专利名称：：旋转异构酶活性抑制剂的制作方法相关的申请本申请是1995年6月7日提交的美国专利申请号08/474,072的部分延续。
背景技术：
：1、发明领域本发明涉及利用2-哌啶酸衍生的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的神经营养性化合物作为与免疫亲和蛋白蛋白质相关的酶活性抑制剂，特别是作为肽酰-脯氨酰异构酶或旋转异构酶酶活性抑制剂的方法。2、先有技术的说明术语免疫亲和蛋白指大量作为免疫抑制剂，如环孢菌素A(CsA)，FK506和雷帕霉素受体的蛋白质。已知的免疫亲和蛋白为亲环蛋白，和FK506结合蛋白，如FKBP。环孢菌素A与亲环蛋白结合，而FK506和雷帕霉素与FKBP结合。这些免疫亲和蛋白-药物复合物干扰各种细胞内信号转导系统，特别是在免疫系统中和在神经系统中。已知，免疫亲和蛋白具有肽酰-脯氨酰异构酶(PPI酶)或旋转异构酶酶活性。已确定，旋转异构酶活性在免疫亲和蛋白蛋白质顺式和反式并构体互变过程中具有催化作用。免疫亲和蛋白最先在免疫系统中发现并进行研究。最初，本领域技术人员假定，抑制免疫亲和蛋白旋转异构酶活性导致抑制T细胞增殖，因此引起免疫抑制剂，如环孢菌素A，FK506，和雷帕霉素表现出的免疫抑制作用。进一步研究表明，就免疫抑制剂活性而言，仅仅抑制旋转异构酶活性是不够的。见Schreiber等人，科学1990，250，556-559。但看来免疫抑制是由于免疫抑制药物和免疫亲和蛋白间复合物的形成。已表明，免疫亲和蛋白-药物复合物与三元蛋白质靶的相互作用是其作用方式。见Schreiber等人，细胞，1991，66，807-815。就FKBP-FK506和FKBP-CsA来说，药物-免疫亲和蛋白复合物与钙调磷酸酶结合，抑制T细胞发出的使T细胞增殖的信号。类似地，雷帕霉素-FKBP复合物与RAFT1/FRAP相互作用并抑制从IL-2受体发出信号。已发现，在脑神经系统中，存在着高浓度的免疫亲和蛋白。脑神经系统中的免疫亲和蛋白较免疫系统中高出10-50倍。在神经组织中，免疫亲和蛋白似乎影响一氧化一氮的合成，神经递质的释放和神经元突起的延伸。在体内，一氧化一氮可发挥几种作用。在脑中，一氧化一氮似乎是递质。它是由精氨酸形成的，即通过一氧化一氮合成酶，将精氨酸上的胍基氧化形成一氧化一氮和瓜氨酸。刺激N-甲基-d-天冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受体迅速和明显地激活一氧化一氮合成酶并刺激cGMP形成。用精氨酸衍生物如硝基精氨酸抑制一氧化一氮合成酶阻断谷氨酸诱导的cGMP水平升高。一氧化一氮合成酶是钙-钙调节蛋白所需要的酶并且激活N-甲基-d-天冬氨酸受体可刺激一氧化一氮合成酶活性，因为N-甲基-d-天冬氨酸受体具有钙通道，它通过谷氨酸刺激打开，使得钙进入细胞中并激活一氧化一氮合成酶。谷氨酸是生理性神经递质。然而，当释放过量时，谷氨酸通过N-甲基-d-天冬氨酸受体引起神经毒性。用谷氨酸或N-d-天冬氨酸处理大脑皮层神经培养物可杀死90％神经元并且这些作用可被N-甲基-d-天冬氧酸拮抗剂阻断。认为，N-甲基d-天冬氨酸神经毒性是血管意外后引起神经损伤的主要原因。一氧化一氮合成酶的磷酸化作用抑制其催化活性。通过促进一氧化一氮合成酶的来说，FK506可在功能上抑制一氧化一氮的形成并且阻断谷氨酸的神经毒性。事实上，在大脑皮层培养物中，低浓度的FK506和环孢菌素A都可以阻断N-甲基-d-天冬氨酸的神经毒性。当雷帕霉素逆转FK506的治疗作用时，FKBP的调节作用是明显的。据推测，几乎可明显地作为免疫抑制剂的FK506在临床上可用于治疗中风病人。FK506也可以加强与生长有关的蛋白质-43(GAP43)的磷酸化作用。在神经元突出延伸中涉及GAP43并且其磷酸化作用似乎加强该活性.因此，已经使用PCI2细胞核实了FK506，雷帕霉素和环孢菌素A在神经元突出延伸中的作用。PCI2细胞是一系列类似神经元的细胞，当用神经生长因子(NGF)刺激时，它们使轴突延伸。意外地发现，皮摩尔(10-12摩尔)浓度的免疫抑制剂如FK506和雷帕霉素刺激轴突在PCI2细胞和感觉神经，即脊根神经节细胞(DRGs)中长出。见Lyons等人，Proc.Natl.AcadSci.USA，1994，91，3191-3195。在所有动物试验中，FK506可在面神经损伤后，刺激神经再生并可恢复坐骨神经损伤动物的功能。更具体地发现，对FKBP具有高度亲和力的药物是有效的旋转异构酶抑制剂并且表现出极好的神经营养作用。Snyder等人，“免疫亲和蛋白和神经系统”，自然医学(NatureMedicine)，第一卷，第一期，1995年1月，32-37。这些发现提示，利用免疫抑制剂治疗各种外周神经病和促进中枢神经系统(CNS)中神经元的再生。研究表明，由于对感染疾病的特定神经群体具有特异性的神经营养物质减少或生物利用度降低，可导致神经退变性疾病，如早老性痴呆，帕金森病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)发生。几种在脑神经系统中，对特定神经群体发挥作用的神经营养因子已经识别出来。例如，已假定早老性痴呆是由于神经生长因子(NGF)的减少或丧失引起的。