专利名称：稳定谷氨酰胺转移酶制剂及其生产方法
技术领域：
本发明涉及稳定地谷氨酰胺转移酶制剂，特别是稳定的XIII因子制剂，及其生产方法。
XIII因子(FXIII，纤维蛋白稳定因子)是一种以酶原形式存在于血浆、血小板和单核/巨噬细胞内的谷氨酰胺转移酶，它具有重要作用，特别在保障有效的血液凝固和伤口愈合方面。从胎盘或血浆中分离出的FXIII，许多年来以新鲜冷冻的血浆形式已经成功地应用于XIII因子缺乏的治疗。同时，对于制备重组XIII因子(rFXIII)也已经成为可能。
市售的纯或次纯谷氨酰胺转移酶或FXIII制剂含有添加的稳定剂，比如人类血浆白蛋白(HSA)。而从加入HSA所伴有的酶制剂比活性的降低，额外的蛋白质负荷及/或潜在的致免疫性以及在纯度评估上所起的不利作用这一角度讲，血浆白蛋白对蛋白质制剂是一个不利因素。尤其就高纯度蛋白(比如重组蛋白质)而言，有必要保持已获得的纯度不因加入外源性蛋白而再次降低。此外，当加入白蛋白时还有可能污染病毒抗原。
医疗上所用的蛋白制剂，其组成和活性一般在相对长时间内必须保持稳定。由于溶解状态的蛋白制剂几乎不可能达到这一要求，因此，此类产品常以干燥状态出售。缓和的冷冻干燥是干燥此类产品所选择的方法。然而，即使使用了这种方法，满足成分完整及活性持久的稳定制剂也只能在特定条件下获得。
由于冷冻干燥破坏谷氨酰胺转移酶溶液的稳定性，例如，导致酶活性显著下降及酶溶液明显的混浊，因此，为使用纯FXIII制剂先前(DE-C-2063 070，JP 53/59018)已经阐述了以白蛋白和浓度相对较高的盐分为基础的配方。但这些配方具有前述的加入外源蛋白的缺点及与此有关的所有问题。
也已经描述了在甘氨酸或精氨酸及非还原糖存在下rFXIII的冷冻干燥(WD93/03147)。但在这一实例中，没有关于重构冷冻干燥物的稳定性、溶解性或溶解后清晰度的陈述。此外，冷冻干燥的最终产物储存于-20℃，推测可能是由于在4℃条件下不足以保持其稳定性而必须置于-20℃下。
因此，本发明的突出目的是依靠一种为谷氨酰胺转移酶、特别是为FXIII制定的适当配方，获得一稳定蛋白质产物，此蛋白质可以局部(例如表面)或非肠道用药，在2-8℃(或更高)条件下稳定，不需加入其他物质，比如HSA。此外，此冷冻干燥剂可以快速溶解产生一清亮溶液，溶液不混浊且足够稳定。
通过提供谷氨酰胺转移酶制剂的稳定剂型达到本发明的目的，应用特定的稳定剂或其混合物以及生产谷氨酰胺转移酶制剂的方法来获得稳定剂型，下文将详述所用的稳定剂。因而此发明涉及谷氨酰胺转移酶的稳定剂型。此稳定剂型在冷冻干燥后易溶解、不混浊，它包括纯化谷氨酰胺转移酶及除去甘氨酸和精氨酸之外的适当时与表面活性剂和/或还原剂结合的D和/或L氨基酸、其盐、衍生物和同系物、或二聚体或低聚体或其混合物和/或糖或糖醇。
虽然例举的实施方案表明的是关于重组XIII因子和从胎盘或血浆分离出来的FXIII的稳定剂型，但此稳定剂型并不局限于此。所以在优选的具体方案里，本发明涉及XIII因子的稳定剂型、及其生物活性片断、衍生物或其突变蛋白质。
在一特别优选的实施方案里，稳定剂型是指包括来自血浆、胎盘、血小板或巨噬/单核细胞的FXIII，或包括重组FXIII的稳定剂型。
这一新颖的研究实际上可分为两个区域(a)对冷冻干燥本身的研究，及(b)对储存中持续稳定性的研究。
应用rFXIII(Metxner et al.，in J，McDonagh，R.Seitz，R.Eg-bring“Factor XIII”，87-93，Schttauer(1993))及胎盘和血浆FXIII(Karges and Rapp，in J.McDonagh.R.Seitz，R.Egbring“FactorXIII”，66-76，Schattauer(1993))进行研究。
