人破骨细胞衍生的组织蛋白酶的制作方法

专利名称：人破骨细胞衍生的组织蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴别的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途，以及这些多核苷酸和多肽的生产。更具体地，本发明的多肽为人破骨细胞衍生的组织蛋白酶(组织蛋白酶O)。本发明还涉及抑制这种多肽的作用的方法以及鉴定这种多肽的抑制剂的检测方法。
骨骼再吸收作用涉及同时清除胞外基质的无机和有机组分，这一过程主要发生于由破骨细胞的波动边缘覆盖的酸性吞噬体样胞外区域内，见Barron，et al.，J.Cell Biol.，1012210-22，(1985)。破骨细胞是多核巨细胞，其在骨骼再吸收作用中起关键作用。吸附于骨表面的破骨细胞在破骨细胞与骨基质之间形成一酸性微环境，在这一微环境中溶有骨的无机和有机成分。据认为有机成分，主要是I型胶原，是通过蛋白酶消化而溶解，有证据表明半胱氨酸蛋白酶可能在骨的有机成分的降解中起主要作用。在半胱氨酸蛋白酶中，组织蛋白酶B、L、N和S在酸性条件下可降解I型胶原，见Etherington，D.J.Biochem.J.，127，685-692(1972)。组织蛋白酶L在水解偶氮酪蛋白、弹性蛋白和胶原的活性方面是最有活性的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。
组织蛋白酶是在结缔组织的正常生理性和病理性降解中起作用的蛋白酶，组织蛋白酶在胞内蛋白降解和转化、骨骼重建和激素原活化中起主要作用，见Marx，J.L.，Science，235285-286(1987)。组织蛋白酶B、H、L和S是普遍表达的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，属于胃蛋白酶超级家族，其以恒定的水平发现于许多人类组织如肾、肝、肺和脾。组织蛋白酶的一些病理作用包括参与血管球性肾炎、关节炎和癌症转移，见Sloa，B.F.，andHonn，K.V.，Cancer Metastasis Rev.，3249-263(1984)。在肿瘤细胞中可见组织蛋白酶L和BmRNA和蛋白质的水平有很大的升高。用肿瘤促进因子和生长因子处理的成纤维细胞中也可诱导组织蛋白酶LmRNA，见Kane，S.E.and Gottesman，M.M.Cancer Biology，1127-136(1990)。
对骨吸收的体外研究表明组织蛋白酶L和B可能参与了这一组织的重建，在酸性条件下，这些溶酶体半胱氨酸蛋白酶消化胞外基质蛋白如弹性蛋白、层粘连蛋白和I型胶原，破骨细胞需要这一活性以在由破骨细胞完成的骨再生之前降解有机基质。一些天然和合成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以有效地抑制这一基质的降解。
对分离组织蛋白酶及其在骨吸收中的作用已进行了深入的研究，最近从来自兔骨骼中的纯化破骨细胞中分离了OC-2，发现OC-2编码与组织蛋白酶L和S在结构上相关的可能的半胱氨酸蛋白酶，见Tezuka，K.，et al.，J.Biol.Chem.，2691106-1109(1994)。
已研究了半胱氨酸蛋白酶和胶原蛋白酶的一种抑制剂，Z-Phe-Ala-CHN2，的影响分离的破骨细胞的再吸收活性的作用，并发现其在牙质中抑制再吸收pit，见Delaisse，J.M.et al.，Bone，8305-313(1987)。另外，还检测了人重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂在体外对骨吸收的影响，并发现可显著抑制由甲状旁腺素激发的骨吸收，见Lerner，U.H.and Grubb Anders，Journal of Boneand Mineral Research，7433-439(1989)。另外，已重组生产了编码人半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶L的cDNA克隆并在T7表达系统中在E.coli中高水平表达。重组人组织蛋白酶原L已成功地以高水平表达并以组织蛋白酶原L和活性加工的组织蛋白酶L的形式纯化。该肽原在组织蛋白酶L的折叠和/或加工中的可能的功能的资料以及需要该酶的轻链以具有蛋白酶活性的资料是通过表达和纯化在这些区域中带有结构改变的突变体酶而获得的，见Smith，S.M.and Gottesman，M.M.，J.Bio Chem.，26420487-20495，(1989)。还有报道在酿酒酵母中表达了有功能的人组织蛋白酶S并鉴定了该重组酶，见Bromme，D.et al.，J.BioChem.，2684832-4838(1993)。
根据本发明的一个方面，提供了新的成熟多肽，其是破骨细胞衍生的组织蛋白酶，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。本发明的人破骨细胞衍生的组织蛋白酶是人源的。
根据本发明的另一个方面，提供了编码这些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根据本发明的又一方面，提供了一种通过重组技术生产这些多肽的方法。
根据本发明的再一方面，提供了抗抑制这种多肽的作用的的抗体。
根据本发明的又一方面，提供了这种多肽的拮抗剂，例如可用于抑制这种多肽的作用的小分子抑制剂，例如用于治疗肿瘤转移和骨质疏松症。
根据本发明的另一方面，提供了开发用于鉴别本发明的多肽的抑制剂的检测体系的程序。
本发明的这些及其它方面根据本文的教导对本领域熟练技术人员将是显而易见的。
下述附图旨在说明本发明的实施方案，并非限制本发明的范围。


图1示出组织蛋白酶O的多核苷酸序列和相应的推导氨基酸序列，所示的组织蛋白酶O是该蛋白的预期的前体形式，其中开始的约15个氨基酸代表前导序列，前115个氨基酸为序列原。使用标准的三字母缩写表示氨基酸序列。
图2示出组织蛋白酶O与其它人组织蛋白酶和兔OC-2的氨基酸同源性。
根据本发明的一个方面，提供了分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图1的推导的氨基酸序列的成熟多肽，或者编码由1994年2月9日保藏的ATCC保藏为75671的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