因此提出，用外原性神经生长因子或其它神经营养性蛋白质，如脑生长因子，胶质来源生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3来治疗早老性痴呆的病人，由此增加变性神经群体的存活率。这些蛋白质在各种神经病学疾病中的应用受大量蛋白质在神经系统靶释放和生物利用度困难的限制。相反，具有神经营养活性的免疫抑制剂相对比较小并且表现出极好的生物利用度和特异性。然而，当长期给药时，免疫抑制剂表现出大量潜在的副作用，包括肾毒性，如肾小球滤过的损伤和不可逆转的间质纤维化(Kopp等人，1991，美国肾病学协会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)1162)；神经病性缺损，如非意向性震颤，或非特异性脑绞痛，如不确定性头痛(DeGroen等人，1987，N.Engl.J.Med.317861)；和高血压及由此产生的并发症(Kahan等人，1989，N.Engl.J.Med.3211725)。本发明提供2-哌啶酸衍生的、包含小分子FKBP旋转异构酶抑制剂的、非免疫抑制性及免疫抑制性化合物，该化合物在促进轴突生长方面是相当有效的，并用于在各种神经元修复容易的神经病学疾病中，促进神经元生长和再生，所述疾病包括由物理性损伤或疾病如糖尿病引起的外周神经损伤，中枢神经系统(脊髓和脑)的物理性损伤，与中风有关的脑损伤，和治疗与神经退变有关的神经病学疾病，所述疾病包括帕金森病，早老性痴呆和肌萎缩性侧索硬化。发明概述本发明涉及利用2-哌啶酸衍生的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的神经营养性化合物作为与免疫亲和蛋白蛋白质相关的酶活性抑制剂，特别是作为肽酰-脯氨酰异构酶或旋转异构酶酶活性抑制剂的方法。本发明优选的实例为治疗动物神经病学疾病的方法，它包括给予所述动物有效量的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来刺激受损外周神经的生长或促进神经元再生，其中FKBP型免疫亲和蛋白表现出旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。本发明另一优选的实施方案为治疗动物神经病学疾病的方法，它包括联合给予所述动物有效量的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的2-哌啶酸衍生物和有效量的神经营养性因子，所述因子选自神经营养性生长因子，脑来源的生长因子，神经胶质来源的生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3来刺激受损外周神经的生长或促进神经元再生，其中FKBP型免疫亲和蛋白表现出旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。本发明另一优选的实施方案为刺激受损外周神经生长的方法，它包括给予受损外周神经有效量的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来刺激或促进受损外周神经的生长，其中FKBP型免疫亲和蛋白表现出旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。本发明另一优选的实施方案为刺激受损外周神经生长的方法，它包括给予受损外周神经有效量的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来刺激受损外周神经的生长，其中FKBP型免疫亲和蛋白表现出旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。本发明另一优选的实施方案为促进动物神经元再生和生长的方法，它包括给予所述动物有效量的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来促进神经元再生，其中FKBP型免疫亲和蛋白表现出旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。本发明另一优选的实施方案为抑制动物神经退变的方法，它包括给予所述动物有效量的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来抑制神经退变，其中FKBP型免疫亲和蛋白表现出旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。附图简述图1神经破碎后，FKBP-12和GAP-43在面核中的表达。通过原位杂交比较FKBP-12(左)和GAP-43(右)在面核中mRNA表达的时间进程。右面核与破碎的神经是同侧的，左侧为未破碎神经的对照(图1)。对FKBP-12在未处理的对照侧进行原位杂交(左侧)，对钙调磷酸酶Aα，β在面神经破碎后7天，在神经破碎侧进行杂交(右侧)。将试验至少重复3次，得到类似的结果。图2在神经破碎后，FKBP-12在面运动神经元中的定位。图2显示的是在神经破碎7天后，FKBP-12在面核运动神经元(图2A)，和在对照面核运动神经元(图2B)原位杂交的明视野显微照片。