冷冻干燥实验是在市售的装置内用具备和不具备硅烷化面的小玻璃瓶进行的。
(a)冷冻干燥
在冷冻干燥过程中比较不同的添加剂，惊奇地发现，在某些实例中当应用D和/或L氨基酸、其盐、衍生物或同系物中的某些添加剂(表I)时，能使FXIII保持良好的活性和溶解性。
因此，在进一步优选的实施方案里，本发明涉及谷氨酰胺转移酶的稳定剂型，它含有组氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或半胱氨酸、其盐、衍生物或同系物、二聚体或低聚体或其混合物。
特别令人惊奇地是，组氨酸和谷氨酸，甚至在没有其它添加剂的条件下，在冷冻干燥过程中表现出良好的稳定作用。另一方面，当单独应用甘氨酸、蛋氨酸或丙氨酸等氨基酸时，在冷冻干燥过程中会使酶活性降低(表I)。
在某些实例中，冷冻干燥过程中单独应用糖或糖醇能够为酶提供良好的稳定作用(表I)。特别是蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇、或诸如此类的糖和糖醇均能发挥积极的稳定作用。在冷冻干燥过程中当加入的氨基酸(比如，Met，Ala)独自不能充分发挥作用而使酶活性下降时，可以通过氨基酸与糖或糖醇的结合来扭转酶活性的下降(表I)。
因此在进一步的方案里，本发明涉及一种谷氨酰胺转移酶的稳定剂型，它含有蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、山梨醇或甘露醇等糖或糖醇，其衍生物、同系物或其混合物。
当单独应用象Tris或磷酸盐之类的缓冲物质时，仅可得到微不足道的稳定作用。但在冷冻干燥中应用硼酸盐能产生明显的稳定作用(表I)。
当冷冻干燥物溶解时偶而会出现少量的蛋白质沉淀物，在冷冻干燥过程中通过应用表面活性物质，例如，特别是Tween80或Tween20，分子量位于1000～35000Da之间的聚乙二醇(PEG)，十六烷基，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羊毛脂醇，脱水山梨糖醇单油酸酯，可以防止蛋白沉淀物的产生，并且不会影响到FXIII的活性(表II和表III)。
因而，进一步优选的实施方案里，稳定剂型中包括做为表面活性物质的Tween80、Tween20、PEG、十六烷基醇、PVP、PVA、羊毛脂醇或是脱水山梨糖醇单油酸酯。
(b)储存中的稳定性
配制的冷冻干燥物的一项关键性参数是它的储存稳定性，它是在4℃和室温下，以及37℃加速分解的条件下进行测定。
已发现氨基酸与糖、糖醇或糖衍生物结合有助于提高制剂的储存稳定性(表IV)。用不同的糖进行研究表明，当应用象蔗糖、乳糖、海藻糖或麦芽糖之类的糖时，即使长期处于高温条件下也能稳定制剂的活性，当应用象葡萄糖或果糖之类的还原糖时，制剂的活性在37℃条件下会发生缓慢下降(表V)。能够独自提高制剂稳定性的His或Glu，与糖类结合后能进一步提高制剂的稳定性。
在更加优选的实施方案里，稳定剂型因而包含作为稳定剂的与His、Glu、Ile和/或Ala结合的蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、山梨醇或甘露糖醇、或其衍生物、同系物及其混合物。
正如上文已经提到的，当在适当浓度范围内应用表面活性物质时，对制剂的储存稳定性没有负作用(表II和表III)。
