剂，即可用于降低或维持血浆胆甾醇水平。HMG-CoA还原剂抑制剂除了可治疗和预防血胆甾醇过多以外，还发现能用于治疗和预防动脉粥样硬化、血脂过多、和/或高脂血。
上述式Ⅱ化合物其本身可能具有HMG-CoA还原酶抑制活性(例如甲基康帕克汀)，以及/或者可以在制备其它具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物时用作中间体。在后一种情形下，本发明进一步提供了一种方法，其中羟基化作用按照本发明上述方法进行，并且随后将如此形成的羟基化产物用于制备一种HMG-CoA还原酶抑制剂(例如保护、加成基团或在其上改性)。优选地，相对于制备该抑制剂的羟基化产物可能具有的活性而言，如此制得的抑制剂具有增强了的HMG-CoA还原酶抑制活性。
按照本发明方法得到的HMG-CoA还原酶抑制剂，可以按照本领域熟练技术人员公知的方法，通过经选择的方式和以经选择的剂量，例如对哺乳动物尤其是人给药。
对于制备HMG-CoA还原酶抑制剂，本发明特别优选的方法包括下列步骤(A)用Amycolata autotrophica(ATCC 35204)或Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亚种(ATCC 20501)羟基化其中R为 并且R2为H的式Ⅱa化合物或其盐，得到具有下式结构的甲基普伐他汀或其碱金属(尤其是钠或锂)盐
下面的实施例说明本发明优选的实施方案，而不是为了限制本发明权利要求的范围或精神。实施例中所采用的培养基成分如下培养基 培养基组成成分F7 麦芽汁10g/L、酵母提取物10g/L、胨1g/L、葡萄糖20g/L、加蒸馏水至1升，在高压灭菌之前调pH至7.0。
K28 Pharmamedia 25g/L、西瑞糖69g/L、CaCO39g/L、K2HPO40.1g/L、加自来水至1升，在高压灭菌之前调pH至6.8～7.0。
F4 胰蛋白胨5g/L、麦芽汁3g/L、葡萄糖10g/L、酵母提取物3g/L、加蒸馏水至1升，高压蒸汽灭菌。
F46 甘油10g/L、麦芽糖40g/L、烤过的Nutrisoy面粉30g/L、胨10g/L、喷雾干燥的玉米浆10g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、加自来水至1升，在高压灭菌之前调pH至5.3。
M124 西瑞糖10g/L、NZ胺B 15g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、CaCO3、1g/L、加自来水至1升，在高压灭菌之前调pH至6.8～7.0。
Mueller-牛肉浸汁300g/L、酪蛋白水解物(technical)Minton液 17.5g/L、淀粉1.5g/L，悬浮于1升蒸馏水或去离子体培养基 水中并加热至沸腾至完全溶解，最终pH为7.4。
(Difco brand)胰蛋白酶 胰蛋白酶解酪蛋白胨17g/L、phytone胨3g/L、NaCl解酪蛋白 5g/L、K2HPO42.5g/L、葡萄糖2.5g/L，加蒸馏水至大豆液体 1升，高压蒸汽灭菌。
培养基，BBL brand(1)酵母氮源6.7g/L、葡萄糖50g/L、Sigma腺嘌呤HCl0.09/L、Sigmal-酪氨酸0.06g/L，热至沸腾并混合Difco酪蛋白水解物2g/L、琼脂20g/L，加蒸馏水至1升，高压蒸汽灭菌。
实施例1将一瓶冷冻的Amycolata autotrophica(ATCC 35204)和一瓶冷冻的Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亚种(ATCC 20501)解冻并用以接种至各个单独各含100ml培养基F4的500ml烧瓶内。将各烧瓶置于一摇床上以约280转/分的转速于25℃振摇72小时。取该72小时A.autotrophica培养液一部分，分成2.5ml等分试样，用于接种至六个含50ml培养基F7的250ml烧瓶内和六个含50ml培养基K28的250ml烧瓶内。相似地，一部分该72小时S.hirsuta培养液的2.5ml等分试样用于接种至六个含50ml培养基F7的250ml烧瓶内和六个含50ml培养基K28的250ml烧瓶内。因此，总计有24瓶。将全部的24瓶置于摇床上并以约280转/分的转速于25℃振摇。