图3坐骨神经破碎后，在腰椎运动神经元中，FKBP-12mRNA上调。在右坐骨神经破碎后7天进行FKBP-12原位杂交。上图显示的是在下腰椎前角(ventralhorn)运动神经元中的反应(由箭头指示)。下图显示的是相应的运动神经元的明视野显微照片(图3B)为与破碎神经相对的左侧，(图3C)为与破碎神经同侧的右侧。将该试验重复3次，得到类似的结果。图4坐骨神经破碎后1和6周时，在脊根神经节中FKBP和FKBP-12mRNA的诱导。左图显示的是与破碎神经同侧的、通过L4脊根神经节的切片进行FKBP杂交的暗视野显微照片，右图显示的是[3H]FK506放射放射自显影照片。这些结果中的每一时间点都重复3次。图5右侧面神经的蓖麻毒蛋白损伤。Nissl染色(下图，图5A)表明，在向面神经中注射蓖麻毒蛋白后7天，右面核中运动神经元大量变性，同时伴随神经胶质增殖。上图(图5B)显示的是蓖麻毒蛋白损伤面神经/核后7天，进行FKBPmRNA原位杂交。将该试验重复3次，得到类似的结果。图6神经破碎后7天，[3H]FK506结合在坐骨神经节段上。图解解释了所得到的3mm神经片断如方法中所描述的，狭窄是指在破碎的第7天，收集6小时的结扎部位。远端结扎部位距离最初破碎部位10mm。FKBP的顺行转运速度为124mm/天。数据为平均值±S.E.M.(n＝3)。图7FKBP在坐骨神经中的转运。通过对照(未处理)坐骨神经的切片和7天后坐骨神经破碎部位进行FKBP-12原位杂交的暗视野显微照片(图7A，7B)和[3H]FK-506放射放射自显影照片(图7C，7D)。箭头是指所观测到的神经破碎情景。将该试验重复3次，得到类似的结果。图8在PC-12细胞中所结合的[3H]FK506的含量，其中所述PC-12细胞在存在或不存在NGF(50ng/ml)下保存。对于每一时间点来说，n＝3。棒表示S.E.M.。图9免疫抑制剂介导的、在PC-12细胞中轴突长出的增强。在NGF存在下，在加入或不加入FK506或雷帕霉素下，生长48小时的培养物的Hoffman相差显微照片。图9A在1.0ng/mlNGF中生长的PC-12细胞。图9B50ng/mlNGF。9C1.0ng/mlNGF和100nMFK506。图9D1.0ng/mlNGF和100nM雷帕霉素。放大200倍。图10FK506对PC-12细胞中轴突长出的作用。在存在或不存在100nMFK506下，用各种浓度的NGF处理培养物，在48小时后测定轴突生长。如方法中所描述的，通过用大于5um的神经元突起计算细胞的数目来测定长出情况。对于各试验的每一点来说，n＝4并且误差棒代表SEM。图11FK506加强在PC-12细胞中轴突长出的浓度-反应关系。将细胞用1ng/mlNGF和各种浓度的FK506处理48小时。如图10和方法中所描述的，测定轴突长出反应。对于各试验的每一数据点来说，n＝4，Studentst检验表明*p＜.001。图13在不同的物质中生长的脊根神经节的相差显微照片。图13ANGF100ng/ml，图13BFK5061uM，图13CFK5061uM和抗NGF抗体，图13D未加入生长因子，图13EFK5061pM，图13FFK5061uM和雷帕霉素1uM。刻度线为205uM。NGF引起大量轴突增生(图13A)，1uMFK506也同样(图13B)。通过将浓度减少到1pM来降低FK506的作用(图13E)。然而，1pMFK506所引起的轴突生长比不含FK506时大(图13D)。通过加入抗NGF抗体来消除由培养物中非神经元细胞所产生的NGF作用，也可以降低FK506的作用。大量大束轴突对NGF(100ng/ml)(图13A)或1uMFK506(图13B)的反应显示白色，同时，小束或单个的轴突显示黑色。非神经元细胞，Shwann细胞和某些成纤维细胞在1pMFK506(图13E)或抗NGF抗体(图13C)中比在1uMFK506(图13B)中更明显。在培养物中，由非神经元细胞产生的NGF引起在未加入生长因子的培养物中可见的、有限的轴突生长(图13D)。大量显示白色的、可折射的非神经元细胞遮盖住少数轴突(图13D)。在FK506存在下，雷帕霉素完全抑制轴突的生长(图13F)。显微照片代表来自各试验条件下的12-30神经节。各试验组的差异是高度重现的。图14FK506和雷帕霉素对NGF介导的轴突在PC-12细胞中延伸的作用。单独或在100nMFK506，100nM雷帕霉素或100nMWAY-124,466存在下，用各种浓度的NGF处理PC12(培育60代)。96小时后，当细胞产生的突起比阳性细胞的直径长时，测定轴突生长。对于各试验的每一点来说，n＝3并且误差棒代表S.E.M.。图15皮摩尔浓度的(A)FK506，(B)雷帕霉素和WAY-124,466即可促进由NGF(0.5ng/ml)引起的轴突在PC12细胞中生长。在各种浓度的FK506(□)，雷帕霉素()或WAY-124,466()存在下，用0.5ng/mlNGF将传代低的PC12细胞处理4天。如上图14中所描述的，测定轴突的生长。将在0.5ng/mlNGF(称作L)和50ng/mlNGF(称作H)存在下产生的轴突含量进行比较。图16用免疫亲和蛋白配体+0.5ng/mlNGF或50ng/mlNGF来处理PC12细胞的显微照片。