编码本发明的多肽的多核苷酸可以得自衍生于人破骨细胞瘤细胞、胎盘、肾或肺的cDNA文库，本文所述的多核苷酸从衍生自人破骨细胞瘤细胞的cDNA文库中分离。该cDNA插入片段长1619bp，并含有一编码长度为329个氨基酸的蛋白质的开放读框，所述的蛋白质的开始的约15个氨基酸代表前导序列，前115个氨基酸为序列原，因此当开始的115个氨基酸序列原(其包括约15个氨基酸的前导序列)被切除后，本发明的多肽的成熟形式由214个氨基酸组成。由该多核苷酸编码的多肽在结构上与人组织蛋白酶S相关，在整个编码区有56％相同的氨基酸及71％的相似性。其还与兔OC-2组织蛋白酶结构上相关，在整个编码区有94％相同的氨基酸及97％的相似性。该多肽可在破骨细胞的溶酶体中或靠近破骨细胞的胞外发现。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1所示的编码序列相同，或与保藏克隆的编码序列相同，或者也可以是不同的编码序列，该编码序列由于遗传密码的丰余性或简并性，与图1的DNA或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和另外的编码序列如前导序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)和非编码序列如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即仅包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码具有图1的推导的氨基酸序列的多肽或编码由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸的变异体可以是天然发生的该多核苷酸的等位基因变异体，或是该多核苷酸的非天然发生的变异体。本发明还涉及从图1的多核苷酸序列或用PCR方法扩增的图1的序列的片段构建的多核苷酸探针，其可用于筛选破骨细胞cDNA文库以推导本发明的多肽。
因此，本发明包括编码图1所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，所述变异体编码图1的多肽或由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、置换变异体和增加或插入变异体。
如上所述，多核苷酸可以具有为图1所示的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列，或保藏克隆的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列。如本领域所公知的，等位基因变异体是多核苷酸的另一种形式，其可以置换、缺失或增加一个或多个核苷酸，但基本上不改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在同一读框内与有助于多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸融合，例如前导序列，其是用于控制多肽从细胞转运的分泌序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白(preprotein)，前导序列可以由宿主细胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸还可编码一种蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸残基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白为蛋白原并是蛋白质的非活性形式，一旦序列原被切掉，则保留一活性成熟蛋白。
因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码一成熟蛋白，或编码一具有序列原的蛋白或一具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸还可以具有在读框内与标记序列融合的编码序列，其可用于纯化本发明的多肽。标记序列可以是，例如，由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物用于在细菌宿主中纯化与该标记物融合的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素标记物(HA)。HA标记物相应于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本发明还涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间具有至少50％、优选70％的同一性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用的，术语“严格条件”是指杂交仅发生在序列间具有至少95％、优选97％同一性的情况下。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保持了由图1的cDNA或保藏的cDNA编码的成熟多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物将根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定期限保藏。这些保藏仅为本领域技术人员提供方便，而不是对根据35 U.S.C 112索取保藏物的许可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及该序列编码的多肽的氨基酸序列引入本文作参考，并且在与本文的序列描述有抵触时，其是参照。制造、使用或销售保藏物需经许可，而本文不授予这种许可。
本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的组织蛋白酶O多肽，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。