尽管FXIII不含有任何不稳定的巯基基团(SH)，但象半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、硫代甘油或谷胱甘肽之类的SH试剂令人惊异地显示出对FXIII储存稳定性起积极作用，特别在高温条件下。在这一点上，可以加入EDTA或柠檬酸盐之类的螯合剂来保护SH的功能。
在一进步优选的实施方案里，谷氨酰胺转移酶的稳定剂型因而在适量的螯合剂存在下包含Cys、N-乙酰-Cys、硫代甘油、硫化钠或谷胱甘肽或及其混合物。
关于保持冷冻干燥制物的活性和溶解性方面，应用三元或四元混合物(氨基酸、糖和表面活性成分)，例如应用His/Tween/蔗糖混合物，His/PEG/蔗糖混合物或His/Ile/PEG/蔗糖混合物，得到了很好的结果。在又一优选的实施方案里，谷氨酰胺转移酶的稳定剂型因此包含作为添加剂的物质，除了氨基酸、糖或糖醇及表面活性物质外，此处特别优选His/Tween20/蔗糖或His/Tween80/蔗糖，His/PEG/蔗糖或His/Ile/PEG/蔗糖添加剂混合物。
对于制剂的储存稳定性，由氨基酸及/或糖或糖醇、表面活性物质及还原剂组成的混合物，比如由氨基酸/Cys/或N-乙酰-Cys/PEG/蔗糖，氨基酸/硫代甘油/PEG/蔗糖及糖/还原剂/PEG等组成的混合物，证明同样是合适的配方系统，特别适用于较高温度条件下(表III和表VI)。在又一优选实施方案中，新稳定剂型内因而包含作为添加剂的由氨基酸和/或糖或糖醇、表面活性物质及还原剂组成的混合物，在适量螯合剂存在的条件下，特别优选氨基酸/Cys/PEG/蔗糖，氨基酸/N-乙酰-Cys/PEG/蔗糖，氨基酸/硫代甘油/PEG/蔗糖及糖/还原剂/PEG添加剂混合物。
在所叙述的配方中，使用的FXIII的浓度可在很大范围变动，优选浓度范围是0.003～50mg/ml。
所用氨基酸的优选浓度范围在0.01～10％(W/V)之间，但特别优选.0.1～3％(W/V)这一范围。糖的浓度范围优选为0.1～20％(W/V)，但特别优选为0.2～10％(W/V)。表面活性成分的优选浓度范围为0.00001～5％(W/V)，特别优选为0.0002～0.1％(W/V)。还原剂的使用浓度优选在0.001～2％之间，但特别优选0.005～0.5％。
在储存时间内，冷冻干燥蛋白质的残留水分对其稳定性也有重要作用。应用给定添加剂后，温度可上升到50-60℃持续几个小时而对其活性没有任何不利影响，只要这在冷冻干燥的最后阶段对减少冷冻干燥蛋白质的残留水分是必要的。
为冷冻干燥谷氨酰胺转移酶或FXIII及其随后的储存稳定性，溶液的PH应当在6-9范围内，最好在7-8之间。为达到缓冲作用的目的，优选应用与螯合剂适当结合的PH值位于6至9之间的氨基酸或磷酸盐缓冲液、硼酸盐或Tris缓冲液。
本发明也包括以上所述稳定添加剂的应用，以制备包含一种或数种蛋白质的稳定液态制剂，因为对谷氨酰胺转移酶的实验结果适用于其他蛋白质。
此外，本发明还包括一种稳定蛋白质的方法，尤其适于谷氨酰胺转移酶，其中作为溶液或沉淀物的、最好为谷氨酰胺转移酶的纯蛋白质，与含有一种或数种新添加剂的、PH调至有利于蛋白质稳定的范围的溶液按常规方法混合，然后对全部混合液进行冷冻干燥。
由于按照本方法制备的稳定谷氨酰胺转移酶所具备的优异特性，此酶非常适于配制药品。
本发明也包括含有XIII因子或其生物活性片断、衍生物或突变蛋白质的稳定剂型在制备用于治疗以FXIII缺乏为特征的疾病的药物中的用途。
适当时按照已知的方法，用稳定的药学上可接受的已知赋形剂配制这种新药。可根据护理医生确定的适宜剂量以不同的给药方式给药，比如可静脉、腹膜内、皮下、肌肉内、真皮内及表面给药。
实例说明本发明。
实施例1