图17免疫亲和蛋白配体使得小鸡感觉神经节产生最大轴突延伸所需要的NGF的量减少。将完整的脊根神经节外植块从9-10天大的小鸡胚胎中分离出来并37℃和5％CO2环境下，在Matrigel涂布的12孔培养皿中培养，其中，所述培养皿中包含L15培养基和高浓度葡萄糖，和10％胎牛血清(补充10umArcC青霉素和链霉素)。将感觉神经节用1ng/mlNGF，1ng/mlNGF加100nMFK506或100ng/mlNGF处理48小时，并计数和拍摄神经元突出。图18FK506，雷帕霉素和WAY-124,466促进感觉神经节产生NGF依赖性轴突。如上图17所述，将小鸡DRG外植块在培养基中培养。将FK506，雷帕霉素和WAY-124,466(各100nM加或减0.1ng/mlNGF)加到DRGG外植块培养基中。48小时后，测定轴突生长情况并将培养物拍摄照片。图19实施例111促进鸡脊根神经节培养物中轴突生长的显微照片。三个图显示的是在1pM浓度(左图)，100pM浓度(中图)和100nM浓度(右图)浓度实施例111下的轴突生长情况。图20实施例17促进鸡脊根神经节培养物中轴突生长的显微照片。三个图显示的是在1pM浓度(左图)，100pM浓度(中图)和100nM浓度(右图)浓度实施例17下的轴突生长情况。图21实施例102促进鸡脊根神经节培养物中轴突生长的显微照片。三个图显示的是在1pM浓度(左图)，100pM浓度(中图)和100nM浓度(右图)浓度实施例102下的轴突生长情况。发明详述本发明新的、2-哌啶酸衍生的神经营养性化合物具有对FK506结合蛋白，如FKBP-12的亲和力。已发现，当本发明神经营养性化合物与FKBP结合时，它们抑制肽酰-脯氨酰顺-反异构酶活性，或结合蛋白的旋转异构酶活性并且意外地刺激轴突生长。可以以无机或有机酸和碱衍生的盐的形式来使用本发明化合物。所述酸的盐包括乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，枸橼酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，富马酸盐，葡庚酸盐，甘油磷酸盐，hemissulfate，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，草酸盐，pamoate，果胶酯酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。碱盐包括铵盐，碱金属盐如钠和钾盐，碱土金属盐如钙和镁盐，与有机碱的盐如二环己基胺盐，N-甲基-D-葡糖胺盐，和与氨基酸如精氨酸，赖氨酸的盐等等。也可以用试剂如低级烷基卤，如甲基，乙基，丙基和丁基氯，溴和碘；二烷基硫酸盐如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸盐，长链卤如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂酰基氯，溴和碘，芳烷基卤如苄基和苯乙基溴等等。由此得到水或油可溶性或可分散性产物。本发明适用于性化合物可定期给予病人，所述病人患神经病学疾病或其它需要刺激神经元再生和生长的疾病，如各种与神经退变有关的外周神经病和神经病学疾病。本发明化合物也可以给予人以外的其它哺乳动物，用于治疗哺乳动物的各种神经病学疾病。本发明新的化合物是有效的旋转异构酶活性抑制剂并且具有极好的神经营养活性。该活性在刺激受损神经元，促进神经元再生，抑制神经退变和治疗几种已知与神经元变性和外周神经病有关的神经病学疾病中是有用的。可治疗的神经病学疾病包括但不限制于三叉神经痛，舌咽神经痛，贝尔麻痹，重症肌无力，肌营养不良，肌萎缩性侧索硬化，进行性肌萎缩，进行性延髓遗传性肌萎缩，成疝的、破裂的或脱垂的无脊椎动物盘综合症，颈椎关节强硬，丛疾病，胸廓出口缺损综合症，外周神经病如由铅，氨苯砜，壁虱引起的疾病，卟啉症，或急性热病性多神经炎，早老性痴呆，和帕金森病。因此，本发明化合物可如下给予通过口服，非肠道，吸入喷雾，表皮，直肠，鼻，颊，阴道给予或通过植入含常规无毒可药用载体，佐剂和赋形剂的、剂量确定的制剂给予。本文所使用的术语非肠道给药包括皮下，静脉内，肌肉内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输注技术。作为有效的中枢神经系统靶治疗剂，当通过外周给药时，免疫亲和蛋白-药物复合物应该容易穿透血-脑屏障。不能穿透血-脑屏障的本发明药物可通过心室内给药途径有效地给予。药物组合物的形式可以为灭菌注射制剂，如灭菌注射水溶液或油状悬浮液。该悬浮液可按照本领域已知的技术，通过使用适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。灭菌注射制剂也可以是在无毒、非肠道给药适宜的稀释剂或溶剂中的灭菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中溶液。可使用的、适宜的赋形剂和溶剂为水，林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。