当指图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这些多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括。蛋白原，其可通过裂解蛋白原部分而激活以生产有活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的一或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选由保守的氨基酸残基取代)，并且这种取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码，也可不是由遗传密码编码，或者(ii)其中的一或多个氨基酸残基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物例如为增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸与成熟多肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。这种片段、衍生物和类似物被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并优选纯化至均一性。
术语“分离的”是指从其原始环境(例如，若其是天然存在的则是天然环境)中脱离的物质。例如，存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从一些或所有共存物质中分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是某种组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞，以及用重组技术生产本发明的多肽。
宿主细胞用本发明的载体遗传工程化(转导或转化或转染)，所述的载体可以是克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。遗传工程化的宿主细胞可以在改良的传统营养培养基中培养，改良培养基是为了激活启动子，选择转化子或扩增组织蛋白酶O基因。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用来表达的宿主细胞的条件，其对本领域普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可通过重组技术用于生产多肽，因此，例如，该多核苷酸可以包括在任一种表达载体中特别是载体或质粒中以表达多肽。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA的结合体的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和拟狂犬病毒。然而，也可使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制和生存。
如上所述，可通过多种程序将合适的DNA序列插入载体，通常，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这些和其它程序属于本领域熟练技术人员的范畴。
可通过各种程序将合适的DNA序列插入载体，一般地，该DNA序列通过本领域已知的程序插入合适的限制性内切酶位点。这些程序和其它程序被视为属于本领域熟练技术人员的范畴。
表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA合成，作为这些启动子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40启动子，E.coli lac或trp启动子，λ噬菌体PL启动子和其它公知用于控制基因在原核细胞或真核细胞或者病毒中表达的启动子。表达载体还含有一用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的合适的序列。
另外，表达载体优选含有一个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的基因，如对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如为四环素或氨苄青霉素抗性。
可采用含有如上所述合适DNA序列以及合适启动子或调控序列的载体转化合适的宿主以使宿主表达蛋白质。作为合适的宿主的例子，可以提及的有细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。选择合适的宿主细胞被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
更具体地，本发明还包括重组构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入本发明的序列。在这一实施方案的一个优选方面，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，它们是可商购的。以下举出载体的例子，细菌的载体pQE70，PQE60，PQE-9(Qiagen)，Pbs，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体pWLneo，pSV2cat，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它质粒或载体，只要其可在宿主中复制和生存即可。
启动子区可以选自使用CAT(氯霉素转移酶)的载体或其它带有选择性标记的载体的任何所需基因，两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp；真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子属于本领域普通技术人员的水平范畴。
在另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞，所述的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))将构建体导人宿主细胞。
可以用传统的方式使用宿主细胞中的构建体以生产由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在合适的启动子的控制下，可以在哺乳细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质，也可采用无细胞翻译系统使用由本发明的DNA构建体衍生的RNA生产这种蛋白质。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体见Sambrook，et al，Molecular ClonningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，该书引人本文作参考。
