治疗急性和慢性炎症疾病的药物的制作方法

专利名称：治疗急性和慢性炎症疾病的药物的制作方法
技术领域：
本发明是关于某些N-取代的烟酰胺化合物及其适于药用的酸加成盐在治疗哺乳动物(包括人)的急性和慢性炎症中的应用。
具有下列结构式的N-3-(4-甲氧苄基)-2-[4-氟代苯氧基]烟酰胺。
及其它N-取代烟酰胺化合物在1989年8月29日公告的美国专利4,861,891中提及。此专利是关于使用上述这些化合物作为IV型磷酸二脂酶(PDEIV)的选择性抑制剂。此专利在此将全面引作参考。
N-取代烟酰胺化合物，包括N-3-甲氧苄基-2-苯氧基烟酰胺，在下文中将称做“式1化合物”，这类化合物还可用于在U-937细胞中增加PGE1的效用-提高诱导环AMP的水平及在人类嗜酸性细胞中抑制白三烯合成和介质释放。这些化合物在雪貂中也具有减缓催吐反应的作用。
本发明是关于在哺乳动物(特别是人)中抑制IV型磷酸二脂酶或抑制产生肿瘤坏死因子(TNF)的一种方法，包括给于上述哺乳动物以抗炎剂量的一种化合物或其适于药用的酸加成盐，该化合物的结构式为
其中R3是1-哌啶基，1-(3-吲哚基)乙基，(C1-C4)-烷基、苯基、苄基、1-(1-苯乙基)或单取代苄基，其中的取代基为氯、氟、甲基或甲氧基、上述取代基在芳香环上；R4是二环[2.2.1]庚烷-2-基或如下类结构式
其中Y是氢、氟或氯；X是氢、氟、氯、甲氧基、三氟甲基、氰基、羧基、甲氨基甲酰基、二甲基-氨基甲酰基或(C1-C4)烷氧羰基。
本发明的一种优选的实施方案是在上述治疗炎症的方法中使用的化合物，其R3为1-哌啶基或1-(3-吲哚基)乙基。
本发明的另一种优选方案是在上述方案使用的化合物中，其R3为1-(3-吲哚基)乙基及R4为二环[2.2.1]庚烷-2-基。
本发明的另一种优选方案是在上述方案中使用的化合物中，其R4为
其中Y是氢；X是(C1-C4)烷氧羰基。
本发明的另一种优选的方案是在上述方案中使用的化合物中，其R3是1-哌啶基和R4为
本发明的另一种优选方案是关于使用上述方法治疗或预防下述这组疾病中的任一种疾病气喘、慢性支气管炎、特应性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、春季结膜炎、嗜曙红细胞肉芽瘤、牛皮癣、风湿性关节炎、脓毒性休克、溃疡性结肠炎、心肌和大脑的克罗恩氏病再灌注损伤、慢性肾小球肾炎、内毒素休克、成人呼吸窘迫综合症、尿崩症、多发性硬化和中枢神经系统紊乱、以及其它涉及产生TNF疾病，该方法包括给于病人以有效剂量的化合物或其适于药用的酸加成盐，该化合物的结构式为
其中R3是1-哌啶基，1-(3-吲哚基)乙基，(C1-C4)-烷基，苯基，苄基，1-(1-苯乙基)或单取代苄基，其中的取代基为氯，氟，甲基或甲氧基，上述取代基在芳香环上；R4是二环[2.2.1]庚烷-2-基或下式结构的基团
其中Y是氢，氟或氯；以及X是氢、氟、氯、甲氧基、三氟甲基、氰基、羧基、甲基氨基甲酰基、二甲基-氨基甲酰基或碳(C1-C4)烷氧基。
式1化合物及其适于药用的酸加成盐可以按照前述美国专利4,861,891中所述之方法制备。
IV型磷酸二脂酶抑制剂可用于治疗各种过敏性和炎症疾病，其中包括气喘、慢性支气管炎、特应性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、春季结膜炎、嗜曙红细胞肉芽瘤、牛皮癣、风湿性关节炎、脓毒性休克、溃疡性结肠炎、心肌和大脑的克罗恩氏病再灌注损伤、慢性肾小球性肾炎、内毒素休克和成人呼吸窘迫综合症。此外，PDE IV抑制剂还用于治疗尿崩症，多发性硬化和中枢神经系统紊乱，如抑郁症和多发性梗塞性疾呆症。
IV型磷酸二脂酶抑制剂显示出能抑制肿瘤坏死因子(TNF)的产生。式1化合物也可用于治疗一些病毒感染，这些病毒对TNF的增多敏感或引发体内TNF的产生。这里为治疗所关注的这些病毒是那些产生TNF引起感染的病毒或者是那结对式1的TNF抑制剂所产生的抑制敏感的病毒，所说的抑制如直接或间接地由减少复制而产生的抑制。上述这些病毒包括但并非限于HIV-1，HIV-2和HIV-3，巨细胞病毒(CMV)，流感病毒，腺病毒及疱疹(Herpes)病毒群，例如，但不限于，带状疱疹和单纯性疱疹。