振摇24小时后，取1ml经过滤除菌的5mg/ml甲基康帕克汀盐溶液，无菌条件下加至各培养物的三个F7烧瓶和三个K28烧瓶内。(由内酯制得该盐溶液，方法是将内酯溶解在最小体积的乙醇中，加入约15ml水[产生一些沉淀]，调pH至约11.8，在65℃水浴中保温，直至沉淀溶解，再小心地将pH降至7.5。加蒸馏水冲稀至计算的浓度为5mg/ml。此时增加两个新烧瓶，各培养基的未经接种的一个烧瓶内加有所述盐，作为无生物改性的对照。此后，这些烧瓶与经接种的烧瓶一样处理。
相似地，将500+μg/ml剂量的无菌康帕克汀加至各种培养物的三个F7和三个K28烧瓶内。增加两个新烧瓶，各培养基的未经接种的一个烧瓶内也加有康帕克汀。(接种了康帕克汀的烧瓶其目的是用作阳性对照，表现康帕克汀羟基化作用的正常发生。未经接种的烧瓶用作可能发生的底物无生物改变的对照)。
重新摇另外的24小时。然后向全部的烧瓶中第二次加入上述相同盐(这种盐在先前已加入过)。再重新振摇24小时，接着收集(在T1时刻)八个培养烧瓶，其中包括一个用于各种培养物-培养基-底物混合培养的培养瓶。分析从收集到的培养烧瓶中的培养液中的底物和羟基化了的产物。
在另外振荡24小时后，收集其余的20个培养烧瓶(在T2时刻)，其中包括10个甲基康帕克汀盐样品和10个康帕克汀样品。将这些培养液进行适当的底物-产物分析。
分析结果显示如下
实施例2将一冷冻小瓶的Saccharapolyspora hirsuta的kobensis亚种(ATCC 20501)解冻并将该菌种接种于含有100mlF4培养基的500ml烧瓶。将该烧瓶置于摇床中以约280rpm、25℃振荡培养72小时。
将72小时培养液样品用于接种至二个含有45ml K28培养基的250ml烧瓶。将这两个烧瓶置于摇床中，于约280rpm，25℃振荡培养。
在振荡24小时后，将甲基康帕克汀盐溶于水中并且制成经过滤灭菌的溶液。将该溶液一部分加到其中一个K28烧瓶中。六小时之后，将相同的一部分溶液加到同一烧瓶。还向第二个K28烧瓶中加入一部分这种溶液，同时也向第三个未接种K28烧瓶中加入同样一部分这种溶液。将所有这三个烧瓶都置于摇床中并且重新开始振荡18小时。
然后向第一个烧瓶中加入第三次剂量。六小时之后，第一个烧瓶中加入第四次(最后)剂量;向第二个烧瓶加入第二次(最后)剂量;并且向未接种的烧瓶中加入第二次(最后)剂量。
在继续振荡培养42小时后，收集这三个烧瓶，并对所有培养液进行甲基康帕克汀和甲基普伐他汀分析。结果显示如下
实施例3将各一冻冷管的Amycolata autotrophica(ATCC 35204)，加利福尼亚链霉菌(ATCC 15436)，Amycolata hydrocarbonoxydans(ATCC 15104)，Amycolata mediterranei(ATCC 21411)，Amycolatopsis fastidiosa(ATCC 31181)和Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亚种(ATCC 20501)解冻并用于接种至各含有100mlF7培养基的500ml种子发芽器烧瓶中。将所有的烧瓶置于摇床上，以约280rpm转速，25℃振荡72小时。
将来自每个发芽器烧瓶的各10ml样品用于接种各含有120mlK28培养基的相分开的烧瓶中。然后将所有的烧瓶再放回到摇床上。
24小时后，向每个烧瓶中加入500μg/ml的过滤灭菌的康帕克汀(酸形式)。再将烧瓶放回到摇床上。
24小时后，从每个烧瓶中取出各15ml样品，冷冻后用于后面的分析(T1)。向各个烧瓶中加入第二剂量500μg/ml的无菌酸形式的康帕克汀，将烧瓶放回摇床。
24小时之后，第二次从每个烧瓶中各取出15ml的测试样品，冷冻用于后面分析(T2);之后24小时，从各个烧瓶中各取出最后的15ml试样，冷冻用于后面的分析(T3)。
将所有样品解冻，以便用于分析。分析结果显示于如下表中

实施例4将经过46小时培养的Saccharopolyspora hirsata的kobensis亚种(ATCC 20501)(在28℃生长)和Amycolata autotrophica(ATCC 35204)(在25℃生长)用于接种含各种培养基的烧瓶(50ml培养基/250ml烧瓶)。每个烧瓶使用5ml的接种物。
将S.hirsuta接种到各含有下列培养基F7、F46、K28、M124、Mueller Hinton、胰酶解酪蛋白大豆液体培养基(TSB)和Y17的两套相分离的烧瓶。将每种培养基的一个烧瓶置于转速为约280rpm，25℃摇床中，再将每种培养基的另一个烧瓶置于转速为约280rpm，28℃摇床上。将F7和K28培养基的各另外一个烧瓶接种并置于32℃水浴摇床上。