高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一增强子序列而得以增加，增强子是约10-300bp的顺式作用的DNA因子，其作用于启动子以增加其转录。其例子包括位于复制起点晚期侧(100-270bp处)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。这种启动子可以衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。在合适的阶段，杂合结构序列装配上翻译起始和终止序列，以及优选地，装配一能指导翻译的蛋白质进入周质空间或胞外培养基的前导序列。任选地，杂合序列可以编码一包括N-末端鉴别肽的融合蛋白质，以赋予所需的特征，如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。
用于细菌的表达载体的构建是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入带有功能启动子的可操纵阅读相而完成。载体包括一或多种表型选择标记及一个复制起点以确证载体保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中扩增。合适的用于转化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，当然，也可采用其它菌。
作为代表性而非限制性的例子，有用的细菌表达载体可以包括衍生于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的选择标记和细菌复制起点，这些商购质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子及待表达的结构序列结合。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，用合适的方法(如温度改变或化学诱导)诱导选定的启动子，并继续培养细胞一段时间。
典型地，细胞由离心收集，用物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可用任何常规方法破碎，如冻-融循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂，这些方法是本领域熟练技术人员熟知的。
也可使用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白，哺乳细胞表达系统包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’旁侧非转录序列。可使用源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接体和多腺苷酸化位点以提供所需的非转录遗传因子。
可通过硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收并纯化组织蛋白酶O。优选的是在纯化过程中存在低浓度(约0.1-5mM)的钙离子(Price，etal.，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，可使用蛋白质重折叠步骤以完成成熟蛋白的构型，最后，可采用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是从高表达细胞系表达的天然纯化的产物，或是化学合成过程的产物，或者通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳类细胞)而生产。根据在重组生产过程中采用的宿主，本发明的多肽可以用哺乳类或其它真核类的碳水化合物糖基化或是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括一起始的甲硫氨酸残基。
本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。
简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列定位在染色体上。使用cDNA的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增产物。
体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体-特异cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至500或600个碱基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于与独特的染色体位置结合以具有足够的信号强度便于检测。FISH需要使用衍生EST的克隆，越长越好。例如，2000bp是好的，更好为4000bp，而超过4000则可能不是获得好结果所必须的，因其时间百分比不合理。此技术的综述见Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan中发现(可在线从Johns Hopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。
接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。
应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。
感染个体和未感染个体的比较通常是首先寻找染色体的结构改变，如可从染色体涂片上观察到的或者用基于该cDNA序列的PCR检测到的缺失或易位。最后，需要对来自一些个体的基因进行全测序以证实存在突变并从多态性中区分突变。