本发明更具体的是关于一种治疗受人的免疫缺损病毒(HIV)感染的哺乳动物的方法，包括给于该哺乳动物以抑制TNF有效剂量的式1化合物。
式1化合物也可用于动物(除人之外)需要抑制TNF产生的兽医治疗。治疗或是预防由TNF引起的动物的疾病，包括上述那些疾病，特别是一些病毒感染。这些病毒包括(但不限于)猫的免疫缺损病毒(FIV)，或其它逆转呆病毒感染，例如马的感染性贫血病毒，羊的关节炎病毒，绵羊髓鞘脱落病毒，梅迪病毒和其它慢性病毒。
当酵母菌和真菌对TNF增多敏感或将诱导体内TNF的产生时，式1化合物也可用于治疗这些酵母菌和真菌的感染。一种适宜治疗的疾病是真菌性脑膜炎。另外，式1化合物也可与其它治疗全身性酵母菌和真菌感染的药物合并用药。用于真菌感染的药物包括(但并不限于)多粘菌素类化合物，如多粘菌素B；咪唑类化合物，如克霉唑、益康唑、咪康唑和酮康唑；三唑类化合物，如氟康唑和伊康唑，以及二性霉素类药物，特别是二性霉素B和二性霉素B的脂质体制剂。
抗真菌药和式1化合物的一种合用时，可以用任何一种优选的成分组成，例如本领域技术人员所熟知的一些配方，如二性霉素B的各种配方。抗真菌药和式1化合物的合用，可以是同时作用，或者在实用中分次给哺乳动物用药，但以一种连续的方式进行。特别是式1化合物可与二性霉素B的某种制剂合用，主要用于治疗全身性真菌感染。治疗用的优选微生物是念珠菌类(Candida)。式1化合物可按类似的方式与抗病毒药物或抗细菌药物合用。
通过对需要治疗的哺乳动物给于有效剂量的式1化合物，还可以抑制和/或降低抗真菌药物、杀菌药物或抗病毒药物的毒性。最好将一种式1化合物用于抑制或降低二性霉素类药物的毒性，特别是二性霉素B的毒性。
本发明的方法包括给某哺乳动物使用式1化合物及其适于药用的酸盐，以及这些化合物及其盐的溶剂化物(这里统称为“治疗药剂”)。在给所说的哺乳动物使用这些治疗药剂时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。给药可以经各种途径。包括口服，非胃肠道给药和局部给药。这里使用的非胃肠道给药包括但并限于静脉注射，肌肉注射，腹腔注射，皮下注射和透皮给药，但一般最好是口服使用这些物治疗药剂。
这类治疗药物的最佳用途是用于治疗急性和慢性的炎症疾病，按照本发明，给药剂量在约5-约250mg/天之间，最好是约20-约120mg/天，单次或分次服用。对鼻内或用吸入器给药，一般将其制成0.1-1％(W/V)的溶液型制剂。临床上医生将决定最适于某一病人的实际剂量，这个剂量随具体病人的年龄，体重和对用药反应的不同而有所不同。上述剂量是一般情况的典型，当然要考虑给于更高或更低剂量的个别病例是存在的。所有这些剂量都属于本发明的范畴。
在某些病例中，剂量低于前述剂量范围的低限可能就已经足够了，而在另外一些病例中高于上述剂量范围的用药也可能不引起任何有害的或有毒的副作用，只要高剂量先分成若干小剂量并在一天内分次服用。
对于口服给药，片剂中含赋形剂如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸二钙，各种崩解剂如淀粉，最好是马铃薯或木薯淀粉，海藻酸和某些硅酸盐复合物，以及粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉组胶。另外，在制片时润滑剂例如但并不限于硬脂酸镁、月桂醇硫酸钠和滑石粉通常可能是非常有用的。一些类似的固体成分作为填充剂也可用于软明胶胶囊和硬明胶胶囊的制备中，推荐使用的这类辅料包括但并不限于乳糖(lastose或milk sugar)以及高分子量的聚乙二醇。当需要口服应用的水型混悬剂和/或酏剂时，基本的活性组分可以与各种甜味剂或芳香剂、着色剂或染料、必要时还有乳化剂和/或混悬剂，以及诸如水、乙醇、丙二醇和甘油等稀释剂及其各种的混合物一起配制后使用。