将A.autotrophica接种到各含F7和K28培养基的两套相分离的烧瓶中。将每种培养基的各一套经接种的烧瓶置于转速约为280rpm，25℃的摇床上，并将每种培养基的各一个接种瓶置于转速约为280rpm，28℃的摇床上。
24小时后，向各个烧瓶中加入500μg/g剂量的过滤灭菌的康泊克汀(酸形式)。再将烧瓶放回到同样温度的摇床上。
24小时之后，从各个烧瓶中分别取出10ml样品，冷冻后用于以后的分析(T1)。向各个烧瓶中加入第二剂量500μg/g的无菌酸形式的康泊克汀，再将烧瓶放回同样温度的摇床上。
在另外48小时后，获取第二个10ml样品(T2)。将T1样品解冻，并与T2样品一起进行分析。结果显示于下面表中



实施例5将在F4培养基中生长67小时的各种微生物培养物用于接种各含50ml的F7培养基的250ml烧瓶以及各含50ml K28培养基的250ml烧瓶中。每个烧瓶用5ml接种物。所使用的生物体是Cellulomonas cellulans(ATCC 12830)、溶黄质厄氏菌(ATCC 27402)、Promicromonospora citrea(ATCC 15908)、绿色糖单胞(ATCC 15736)、Saccharopolyspora hirsuta(ATCC 27875)，Saccharothrix australensis(ATCC 31497)和赫斯泰德氏链霉菌(ATCC 13449)。将绿色糖单胞和S.hirsuta(ATCC 27875)的转化反应烧瓶置于转速为约280rpm，28℃的摇床上;其他的培养物置于转速约为280rpm、25℃的摇床上。在25℃和28℃都以Saccnaropolysporoa hirsuta的kobensis亚种(ATCC 20501)作为对照。
24小时后，向各个烧瓶中加入500μg/g剂量的康帕克汀。
24小时后，向每个烧瓶中加入第二剂量500μg/g的康帕克汀。
96小时之后，从每个烧瓶中取15ml样品，在-50℃冷冻用于后面的分析。
将样品解冻并用于分析。结果显示于下面的表中


实施例6八个ATCC毛霉菌目真菌和一个Staurophoma sp.ATCC 14288，取自于其生长良好的斜面，接种到含F4培养基的发芽器烧瓶(100ml F4/500ml烧瓶)，并置于25℃的慢速摇床(约200rpm)。八个毛霉菌目真菌是分枝犁头霉(ATCC 11613)、家蝇卷霉(ATCC 16008)、刺孢小克银汉霉的刺孢变种(ATCC 36190)、刺孢小克银汉霉的美丽变种(ATCC 8688A)、桃吉尔霉(ATCC 38591)，Rhizomucor miehei(ATCC 26912)、寡孢根霉(ATCC 22959)和葡枝根霉(ATCC 14037)。
在振荡培养72小时后，除刺孢小克银汉霉的刺孢变种(它是一种大的固体真菌群)外所有发芽器烧瓶中生长物外观良好。倒掉刺孢小克银汉霉刺孢变种，将七个留下的毛霉菌目烧瓶和一个Staurophoma烧瓶分别接种到含F7培养基和K28培养基(每个250ml烧瓶含50ml培养基)的生物转化反应烧瓶内。每个烧瓶使用2ml的接种物。将所有烧瓶置于25℃的均匀转速(约280rpm)摇床上。
24小时后，向所有烧瓶中加入500μg/ml剂量的康帕克汀，其中包括两个分别含有F7和K28培养基的未接种的烧瓶中。将所有烧瓶放回到280rpm转速，25℃摇床上。
再培养24小时后，向所有烧瓶中加入第二个500μg/ml剂量的康帕克汀，然后放回到摇床上。
58小时之后，从各个烧瓶中获取15-20ml样品并进行分析。结果如下桃吉尔霉F7-康帕克汀621μg/g;普伐他汀274μg/g;普伐他汀副产物比例为2.3∶1;和K28-康帕克汀822μg/g;普伐他汀54μg/g;普伐他汀副产物比例3.4∶1。
其他两个培养物至多显示良量的普伐他汀(梨头霉和寡孢根霉)。所有其他培养物显示普伐他汀阴性。
实施例7将在F4培养基(每个500ml烧瓶中加入100mlF4培养基，每个瓶都用冷冻小管接种)中培养2天、三天、4天的Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亚种(ATCC 20501)用于接种K28培养基的生物转化烧瓶(每个250ml烧瓶含50ml K28)。从每个发芽器烧瓶取5ml作为接种物接种K28培养基的三个烧瓶。另外，取三天龄的发芽瓶中的接种物，用不同体积的接种物一式三份接种到K28培养基中。具体地讲，使用0.25ml、1.0ml、2.5ml、7.5ml和10ml体积。将所有烧瓶置于转速约为280rpm，28℃的摇床上。