本发明还涉及用反义技术体内抑制组织蛋白酶O，反义技术通过三螺旋形成或反义DNA或RNA可用于控制基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，用编码本发明的多肽的多核苷酸序列的5’编码区设计长度为10-40bp的反义RNA寡核苷酸。设计一DNA寡核苷酸以互补于转录涉及的基因的某区域(三螺旋-见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；and Dervanet al，Science，2511360(1991))，从而防止组织蛋白酶O的转录和生产。反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并阻断mRNA分子翻译成组织蛋白酶O(反义-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。
或者，上述寡核苷酸可以通过本领域公知的程序输送到细胞，从而反义RNA或DNA可以体内表达以通过上述方式抑制组织蛋白酶O的生产。
因此，组织蛋白酶O的反义构建体抑制组织蛋白酶O的作用，并可以用于治疗某些疾病，如骨质疏松，因为骨吸收已被减慢或阻断。这些反义构建体还可用于治疗肿瘤转移，因为在一些肿瘤细胞中发现组织蛋白酶的水平有升高，在ras转化的成纤维细胞中组织蛋白酶L的mRNA和蛋白质增加。另外，有证据表明转移性B16黑素瘤与非转移性肿瘤相比均增量调节组织蛋白酶B。
多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达其的细胞可用作免疫原生产抗体，这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物。可使用现有技术中公知的各种程序生产这些抗体和片段。
抗对应于本发明的序列的多肽或其体内受体的抗体可以通过将多肽直接注射给动物或将多肽给予动物、优选非人而获得，如此获得的抗体随后与多肽本身结合。以这种方式，仅编码多肽的一个片段的序列也可用于生产与完整天然多肽结合的抗体，这种抗体随后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。为制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生产的抗体的技术，例如杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(kozbor et al.，1983，Immunology Today 4∶72)，以及生产人单克隆多肽的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生产单链抗体的技术(USP4.946，778)可以用来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
通过与多肽的结合，特异于组织蛋白酶O的抗体可进一步用于抑制多肽的生物学作用，以这种方式，抗体可用于治疗例如癌症，因为在ras转化的成纤维细胞中以及加入了佛波酯和生长因子后组织蛋白酶L的mRNA和蛋白质增加。另外还可用这些抗体治疗骨质疏松，因为由组织蛋白酶O造成的骨吸收被抑制。
另外，这种抗体可检测组织蛋白酶O的存在与否以及组织蛋白酶O的浓度水平，因此，其可用作诊断标记以诊断如高转化骨质疏松、Paget′s症、肿瘤骨裂解或其它代谢性骨疾病。这种抗体还可用作肿瘤转移的诊断标记。
本发明还涉及本发明的多肽的拮抗剂和抑制剂，该拮抗剂和抑制剂抑制或消除该多肽的功能。
因此，例如，拮抗剂可与本发明的多肽结合并抑制或消除其功能，拮抗剂例如可以是抗本发明的多肽的抗体，其通过与组织蛋白酶O结合而消除组织蛋白酶O的活性，或在某些情况下拮抗剂可以是寡核苷酸。抑制剂的一个例子是与多肽结合并占据多肽的催化位点的小分子抑制剂从而使催化位点不能与底物接触，进而防止组织蛋白酶O的生物学活性，这些小分子抑制剂的例子包括但不限于小肽或类肽分子。
以这些方式，拮抗剂和抑制剂通过阻止组织蛋白酶O的破坏骨骼的作用而可用于治疗骨疾病如骨质疏松。拮抗剂和抑制剂还可用于治疗转移性肿瘤，因为组织蛋白酶在增加转移性肿瘤的生长方面起作用。
拮抗剂和抑制剂可以与药物学可接受载体形成组合物应用，这种载体包括但不限于盐水、缓冲的盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其结合物。优选系统性给予组织蛋白酶抑制剂。在大鼠腹膜内注射半胱氨酸蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽(0.36mg/kg体重)和E-64(0.18mg/kg体重)能降低血清钙离子和羟脯氨酸的尿排出，见Delaisse et al.，BBRC，125441-447(1984)。也可直接在易于骨质疏松的骨骼区域如股骨的近颈施用。
本发明还涉及用于鉴定上述特异于组织蛋白酶O并阻断其功能的小分子抑制剂的检测法。可使用天然蛋白底物或合成肽检测组织蛋白酶O的蛋白裂解活性，抑制剂的阻止这一活性的能力可作为筛选鉴定具有治疗过量骨吸收疾病活性的化合物的基础，见Maciewicz，R.A.and Etheringtin，D.J.，Biochem.J.256433-440(1988)。
这种用于鉴定组织蛋白酶O的抑制剂的检测法的一个例子是使用与显色标记偶联的肽基底物，这种肽底物的一个示意性例子具有通式X-(Y)n-Z，其中X代表合适的氨基保护基团如乙酰基、乙酸酯或酰胺；Y是任何天然或非天然发生的氨基酸，其结合形成组织蛋白酶O识别的底物并在抑制剂不存在的条件下裂解；n代表任意整数，但通常至少为20；Z代表任何显色或荧光显色标记如对硝基anelide或n-甲基香豆素，其在由组织蛋白酶O裂解Y基团时可被监测生色。如果一可能的抑制剂不能抑制组织蛋白酶O，底物(Y基团)被裂解，则Z在构型上有一相应改变，这一改变使得当使用荧光显色标记时荧光计可检测到荧光，当使用现色标记时分光光度计可检测到颜色。当抑制剂成功地抑制组织蛋白酶O使之不能裂解底物时，Y基团未被裂解，Z不发生构型改变，从而检测不到荧光或颜色，表明抑制剂已抑制了组织蛋白酶O的作用。
以下将参照实施例进一步描述本发明，但是应理解的是，本发明不受这些实施例的限制。除非另有说明，所有的份或量均为重量份或重量。
为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。
“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μg DNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。
裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。