对非胃肠道给药，治疗药物可以做成芝麻油，花生油的溶液或含水丙二醇溶液来给药，也可以将上述列举的治疗药物中相应的水溶性碱基盐做成无菌水溶液来给药。必要时，这些水溶液应加入缓冲剂，并用充足的盐水或葡萄糖调成等渗压的。这些水溶液特别适于静脉、肌肉和皮下注射。在注射剂的制备方面，无菌的注射用水可以通过一些为本领域的技术人员所熟知的规范技术很容易获得。例如，蒸馏水通常用作溶液稀释剂，最后经过适当的除菌滤器过滤，这些滤器有烧熔玻璃滤器，或者一种硅藻土或无釉瓷滤器。比较好的这类滤器包括Berkefeld Chamberland和Asbestos Disk-Metal Seitz公司的滤器，使用时用一个泵将液体通过滤器抽入一个无菌容器中。在整个制备过程中，必须采取必要的措施以确保最后的注射液产品在无菌状态下获得。
对于透皮给药，某种特殊治疗药物的剂型可以包括(举例而言)溶液，洗剂、软膏，乳膏剂、凝胶、栓剂以及限速缓释制剂和装置。这些剂型含有特定的化合物，还可能含有乙醇、水、渗透促进剂和惰性载体，如产生凝胶的物质，矿物油、乳化剂，苯甲醇及类似物。一些特效透皮吸收增强成分在欧洲专利申请271,983和331,382中披露，它们分别公布于1988年6月22日和1989年9月6日。现将这些申请全面引用于此。
式1化合物抑制PDE IV的能力及展现降低催吐活性的能力可依下述方法分别测定。
IV型磷酸二脂酶(PDE IV)的抑制人的重组PDE IV表现在一种杆状病毒/SF-9细胞系统中(Pollok BFuogE，Robbins M，Fisher D，Umland J.PillarJ and ChengJBaculovirus expressionof human phosphodiesterase(PDE)IV isoenzymescomparison with PDE IVproduced in mammalian and bacterial expression system Baculovirus and InsectCell Gene Expression Conference，Pinehurst，N.C.March 26-30，1995)。SF-9细胞溶解液能够水解环AMP(cAMP)，并对环GMP(cGMP)没有作用。这些酶的动力学分析表明，水解cAMP的米氏常数(Michaelis constant)Km为0.5-4mM范围。该酶对氯化镁敏感，并被标准的PDE IV抑制剂咯利普兰(rolipram)所抑制。这些制剂用于评价被测化合抑制PDE IV的能力。
测试化合物的制备化合物溶于二甲亚砜，浓度为10-2M，然后以1∶25的比例用水稀释(4×10-2M浓度的化合物，4％的二甲亚砜)。在4％二甲亚砜中再进一步做一系列稀释以获得需要的浓度。测试试管中二甲亚砜的最终浓度为1％。
三个平行组中，在4℃下向每个12×75mm玻璃试管依次加入下列物质(给出的所有浓度为测试管中最终浓度)25μl化合物或二甲亚砜(1％，用于对照和空白)25μl测试缓冲液(50μM Tris，10mM氯化镁，pH7.5)25μl[3H]-环AMP(1μM)25μ1PDEIV酶(用于空白，酶在沸水浴中予先保温10分钟。
振荡反应试管并将其置于37℃水浴中10-30分钟，然后将试管置于沸水浴中2分钟终止反应。在冰浴中向每管加入洗涤缓冲液(0.5ml，0.1MHEPES/0.1M氯化钠，pH8.5)将每支试管中的内容物上样到予先用洗涤缓冲液平衡的Affi-Gel 601柱(硼化亲和凝胶，1.2ml柱床体积)。用2×6ml洗涤缓冲液冲洗[3H]环AMP，然后用6ml 0.25M乙酸洗脱[3H]5′AMP。混匀后，在一个合适的小瓶中把1ml的洗脱液加到3ml原子光闪烁液中，混匀并进行[3H]计数。
用下式确定抑制百分率
IC50意义为抑制[3H]CAMP水解至[3H]5′AMP达50％的化合物浓度。
在某一实验中，使用类似于Thompson等人发表的一步酶检验方法评价了被试化合物对PDE IV的抑制作用(Thompson JW，BrokkerG，and ApplemanMMAssay of cyclic nucleotide phosphodiesterases with radioactire substrates.Methods in Enzymology 38205-212，1974)。