因此，任何可使用的、刺激性少的固定油包括甘油一酯或二酯。在可注射橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯化形式的制剂中，可使用脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物。这些油溶液或悬浮液中也可以包含长链醇稀释剂或分散剂。例如，化合物可以以胶囊剂或片剂的形式，或者以水性悬浮液或溶液的形式口服给予。在口服使用的片剂情况下，通常使用的载体包括乳糖或玉米淀粉。典型地，也可以加入润滑剂如硬脂酸镁。对于口服给药的胶囊剂来说，所使用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当使用水性悬浮液口服给药时，将活性组分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要，可以使用某些增甜剂和/或矫味剂和/或着色剂。本发明化合物也可以以用于直肠给药的栓剂形式给予。可通过将药物与无刺激性的赋形剂混合来制备这些组合物，其中，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，并因此在直肠中熔化后释放药物。该赋形剂包括可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。本发明化合物也可以通过表皮(optically)给予，特别是当准备治疗的疾病涉及容易受表皮用药影响的区域或器官时，所述疾病包括眼、皮肤或下肠道的神经病学疾病。适于这些区域使用的表皮给药制剂是容易制备的。对于眼部应用来说，可将化合物配制成在等渗、PH调节的灭菌盐水中的微粒化悬浮液，或者优选地，配制成等渗、PH调节的灭菌盐水溶液，其中包含或不包含防腐剂，如氯苄烷胺。或者，对于眼部应用来说，可将化合物配制在软膏如凡士林中。对于通过表皮给药的应用来说，可将化合物配制成适宜的软膏剂，其中所述化合物悬浮或溶解在由一种或多种下列物质组成的混合物中矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯混合物，乳化蜡和水。或者，可将化合物配制成适宜的洗液或霜剂，其中所述化合物悬浮或溶解在由一种或多种下列物质组成的混合物中矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷基酯蜡，cetearyl醇，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。下肠道的表皮应用可通过栓剂(如上)或灌肠剂进行。相当于大约0.1mg-10,000mg活性组分化合物的剂量水平适用于治疗上述疾病，优选的剂量水平大约为0.1mg-1,000mg。可以与载体物质合并，产生单一剂量形式的活性组分的量可根据所治疗的宿主和特定的给药方式改变。然而已知，对于任何特定病人来说，特定的剂量水平依赖于各种因素，包括所使用特定化合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，给药时间，排泄速度，联合用药，所治疗特定疾病的严重性和给药方式。化合物可以与其它神经营养性药物一起给予，所述药物如神经营养生长因子(NGF)，神经胶质产生的生长因子，脑产生的生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3。其它神经营养性药物的剂量水平依赖于上述因子和联合用药的神经营养效率。方法和步骤坐骨神经破碎该实施例证明在正常外周神经中含有高浓度的FKBP并且在神经破碎后，FKBP浓度增加。如果FKBP在GAP-43的作用中与神经突起延伸有生理关系，那么可以预期外周神经中FKBP的基本浓度。因此，我们测量了大鼠坐骨羧基以及从2天龄大鼠pups中分离的生长锥中结合的〔3H〕FK-506，并且与大脑皮层和一些外周组织的值进行比较。在未固定的切片上进行〔3H〕FK-506放射放射自显影，其中先进行解冻并且干燥，然后在缓冲液中予培养1小时，缓冲液由50mMHepes，2mg/ml牛血清白蛋白，5％乙醇和0.02％吐温20组成，PH7.4。然后在室温下在予培养缓冲液中，将切片暴露于1nM〔3H〕FK-506(86.5Ci/mMol；Dupont-NEN，Boston,MA)1小时。通过加入1μMFK-506来确定非特异结合。培养之后，在冰冷的予培养缓冲液中洗涤载玻片4×5分钟并且空气干燥。然后将放射标记的切片并置于氚敏感的膜上或用KodakNTB-2乳剂包裹的盖玻片上。表1与坐骨神经和生长锥结合的〔3H〕FK-506(A)与坐骨神经结合的〔3H〕FK-506组织Bmax(pmol/mg蛋白质)成年大鼠坐骨神经22.1大脑皮层38.0胸腺9.5脾8.0新生大鼠前脑25.5生长锥10.2(B)坐骨神经破碎后结合的〔3H〕FK-506蛋白质Bmax(fmol/5mm切片)Bmax(pmol/mg)未处理的31.8±2.121.2±1.4破碎7天136.5±15.7＊40.1±2.0＊按方法中描述的过程测定结合的〔3H〕FK-506。在表1A中，实验以小于10％的变化重复3次。表1B中的值以平均值±S.E.M(n＝3)来表示。