“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，etal.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。
除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法进行转化。实施例1 破骨细胞衍生的组织蛋白酶的表达和纯化首先使用对应于编码组织蛋白酶O的DNA序列(ATCC#75671)的5’和3’末端的PCR寡核苷酸引物对该DNA序列进行扩增以合成插入片段。5’寡核苷酸引物的序列为5’-GCTAAGGATCCTGGGGGCTCAAGGTT-3’，其含有一BamHI限制性酶位点，后接15个起始于甲硫氨酸起始密码子后的组织蛋白酶O编码序列的核苷酸；3’引物序列为5’-GCTAATCTAGATCACATCTTGGGGAA-3’，其含有互补于XbaI位点的序列以及组织蛋白酶O编码序列的最后12个核苷酸。该限制性酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调控启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记(6-His)和限制性酶克隆位点。用BamHI和XbaI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到载体上并保持起始于细菌RBS的读框。然后用连接混合物转化E.coli菌株ml 5/rep4(得自Qiagen，商标ml 5/rep4)，该菌株含有多拷贝的表达lacI阻抑物并赋予卡那霉素抗性(Kan)的质粒pREP4。在LB平板上培养转化子并筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的液体LB培养基中将含有所需构建物的克隆培养过夜(O/N)，O/N培养物以1∶100-1∶250的比例接种到大体积培养基中，培养细胞至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。随后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1mM，通过使lacI阻抑物失活，IPTG诱导激活P/O，使基因表达水平提高。再培养细胞3-4小时，随后离心收集细胞，将细胞溶解在离液剂6M盐酸胍和50mM NaPO4pH8.0中，在使得与含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，通过镍-螯合柱层析(Hochuli，E.etal.，Genetic Engineering，Principles & Methods，1287-98(1990))从溶液中纯化溶解的组织蛋白酶O。在6M盐酸胍，150mM NaPO4pH5.0中从柱中洗脱组织蛋白酶O(95％纯)。实施例2 组织蛋白酶O在人组织中的表达模式使用由组织蛋白酶O的部分cDNA克隆产生的[35S]-标记的有义或反义核糖探针作为Northern印迹分析的一部分以探查破骨细胞瘤组织(其代表单一mRNA种类)和脾组织的冷冻切片，见Current Protocols in Molecular Biology，vol.2，Ausubel et al.，editors，section 14.3。从破骨细胞瘤组织和脾中分离总RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上电泳该RNA并转移到硝基纤维素上。预杂交后，在42℃将印迹与有义或反义[32P]标记的核糖探针以2×106cpm/ml杂交过夜。严格清洗后(0.2×SSC，65℃)，印迹在X-光胶片上曝光。当用于与破骨细胞瘤组织切片原位杂交时，在破骨细胞中观察到特异的高水平表达；在单核细胞中观察到一些表达，但基质细胞和成骨细胞未表达可检测到的组织蛋白酶O的mRNA。当使用脾组织切片进行原位杂交时，未观察到组织蛋白酶O的表达。这些资料表明组织蛋白酶O的mRNA在破骨细胞中以高水平表达，并似乎选择性地在这些细胞中表达。实施例3 用抗体对组织蛋白酶O进行分析制备抗从组织蛋白酶O序列的足以与组织蛋白酶家族其它成员不同的区域合成的肽的抗体，以在Western印迹中对组织蛋白酶O进行特异分析。将抗体亲和纯化并用于探测破骨细胞瘤组织的Western印迹。合成肽(AIDASLTSFQFYSK和YDESCNSDNLN)是根据组织蛋白酶O的预期序列(对应于图1的248-261和265-275位氨基酸)制备的，选择该区域是因为其与组织蛋白酶家族的其它成员具有最低的同一性。该肽用戊二醛与匙孔嘁血蓝蛋白偶联，与佐剂混合并注射到兔中。用固定化肽对免疫血清进行亲和纯化，见Drake et al.，Biochemistry，288154-8160(1989)。
组织样品在SDS-PAGE样品缓冲液中均质并在14％SDS-PAGE上电泳，将蛋白质转移到硝基纤维素上，随后用牛血清白蛋白封闭。用亲和纯化的抗肽抗体进行免疫印迹，然后用碱性磷酸酶偶联的第二抗体并用显色底物观察。根据预染色的分子量标准(Rainbow markers，Amersham)的迁移率确定分子量。抗两种不同肽的抗体识别一约29kDa的主带和约27kDa的次要带。免疫反应性可由用来生产抗体的肽竞争证实信号的特异性。这表明组织蛋白酶O的mRNA确实在组织中表达，并产生大小与完全加工的组织蛋白酶O一致的蛋白质(假定加工类似于相关的组织蛋白酶)。
根据以上的教导，对本发明作出各种改进和变动是可能的，因此，在所附权利要求书的范围内，本发明可以不同于所述的方式实施。
序列表(1)一般信息(i)申请人HASTINGS，ET AL。