24小时后，向每个烧瓶中加500μg/ml剂量的康帕克汀钠盐。
培养另外24小时后，向每个烧瓶中加入1，000μg/ml剂量的康帕克汀钠盐。
58小时之后，收集25个烧瓶并用于分析。结果显示如下
＊一个具有672μg/g康帕克汀的烧瓶与显示痕量的两个烧瓶的平均结果。
＊＊两个烧瓶的平均值;可能污染的第三瓶忽略不计了。
权利要求
1.一种制备式Ⅰ化合物、其部分或完全氢化的类似物或它们的一种盐的方法， 其中R是烷基或芳基；Z是开链部分 并且R2是氢、烷基、铵、烷基铵或碱金属；该方法包括下列步骤将式Ⅱ化合物、其部分或完全氢化的类似物或它们的一种盐，与一种能催化所述式Ⅱ的化合物或其盐羟基化以产生所述式Ⅰ化合物或其盐的微生物或者来源于所述微生物的酶或具有来源于所述微生物的酶结构的酶相接触，并且实现所述的羟基化作用； 其中R、Z和R2的定义相同于式Ⅰ，其中所述微生物选自于诺卡氏菌属、Amycolata、Saccharopolyspora、链霉菌属、Amycolatopsis、Saccharothrix或吉尔霉属，条件是如果式Ⅱ化合物是康帕克汀，则微生物不是Amycolata、诺卡氏菌属或链霉菌属。
2.权利要求1所述的方法，其中Z是所述开链部分。
3.权利要求2所述的方法，其中R是烷基。
4.权利要求1所述的方法，其中制备具有下列通式的化合物 或其部分或完全氢化的类似物，或它们的一种碱金属盐。
5.权利要求1所述的方法，其中将式Ⅱ的化合物与一种微生物接触。
6.权利要求5所述的方法，其中所述微生物是Amycolata autotrophica ATCC 35204，加里福尼亚链霉菌ATCC 15436，Amycolatopsis mediterranei ATCC 21411，Saccharothrix australensis ATCC 31497，桃吉尔霉ATCC 38591，Saccharopolyspora hirsuta ATCC 27875、27875、20501或Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635。
7.权利要求6所述的方法，其中所述微生物是Amycolata autotrophica ATCC 35204或Saccharopolyspora hirsuta ATCC 20501。
8.权利要求1所述的方法，其中在将式Ⅱ化合物与一种微生物或与一种酶接触前，先将该化合物溶于水或醇中。
9.权利要求1所述的方法，其中将式Ⅱ化合物与微生物或酶接触的步骤是在水相介质中进行。
10.权利要求9所述的方法，其中在每ml的水相介质中含有约0.5-约3mg的式Ⅱ化合物。
11.权利要求9所述的方法，其中水相介质的pH为约6.0至约7.5之间。
12.权利要求9所述的方法，其中水相介质温度在约27℃至40℃之间。
13.权利要求12所述的方法，其中该水相介质温度为约28℃至34℃之间。
14.权利要求1所述的方法，其中将式Ⅱ化合物与一种微生物或与一种酶相接触的步骤连续进行约2.5至约72小时之间。
15.权利要求1所述的方法，其中Z是所述内酯。
16.权利要求15所述的方法，其中式Ⅱ化合物在与一种微生物或与一种酶接触之前先水解。
17.权利要求1所述的方法，其中所述式Ⅰ化合物用于制备HMG-CoA还原酶抑制剂。
18.制备HMG-CoA还原酶抑制剂的方法，包括根据权利要求1所述的方法将式Ⅱ化合物或其盐羟基化以产生式Ⅰ化合物或其盐。
19.降低或维持血浆胆甾醇水平的方法，包括给哺乳动物患者施用对于降低或维持血浆胆甾醇水平有效量的、按权利要求1所述方法制备的化合物。
20.治疗动脉粥样硬化的方法，包括给哺乳动物患者施用对于治疗动脉粥样硬化有效量的按权利要求1所述方法制备的化合物。
全文摘要
用作为HMG-CoA还原酶抑制剂和/或作为在制备HMG-CoA还原酶抑制剂中的中间体的化合物的酶促羟基化制备方法，使用一种微生物或来源于所述微生物的一种酶或具有来源于所述微生物的酶结构的酶，所述微生物能够催化所述羟基化过程。
文档编号A61P3/06GK1106067SQ9411716
公开日1995年8月2日 申请日期1994年10月22日 优先权日1993年10月22日
发明者B·L·戴维斯, P·M·切诺, L·施扎卡 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司