＊P≤0.05独立方式的t测验。在所有检测的组织中，坐骨神经的结合水平最高，略高于大脑皮层且大约高于胸腺和脾的10倍，含有与淋巴细胞相联的FKBP。见表1A。FKBP在神经再生中所起作用的证据来自下列实验我们破碎成年大鼠的坐骨神经并在7天后测量接近于神经碎片的5mm片断结合的〔3H〕FK-506用盐酸二甲拉嗪(12mg/kg)、氯胺酮(30mg/kg)的混合物麻醉Sprague-Dawley大鼠(175-200g)。使用无菌技术，用宝石钳从茎突乳突孔出口向远端将面神经破碎成2×30sec2mm。使用相同的方法破碎大腿中部上的坐骨神经。接近的碎片的片断中结合的总值是对照值的四倍。尽管在接近的片断中蛋白总量有大量增加，但接近的片断中每mg蛋白结合的〔3H〕FK-506仅为两倍。面神经破碎该实例证明面神经受损促进FKBP和GAP-43的同时表达。在面神经核中，当面神经压碎后，GAP-43mRNA含量增加。利用杂交，我们来测定在面神经压碎后，FKBP，GAP-43和钙调磷酸酶mRNA的含量。通过贲门，将150-200ml冰冷却的、磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(0.1M，PH7.4)灌注到鼠体内。将组织切除并立即冷冻在异戊烷中(-80℃)。用低温冷冻机切片(18μm厚)并固定在涂布明胶的载玻片上解冻。利用末端用〔35S〕dATP标记的抗过敏低聚核苷酸探针，如上所述进行杂交。对于FKBP来说，利用三个独立的低聚核苷酸来与下列区域的克隆cDNA互补，所述cDNA为70-114，214-258，441-485，由Maki等人在(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，5440-5443，和Standaert等人在(1990)Nature346,671-674中公开并引入本文供参考。对于GAP-43来说，利用三个独立的抗过敏低聚核苷酸来与克隆cDNA，即核苷酸961-1008，1081-1128，1201-1248互补，所述cDNA由Rosenthal，A.等人在(1987)EMBOJ.6,3641-3646中公开并引入本文供参考。对于钙调磷酸酶Aα来说，利用抗过敏核苷酸来与核苷酸1363-1410和1711-1758互补，所述核苷酸由Ito等人在(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.163，1492-1497中公开并引入本文供参考，对于钙调磷酸酶Aβ来说，与核苷酸1339-1386和1569-1616互补，所述核苷酸由Kuno，T.等人在(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.165，1352-1358中公开并引入本文供参考。将切片解冻并放干，然后在4％新鲜解聚的多聚甲醛/PBS中固定5分钟。在PBS中冲洗两次后，将切片用0.25％乙酸酐/0.1M三乙醇胺和0.5％NaCl(PH8.0)乙酰化，然后在梯度酒精中脱水，在氯仿中脱脂5分钟，再水化到95％乙醇中并空气干燥。在37℃下，在含50％去离子甲酰胺，10％硫酸右旋糖酐，4×SSC，1×Denhardt’s溶液，20mM磷酸盐缓冲液，0.1mg/m1鲑精DNA，0.1mg/ml酵母菌转移RNA，10mM二硫苏糖醇，2.0％β巯基乙醇(BMD)，1.0mMEDTA和标记探针(2,000,000dpm/切片)的缓冲液中杂交过夜。杂交后，在室温下，将切片在1×SSC，1.0％BME中冲洗15分钟，然后在55℃下冲洗两次10分钟，空气干燥并分钟在膜上或浸泡在KodakNTB-2乳胶中。可见明显促进FKBP和GAP-43表达，同时钙调磷酸酶表达无明显变化。在脑神经压碎后24小时内，FKBP表达增加，在1-2周时，峰值是明显的，而在第3周时，mRNA浓度减小。在高度放大下测定的结果表明，对于FKBPmRNA来说，增加的银粒集中到神经元细胞体中(图2)。对解剖片断面核的Northern印迹分析证明FKBP特异的mRNA的浓度增加。此后，GAP-43mRNA非常类似于FKBP的情况。相反地，在检测的任何时间点都没有发现钙调磷酸酶的表达的改变。从解剖的面核中分离总的细胞RNA。10或20ug总的RNA样品经1％琼脂糖、2.0％甲醛凝胶电泳并且转移到10nM氢氧化钠的尼龙膜上。在由50％甲酰胺、2×SSPE、7％SDS、0.5％Blotto和100ug/ml鲑精子DNA组成的缓冲液中于42℃下，通过随机引导将cDNA探针与FKBP杂交，所述FKBP是用具有1×109cpm/ug特定活性的〔35〕dCTP标记的。在0.15×SSC、0.15％SDS中，将斑点于室温洗涤20分钟并于65℃洗涤2×15分钟，然后，暴露于胶片下48096小时。在未受损的一面，观测到与对照切片相比银粒有少量增加。这与对侧神经对轴突切除(axotomy)也有反应的发现是一致的。面神经破碎后，大鼠发展为面神经麻痹，很明显的是须运动缺乏，在3周时功能恢复，与神经再生完成是一致的。在我们的大鼠中，我们也观测了神经破碎后须运动丧失并在3周时恢复功能。因此，GAP-43和FKBP增加表达的时间进程和神经再生的过程相关。