通过在酵母细胞内的表达制备rFXIII，并通过适宜的方法使其纯化到＞98％的纯度，以溶液或沉淀物形式的rFXIII和同样纯化的胎盘FXIII用稳定剂溶液进行处理，以获得特定的活性。过滤FXIII溶液，将其分装于小玻璃瓶内，按适当的冷冻干燥程序进行干燥，然后，再用蒸馏水将冷冻干燥物配成原来的体积。冷冻干燥前后测定FXIII的活性。另外，还要评定重配溶液的混浊度。
应用市售Berichrom FXIII检测试剂盒测定FXIII的活性。
表I、II和表III中所列的结果明确表明，当冷冻干燥FXIII时，有必要加入稳定成分，并且即使不用HSA，通过加入氨基酸或糖或氨基酸和糖也能保持FXIII的酶活性和溶解性。特别是在某些情况中，通过加入表面活性剂可以进一步提高酶的溶解性。
实施例2
如实施例1中所述制备的rFXIII和胎盘FXIII的冷冻干燥品储存于4℃或37℃下，并在不同的储存时间后与注射用水或氯化钠溶液再配制，以测定剩余的酶活性。
表II至表VI所示的结果表明，应用上文所叙的氨基酸和/或糖或糖衍生物混合物可使酶在相当长的时间内保持稳定。
在某些情况下，尤其在加速分解的条件下，还原成分的加入可致酶稳定性进一步提高。
表I冷冻干燥FXIII
表1(续)
活性检测Berichrom FXIII
浊度-没有混浊
(-)最轻微的混浊
+/-非常轻微的混浊
+ 轻微但很明显的混浊
++ 显著混浊
+++非常显著的混浊表II表面活性物质对XIII因子冷冻干燥制剂的溶解性或稳定性的作用
如果没有其他说明，样品储存于4℃、PH为7.6的条件下。
活性检测Berichrom FXIII (U/ml)
浊度-没有混浊(-)最轻微的混浊+轻微但很明显的混浊
表IIIFXIII冷冻干燥制剂的储存
在室温下样品的储存
活性测定Berichrom FXIII浊度-没有混浊(-)最轻微的混浊
表IV重组XIII因子冷冻干燥制品在4℃下的储存
活性检测Berichrom FXIII
表VXIII因子冷冻干燥制品在37℃下的储存
活性测定Berichrom FXIII
表VIFXIII冷冻干燥制剂在不同温度的储存
室温下的储存
表VI(续)FXIII冷冻干燥制剂在不同温度下的储存
在+37℃储存
活性检测Berichrom FXIII
权利要求
1.谷氨酰胺转移酶的一种稳定剂型，其在冷冻干燥后容易溶解且没有任何混浊，此剂型内含纯化谷氨酰胺转移酶和作为添加剂的除甘氨酸和精氨酸外的D-和/或L-氨基酸，其盐、衍生物和同系物，或二聚体或低聚体或其混合物，和/或糖或糖醇，适当时与表面活性剂和/或还原剂结合。
2.权利要求1中的稳定剂型，其中的谷氨酰胺转移酶是XIII因子(FXIII)，或者是FXIII的生物活性片断、衍生物或突变蛋白质。
3.权利要求2中的稳定剂型，其中的FXIII是从血浆、胎盘、血小板或巨噬/单核细胞中提取的FXIII，或是rFXIII，或是它们的生物活性片断、衍生物或突变蛋白质。
4.权利要求1-3之一的稳定剂型，其中的氨基酸是His、Glu、Met、Thr、Lys、Ala、Ile或Cys，或者是他们的盐、衍生物或同系物、或二聚体或低聚体，或是其混合物。
5.权利要求1-4之一的稳定剂型，其中的糖或糖醇是指蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、山梨醇或甘露糖醇、或它们的衍生物、同系物或混合物。
6.权利要求5中的稳定剂型，其中糖或糖醇是以与组氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、丙氨酸相结合的状态存在。