对化合物的环AMP(cAMP)升高的评估获得在连续培养中生长的人U937细胞，将其在22℃温度下在SorvallRT6000B上以1400转/(rpm)离心5分钟。弃去上清液，将该细胞沉淀再悬浮于加有2％胎牛血清(此后称FBS)的RPM1 1640培养基中。用血细胞计数器将细胞计数并检测存活度。向细胞悬液中加入适当体积的RPM1＋2％FBS，使细胞浓度为106细胞/ml。在平行的两组或之组试样中，把500ml悬液(5×105细胞)加入到12×75mm玻璃试管，其中含有5μl+/-被试化合物。将该混合物在37℃下保温15分钟。加入1μl PGE1，再保温15分钟，然后将试管置于沸水浴中10分钟。
试管在Sorvall RT6000B中以3700rpm离心10分钟。小心取10μl上清液进行放射免疫测试(此后称RIA)。用cAMP RIA试剂盒(new Enngland Nuclearcat no.NEK-033)定量每支试管的cAMP。接着根据试剂盒中RIA手册所述的非乙酰化测试方法作修正。
校正稀释液和细胞浓缩物的cAMP，以每1×106细胞产生的皮摩尔(pmol)cAMP表示，也算出每个试样的平均值+/-标准误差(如果适用)。计算两种衡量化合物效力的指标(EC50或PC50)中的任何一种。EC50是扣除基线应答后，产生50％任意最大应答(如10mM咯利普兰产生的cAMP浓度)的化合物浓度。PC50是扣除基线响应后，产生该化合物50％最大应答的化合物浓度。被测化合物的最大应答必须至少为基线应答的150％。以便计算PC50。
化合物对产生EDN/LTE4抑制作用用真空管#6480(143 USP Units Sodium Heparin，10ml draw)从健康的捐献者得到100ml血液。肝素处理的全血在室温下倒入硅化的玻璃烧杯或50ml锥形离心管中。用Diff-Ouik方法进行全血涂片，确定单核白细胞总数中嗜曙红细胞的百分比。在平行三组中，把1ml全血加到含有1μl＝甲亚砜或1μl1000×被试化合物的12×75mm聚丙烯或硅化玻璃管中。混匀后将试管置于37℃振荡水浴中15分钟。在所有的试管中加入溶于二甲亚砜的1μlPGE1，使最终浓度为1μM或0.1μM PGE1。混匀后，试管中加入100μl PBS(阴性对照)或悬于PBS的葡聚糖G-15球(最终浓度8.25-16.5mg/ml)。混匀后所有试管于37℃振荡水浴中保温1-2小时。
培育的最后，向每个测试管中加入20μl溶于PBS的15％乙二胺四乙酸，最终浓度为0.3％。混匀后，所有测试管于22℃以2000rpm离心5分钟。
测定所有血浆上清液的EDN水平。根据试剂盒制造商的说明(KabiPharmacia Diagnostics)以所有比推荐的少5倍的体积(如10μl未知样品的体积)进行EPX RIA。EDN和EPX已被证明是相同的蛋白(Dahl et al.，AsthmaBasic Mechanisms and Clinical Management 2nd ed.p112，1992)。用MicrosoftExcel或其它合适软件，通过与标准曲线相比较来计算EDN水平，表示为ng/ml。用下式计算对照的EDN释放的百分比％对照EDN＝(EDN样品－EDN空白)/(EDN总量－EDN空白)其中EDN空白是没有葡聚糖G-15的EDN释放，EDN总量是葡聚糖G-15存在时的EDN释放。若适用的话，用Microsoft Excel或其它合适的软件确定被试化合物的IC50。