坐骨神经再生本实施例证明FKBP和GAP-43的改变与坐骨神经再生有关。坐骨神经损伤后，脊髓运动神经和脊根神经节的神经细胞中的GAP-43mRNA的浓度都有所增加。在遭受坐骨神经破碎的大鼠中，我们观测到L-4，5的运动神经和脊根神经节神经细胞中的FKAPmRNA水平显著增加(图3)，与GAP表达增加的报道是一致的(图4)。在高的放大率时，我们观测了位于神经细胞体的FKMBmRNA银粒(图3)。在选择性结合FKBP的条件下，我们通过〔3H〕FK-506结合的放射自显影检测了FKBP蛋白的水平(图4)。尽管坐骨神经破碎后在运动神经细胞中没有证明FKBP增加，但在脊根神经节的主要感觉神经中检测到FKBP增加。FKBP报道增加与再生选择性的关系进一步通过蓖麻毒蛋白实验来支持，当将蓖麻毒蛋白注射进入外周神经时，蓖麻毒蛋白被转运回细胞体中，使细胞体破坏而使神经不能再生。在其它按照Streit和Kretzbnerg所述方法进行的实验中已经使神经破碎的相同位置，我们注射0.5ug在0.5ulPBS和0.1％固绿中的蓖麻毒蛋白(RCA60，Sigma，st.Louis，MO)。Streit等，(1988)J.Comp.Neurol.268，248-263。在蓖麻毒蛋白处理后的2、4和7天，我们进行FKBPmRNA原位杂交定位研究(图5)。蓖麻毒蛋白处理后，没有观测到FKBPmRNA增加，在蓖麻毒蛋白处理和神经破碎之后均发生神经胶质增加。蓖麻毒蛋白处理之后FKBPmRNA未增加符合面核中FKBPmRNA的选择性定位。FKBP在坐骨神经中的运输本实施例证明FKBP在坐骨神经中快速转运。尽管FKBPmRNA的增加暗示蛋白质从细胞体快速转运到神经突起中，但坐骨神经破碎之后运动神经中的FKBP蛋白没有增加。这符合早期观测到的FKBPmRNA集中在含有低水平FKBP蛋白的小脑粒细胞中，同时FKBP蛋白水平高度集中在与来自粒细胞的平行纤维相关的小脑中的分子层中。为了检测FKBP转运的可能性，我们破碎了坐骨神经并且7天后结扎破碎近端的10-20mm处。结扎6小时后，我们检测跨越结扎区3mm片断中〔3H〕FK-506的结合(图6)。为了进行轴突转运实验，按照Tetzlaff等的方法使用经典的结扎技术。坐骨神经破碎后一周，将两个结扎点(510号结扎线)置于神经中距离最远端结扎处的大约10mm处和位于近端开始破碎部位10mm处。6小时后，从如图5所述的近端区、远端区和两个结扎点之间取出5-3mm的神经片断。通过在10体积50mMTris-HCl，pH7.4中匀浆来制备〔3H〕FK-506匀浆测定的神经片断。在4℃下将匀浆以15000×g的转速离心20分钟，并且收集上清液，然后使用Coomassie蓝色染料结合测定(Pearce)测定其总蛋白浓度。按(4)描述的方法测定含有2ug总溶解蛋白的等分试样中结合的〔3H〕FK-506，总溶解蛋白是在最终体积为0.4ml由50mMTris-HCl，PH7.4，2mg/ml牛血清白蛋白，250pM〔3H〕FK-506和不同浓度的未标记的FK506组成的测定缓冲液中。在25℃下培养60分钟之后，将0.35ml样品在0.8ml的LH-20交联的葡聚糖凝胶柱(PharmaciaLKB)中分层并用0.4ml测定缓冲液洗涤。收集洗脱液并在闪烁计数仪中计数。结果显示在图5中。〔3H〕FK-506结合水平在刚好距离破碎处20cm的近端结扎处的片断处最高，几乎为其它片断的四倍。基于A-D片断中〔3H〕FK-506的结合水平，我们计算了FKBP的顺行转运速度。每天240mm的速度基本上与GAP-43代表的神经蛋白最快转运速度的转运速度相同。为了显示神经破碎之后FKBP的积累，我们采用松的结扎来标记坐骨神经破碎的部位并且进行FKBPmRNA原位杂交以及〔3H〕FK-506结合的放射自显影(图7)。大多数FKBPmRNA和结合的〔3H〕FK-506立即积累在破碎神经的近端。这些水平显著高于对照未破碎的坐骨神经。在原位杂交检测中，高放大率时的放射自显影标本揭示银粒与神经纤维相关。也有银粒位于我们不能确定其特性的细胞中，因此它们可能是许旺细胞、巨噬细胞或成纤维细胞。PC12中的FKBP本实施例证明PC12细胞中含有FKBP，并且FKBP水平通过神经生长因子来增加。我们在基础条件下和在用神经生长因子(NGF)处理之后检测〔3H〕FK-506与的细胞结合来检查PC12细胞中存在的FKBP。由〔3H〕FK-506结合的Scatchard分析曲线上获得PC-12细胞中FKBP的浓度。从培养孔中剐下培养物并在10体积的50mMTris-HCl，pH7.4，1mMEDTA，100ug/ml苯甲基磺酰氟中匀浆化，在4℃下以40,000×g的转速离心20分钟。使用牛血清白蛋白作为标准，通过Coomassie蓝色染料结合测定来确定蛋白质。评价含有5ug溶解蛋白的在最终体积为0.4ml的由50mMTris-HCl，pH7.4，2mg/ml牛血清白蛋白和各种浓度的未标记的FK506组成的测定缓冲液中的结合的250pM〔3H〕二氢FK506(86.5Ci/mmol，Dupont/NEN)。在25℃下培养60分钟之后，将0.35ml样品在0.8ml的用测定缓冲液平衡的LH-20交联的葡聚糖凝胶柱(PharmaciaLKB)中分层。