7.权利要求1-6中的稳定剂型，其中的表面活性剂是Tween80、Tween20、PEG、十六烷基醇、PVP、PVA、羊毛脂醇或脱水山梨糖醇单油酸酯。
8.权利要求1-7之一的稳定剂型，其中的还原剂是适当时螯合剂存在下的半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、硫代甘油、硫化钠或谷胱甘肽、或其混合物。
9.权利要求1-8之一的稳定剂型，其包括除了氨基酸、糖或糖醇、及表面活性物质之外的添加剂。
10.权利要求9中的稳定剂型，其包括作为添加剂的His/Tween80/蔗糖，His/Tween20/蔗糖，His/PEG/蔗糖或His/Ile/PEG/蔗糖。
11.权利要求1-8之一的稳定剂型，其包括作为添加剂的一种或数种氨基酸和/或糖或糖醇，表面活性物质及适当时的还原剂。
12.权利要求11中的稳定剂型，其包括作为添加剂的氨基酸/Cys/PEG/蔗糖，氨基酸/N-乙酰-Cys/PEG/蔗糖，氨基酸/硫代甘油/PEG/蔗糖或糖/还原剂/PEG，及适当时存在的螯合剂。
13.权利要求1-12之一的稳定剂型，其中谷氨酰胺转移酶的浓度在0.003～50mg/ml范围内。
14.权利要求1-13之一的稳定剂型，其中氨基酸、其盐、衍生物或同系物的浓度范围为0.01～10％(W/V)，优选为0.1～3％(W/V)。
15.权利要求1-14之一的稳定剂型，其中糖或糖醇的浓度范围为0.1～20％(W/V)，优选为0.2～10％(W/V)。
16.权利要求1-15之一的稳定剂型，其中的表面活性剂的浓度在0.00001～5％(W/V)之间，优选为0.0002～0.1％(W/V)。
17.权利要求1-16之一的稳定剂型，其中的还原剂浓度在0.001～2％(W/V)范围内，优选为0.005～0.5％(W/V)。
18.权利要求1-17之一的稳定剂型，其PH范围为6～9，优选范围为7～8。
19.权利要求1-17之一的稳定剂型，其包含PH值在6～9范围内的硼酸盐缓冲液及适当时的螯合剂。
20.权利要求1-17之一的稳定剂型，其包括PH值在6～9范围内的Tris缓冲液及适当时的螯合剂。
21.权利要求1-20之一的一种或多种稳定添加剂在制备稳定液体蛋白制剂中的用途。
22.一种制备稳定蛋白质制剂的方法，其包括将溶液或沉淀物形式的纯化蛋白质与含有一种或数种权利要求1-20之一的添加剂的溶液混合并冷冻干燥。
23.权利要求22的方法，其中的蛋白质是谷氨酰胺转移酶。
24.按照权利要求22中的方法所稳定的谷氨酰胺转移酶用于配制药品。
25.权利要求1-20之一的谷氨酰胺转移酶的稳定剂型在制备用于治疗以FXIII缺乏为特征的疾病的药物中的用途。
26.权利要求1-20之一的谷氨酰胺转移酶的稳定剂型在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途，表面或非肠道应用这种谷氨酰胺转移酶对此疾病有疗效。
全文摘要
本发明涉及谷氨酰胺转移酶(例如XIII因子)的稳定剂型，此稳定剂型在冷冻干燥后容易溶解且没有混浊，它包括纯化谷氨酰胺转移酶以及除甘氨酸和精氨酸以外的适当时与表面活性剂和/或还原剂结合的D和/或L氨基酸，它们的盐，衍生物和同系物，或二聚体或低聚体或其混合物，和/或糖或糖醇。本发明也涉及稳定蛋白制剂的制备方法及使用以上所叙的稳定剂型制备药品，此药品用于治疗以FXIII缺乏为特征的疾病。
文档编号A61K47/10GK1137564SQ9610273
公开日1996年12月11日 申请日期1996年3月8日 优先权日1995年3月9日
发明者H·莫茨纳, H·卡格斯 申请人:柏林魏克股份公司