(ii)发明名称组织蛋白酶O(iii)序列数2(iv)联系地址(A)联系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELANE(D)州新泽西州(E)国家美国(F)邮编07068(v)计算机可读形式(A)媒介类型35寸软盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)本申请资料(A)申请号08/208,007(B)申请日1994年3月8日(C)分类(v)在先申请资料(A)申请号(B)申请日(vi)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注册号36，134(C)案号/文档号325800-95(viii)通讯信息(A)电话201-994-1700(B)传真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1619碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TCAGATTTCC ATCAGCAGGA TGTGGGGGCT CAAGGTTCTG CTGCTACCTG TGGTGAGCTT 60TGCTCTGTAC CCTGAGGAGA TACTGGACAC CCACTGGGAG CTATGGAAGA AGACCCACAG120GAAGCAATAT AACAACAAGG TGGATGAAAT CTCTCGGCGT TTAATTTGGG AAAAAAACCT180GAAGTATATT TCCATCCATA ACCTTGAGGC TTCTCTTGGT GTCCATACAT ATGAACTGGC240TATGAACCAC CTGGGGGACA TGACCAGTGA AGAGGTGGTT CAGAAGATGA CTGGACTCAA300AGTACCCCTG TCTCATTCCC GCAGTAATGA CACCCTTTAT ATCCCAGAAT GGGAAGGTAG360AGCCCCAGAC TCTGTCGACT ATCGAAAGAA AGGATATGTT ACTCCTGTCA AAAATCAGGG420TCAGTGTGGT TCCTGTTGGG CTTTTAGCTC TGTGGGTGCC CTGGAGGGCC AACTCAAGAA480GAAAACTGGC AAACTCTTAA ATCTGAGTCC CCAGAACCTA GTGGATTGTG TGTCTGAGAA540TGATGGCTGT GGAGGGGGCT ACATGACCAA TGCCTTCCAA TATGTGCAGA AGAACCGGGG600TATTGACTCT GAAGATGCCT ACCCATATGT GGGACAGGAA GAGAGTTGTA TGTACAACCC660AACAGGCAAG GCAGCTAAAT GCAGAGGGTA CAGAGAGATC CCCGAGGGGA ATGAGAAAGC720CCTGAAGAGG GCAGTGGCCC GAGTGGGACC TGTCTCTGTG GCCATTGATG CAAGCCTGAC780CTCCTTCCAG TTTTACAGCA AAGGTGTGTA TTATGATGAA AGCTGCAATA GCGATAATCT840GAACCATGCG GTTTTGGCAG TGGGATATGG AATCCAGAAG GGAAACAAGC ACTGGATAAT900TAAAAACAGC TGGGGAGAAA ACTGGGGAAA CAAAGGATAT ATCCTCATGG CTCGAAATAA960GAACAACGCC TGTGGCATTG CCAACCTGGC CAGCTTCCCC AAGATGTGAC TCCAGCCAGC 1020CAAATCCATC CTGCTCTTCC ATTTCTTCCA CGATGGTGCA GTGTAACGAT GCACTTTGGA 1080AGGGAGTTGG TGTGCTATTT TTGAAGCAGA TGTGGTGATA CTGAGATTGT CTGTTCAGTT 1140TCCCCATTTG TTTGTGCTTC AAATGATCCT TCCTACTTTG CTTCTCTCCA CCCATGACCT 1200TTTTCACTGT GGCCATCAGG ACTTTCCCCT GACAGCTGTG TACTCTTAGG CTAAGAGATG 1260TGACTACAGC CTGCCCCTGA CTGTGTTGTC CCAGGGCTGA TGCTGTACAG GTACAGGCTG 1320GAGATTTTCA CATAGGTTAG ATTCTCATTC ACGGGACTAG TTAGCTTTAA GCACCCTAGA 1380GGACTAGGGT AATCTGACTT CTCACTTCCT AAGTTCCCTT CTATATCCTC AAGGTAGAAA 1440TGTCTATGTT TTCTACTCCA ATTCATAAAT CTATTCATAA GTCTTTGGTA CAAGTTTACA 1500TGATAAAAAG AAATGTGATT TGTCTTCCCT TCTTTGCACT TTTGAAATAA AGTATTTATC 1560TCCTGTCTAC AGTTTAATAA ATAGCATCTA GTACACATTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAA1619(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度329个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala-115-110-105Leu Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr His Trp Glu Leu Trp Lys-100-95 -90Lys Thr His Arg Lys Gln Tyr Asn Asn Lys Val Asp Glu Ile Ser-85 -80 -75Arg Arg Leu Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser Ile His-70 -65 -60Asn Leu Glu Ala Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala Met-55 -50 -45Asn His Leu Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met-40 -35 -30Thr Gly Leu Lys Val Pro Leu Ser His Ser Arg Ser Asn Asp Thr-25 -20 -15Leu Tyr Ile Pro Glu Trp Glu Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp-10 -5 15Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln10 15 20Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser Val Gly Ala Leu Glu Gly25 30 35Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu Asn Leu Ser Pro Gln40 45 50Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Asp Gly Cys Gly Gly Gly55 60 65Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Lys Asn Arg Gly Ile70 75 80Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Glu Glu Ser Cys85 90 95Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr Arg100 105 110Glu Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala115 120 125Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser130 135 140Phe Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn145 150 155Ser Asp Asn Leu Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile160 165 170Gln Lys Gly Asn Lys His Trp Ile Ile Lys Gln Ser Trp Gly Glu175 180 185Asn Trp Gly Asn Lys Gly Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn190 195 200Asn Ala Cys Gly Ile Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met205 210
权利要求
1.一种编码组织蛋白酶O的分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自如下一组(a)编码具有图1的推导的氨基酸序列的组织蛋白酶O多肽或者所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；(b)编码具有由ATCC保藏号75671所含cDNA编码的氨基酸序列的组织蛋白酶O多肽或者所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。
3.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是基因组DNA。
5.权利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码具有图1的推导的氨基酸序列的组织蛋白酶O。
6.权利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码由ATCC保藏号75671的cDNA编码的组织蛋白酶O多肽。
7.权利要求1的多核苷酸，具有图1所示的组织蛋白酶O的编码序列。
8.权利要求2的多核苷酸，具有ATCC保藏号75671所保藏的组织蛋白酶O的编码序列。
9.含有权利要求2的DNA的载体。
10.用权利要求9的载体遗传工程化的宿主细胞。
11.一种用于生产多肽的方法，包括用权利要求10的宿主细胞表达由所述DNA编码的多肽。
12.一种生产能表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求9的载体对细胞进行遗传工程化。
13.可与权利要求2的DNA杂交并编码具有组织蛋白酶O活性的多肽的分离的DNA。
14.一种多肽，选自如下一组(i)具有图1的推导的氨基酸序列的组织蛋白酶O多肽及其片段、类似物和衍生物；(ii)由ATCC保藏号75671的cDNA编码的组织蛋白酶O多肽及所述多肽的片段、类似物和衍生物。
15.权利要求14的多肽，其中该多肽是具有图1的推导的氨基酸序列的组织蛋白酶O。
16.抗权利要求14的多肽的抗体。
17.抗权利要求14的多肽的拮抗剂/抑制剂。
18.治疗需要抑制组织蛋白酶O的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的抗权利要求14的多肽的拮抗剂。
19.一种药物组合物，包括权利要求14的多肽和一药物学可接受载体。
20.治疗需要抑制组织蛋白酶O的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的抗编码组织蛋白酶O的DNA或RNA的反义构建体，以便抑制其转录和翻译成组织蛋白酶O。
21.治疗需要抑制组织蛋白酶O的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求16的抗体。
22.治疗需要抑制组织蛋白酶O的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求17的拮抗剂/抑制剂。
23.一种鉴别组织蛋白酶O的抑制剂的方法，包括将组织蛋白酶O多肽的可能的抑制剂与式X-(Y)。-Z的肽基底物结合，其中(i)X是一氨基保护基团；(ii)Y是任何天然存在或非天然存在的氨基酸；(iii)n是任何整数；以及(iv)Z是任何显色或荧光显色标记；使组织蛋白酶O裂解Y氨基酸基团足够长时间；如果使用荧光显色标记则将肽基底物通过荧光计，如果使用显色标记则将肽基底物通过分光光度计；以及检测由Z释放的荧光或颜色的产生。
全文摘要
本发明公开了人破骨细胞衍生的组织蛋白酶(组织蛋白酶0)多肽和编码这种组织蛋白酶0多肽的DNA(RNA)，还提供了通过重组技术生产这种多肽的方法。本发明还涉及这种多肽的抗体、拮抗剂和抑制剂，它们可用于防止这种多肽的作用并因此可用作治疗骨疾病如骨质疏松症和癌症如肿瘤转移。
文档编号A61K48/00GK1150754SQ94195094
公开日1997年5月28日 申请日期1994年4月29日 优先权日1994年3月8日
发明者格雷格·A·海斯廷斯, 马克·D·亚当斯, 克莱尔·M·弗雷泽, 诺曼·H·李, 厄文·F·科克尼斯, 朱迪丝·A·布莱克, 丽莎·M·菲次杰拉尔德, 弗雷德·H·德雷克, 马克西安·高万 申请人:人体基因组科学有限公司, 史克比彻姆公司