LTE4酶免疫测定(EIA)对所有血浆上清液进行LTE4水平检测。根据试剂盒制造商的说明(Cayman Chemical)，使用在EIA缓冲液中1∶10的血浆样品稀释液作为未知样品进行LTE4 EIA。可使用其它LTE4标准品而不是试剂盒提供的标准品。用Microsoft Excel或其它合适软件，通过与标准曲线比较计算LTE4水平，并表示为ng/ml。用下式计算对照LTE4的释放百分率％对照LTE4＝(LTE4样品－LTE4空白)/(LTE4总量－LTE4空白)其中LTE4空白是没有葡聚糖G-15的LTE4释放。LTE4总量是有葡聚糖G-15时的LTE4释放。如果适用的话，用Microsoft Excel或其它适当的软件确定被试化合物的IC50。
化合物催吐活性的评价把被试化合物给于五只雄性雪貂(口服或腹腔给药)，然后将其置于单独的有机玻璃笼中，口服给药的载体是含2％Tween 80的3ml蒸馏水。腹腔给药的载体是3ml蒸馏水。
在研究期间(典型为60分钟)连续观察动物。记录下列行为(1)大量呕吐，(2)干呕(逆着封闭的呼吸声门作无痰的有节奏的腹部收缩)，(3)张口作呕，动物张开口，逆着封闭的声门收紧(这不包括有节奏的腹部收缩)。对于每只动物，记录每种行为的数目和发生呕吐的时间。其它行为也要记录。
雪貂7天内不再作试验。用PDE IV抑制剂咯利普兰的研究表明，雪貂可以每周接受此催吐刺激三次而在第四周不表现对盐水的呕吐。给于雪貂咯利普兰四周后，第五周对盐水刺激提早发生呕吐。因此用于此筛选试验的动物只能给于催吐刺激三次，然后从群体中撤出。
如果需要血浆药物水平，动物用甲苯噻嗪(Rompum)和氯胺酮(Ketamine)麻醉。然后用标准心脏穿刺技术从心脏取1ml血液。
数据表示为每组5只动物的呕吐，干呕和张口作呕的数目。计算呕吐，干呕或张口作呕的动物与动物总数的比值为[(产生呕吐的数目/试验组中的总数)×100]
权利要求
1.下式化合物或其适于药用的酸加成盐用于制备在哺乳动物特别是人中抑制IV型磷酸二脂或抑制产生肿瘤坏死因子的药物
其中R3是1-哌啶基、1-(3-吲哚基)乙基、(C1-C4)烷基、苯基、苄基、1-(1-苯乙基)或单取代的苄基，其取代基为氯、氟、甲基或甲氧基，所述取代基在芳香环上；R4是二环[2.2.1]庚烷-2-基或以下结构式的基团
其中Y是氢、氟、氯；x是氢、氟、氯、甲氧基、三氟甲基、氰基、羧基、甲氨基甲酰基、二甲氨基甲酰基或(C1-C4)烷氧羰基。
2.按照权利要求1的用途，其中被使用的化合物是一种R3为1-哌啶基或1-(3-吲哚基)乙基的化合物。
3.按照权利要求1的用途，其中被使用的化合物是一种R3为1-(3-吲哚基)乙基和R4为二环[2.2.1]庚烷-2-基的化合物。
4.按照权利要求1的用途，其中被使用的化合物是一种R4为下式的化合物
其中Y是氢和X是(C1-C4)烷氧羰基。
5.按照权利要求1的用途，其中被使用的化合物是一种R3为1-哌啶基和R4为下式的化合物
6.按照权利要求1的用途，其中所制备的药物用于治疗或预防下述这组疾病中的任一种疾病，这些疾病是气喘、慢性支气管炎、特应性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、春季结膜炎、嗜曙红细胞肉芽瘤、牛皮癣、风湿性关节炎、脓毒性休克、溃疡性结肠炎、心肌和大脑的克罗恩氏病再灌注损伤、慢性肾小球性肾炎、内毒素休克、成人呼吸窘迫综合症、尿崩症、多发性硬化和中枢神经系统紊乱、以及其它涉及产生TNF疾病，所说药物含有下式结构的化合物或其适于药用的酸加成盐
其中R3是1-哌啶基，1-(3-吲哚基)乙基，(C1-C4)烷基、苯基，苄基、1-(1-苯乙基)或单取代苄基，其中取代基为氯、氟、甲基或甲氧基，所述取代基在芳香环上；R4是二环[2.2.1]庚烷-2-基或具有以下结构的基团
其中Y是氢、氟或氯；及X是氢、氟、氯、甲氧基、三氟甲基、氰基、羧基、甲氨基甲酰基、二甲氨基甲酰基或(C1-C4)烷氧羰基。
全文摘要
本发明是关于治疗哺乳动物特别是人的炎症疾病的方法，包括给于上述哺乳动物一种抗炎剂量的具有以下结构式的化合物或其适于药用的酸加成盐，其中R
文档编号A61P13/02GK1157136SQ9611244
公开日1997年8月20日 申请日期1996年10月17日 优先权日1995年10月27日
发明者约翰·B·陈, 安东尼·马菲特, 约翰·W·沃森 申请人:美国辉瑞有限公司