用0.4ml测定缓冲液进一步洗涤柱子，收集洗脱液与Formula963(Dupont/NEN)混合并在Beckman闪烁计数仪中计数。由结合的〔3H〕FK-506总量减去在1μm未标记的FK506存在下获得的结合量来确定特异结合情况。结果显示在图8中。〔3H〕FK-506与未处理的PC-12细胞匀浆物进行饱和地结合。在通常实验中，在1umFK506存在下非特异结合大约150cpm的同时，大约结合1000cpm。用1-2nMFK506产生50％的〔3H〕FK-506结合抑制作用，表明结合部位与可靠的FKBP-致。NFG处理之后使结合的〔3H〕FK-506明显增加。就10-15小时来说，有效的增加是明显的。20小时时结合增至3倍而在100小时时明显略有进一步的增加。PC12细胞中轴突延伸增加本实施例证明FK506和雷帕霉素使PC-12细胞的轴突延伸增加。将PC-12细胞在补充有5％热灭活的马血清和5％热灭活的胎牛血清的Dubecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2下维持。为了在NGF中分化，将细胞以1×105的量置于35mm培养孔中，该孔已用5ug/cm2大鼠尾胶原涂铺，并且允许在用补充有2％胎马血清、NGF和/或FK506或雷帕霉素的Dubecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)置换前附着。为了对轴突的生长进行定量，拍摄了随机照片(每孔3-4张)，并且记录生长超过5um的轴突突起。摄影者和细胞记录者不知道实验进行的条件。以每个有代表性的数据点重复两次来进行四个单独的实验。由每张照片大约进行100个细胞鉴定和记录轴突。因此，1200-1600个细胞的轴突被记录在每个数据点上。观察发现，NGF强烈刺激轴突生长，在lng/ml时具有最大刺激作用的一半，在大约50-100ng/ml产生最大的增强作用(图9、10)。FK506(100nM)通过增加NGF的敏感性而明显增加NGF的作用。因此，FK506使需要刺激最大生长的NGF浓度减少20-50倍。在不存在FK506时，于5ng/mlNGF产生一半的最大生长作用而在FK506存在时，于0.1ng/mlNGF产生一半的最大生长作用。在NGF最大浓度(10-100ng/ml)时，FK506不产生附加的轴突生长作用。FK506的神经营养作用是极强的。在低于最大浓度的NGF(1ng/ml)存在时，1nM的FK506与50ng/ml的NGF产生相同的生长作用(图11)。FK506在大约100pM时产生半数的最大作用。NGF不存在时，FK506不产生轴突生长作用(图10)。雷帕霉素是强的免疫抑制剂，不认为它通过钙调磷酸酶起作用但可影响其它磷酸化级联。雷帕霉素通过FKBP和钙调磷酸酶产生对FK506的强的阻断作用，这种作用可能是通过在FKBP水平作为FK506拮抗剂而产生的。雷帕霉素(1uM)不阻断FK506的神经营养作用。然而，雷帕霉素本身是神经营养性的，在1nM时产生巨大的轴突生长作用。雷帕霉素和FK506似乎通过不同的机制起作用。因此，雷帕霉素增加生长的数量及其长度，而FK506主要增加轴突的长度。而且，FK506和雷帕霉素作用似乎是加和的。脊根神经节本实施例证明FK506对感觉神经节是神经营养性的。我们检查FK506对来自大鼠16天胚胎脊根神经节主要培养物的作用。从怀孕的Sprague-Dawley大鼠取出E16时期的胚胎并且解剖脊根神经节。在胶原涂铺的35mm培养皿(Falcon)中，用N2培养基(1∶1混合的Dubcco′s改良的Eagle′s培养基和Ham’sF12培养基并且补充有黄体酮、硒、胰岛素、丁二胺、葡萄糖和青霉素-链霉素)于37℃、15％CO2环境中培养所有神经节外植块。用各种浓度的NGF和/或FK506或雷帕霉素或抗-NGF抗体处理感觉神经节。在相差下使用OlympusIMT-2倒置显微镜每2-3天观察神经节，并且测量产生的轴突长度。将各个神经节的轴突区域分为四个扇形，使用目镜测微尺以微米测量各个扇形中最长的轴突长度。这些测量的平均值作为神经节的轴突长度。为了进行〔3H〕FK-506放射自显影，将脊根神经节培养物在用胶原(5ug/cm2)涂铺的室载片(chamberslides)上进行生长。用冰冷却的4.0％在0.1M磷酸钠缓冲液(PH7.4)中的新鲜解聚的多聚甲醛将培养物在载片上固定1小时，然后用磷酸盐缓冲的盐水洗涤两次。通过在由50mMHepes、2mg/ml牛血清白蛋白、0.025吐温-20pH7.4组成的缓冲液中预培养载片来用〔3H〕FK-506标记固定的培养物。然后在含有1nM〔3H〕FK-506的相同测定缓冲液进行培养。通过加入1uM未标记的FK506来测定非特异的结合。然后在干燥前漂洗载片4×5分钟，并且与氚敏感的胶片并置10天。〔3H〕FK-506结合部位的放射自显影揭示在这些神经节中与银粒相关的FKBP的基本水平(图12)。在1uM的未标记的FK506中，放射自显影颗粒被消除，表明结合的特异性。如上所述，NGF(100ng/ml)显著增加神经节生长的数量和长度(图13)。FK506(1uM)单独产生类似的神经营养作用，同时1nMFK506就使生长产生明显的增加。起FK506拮抗剂作用的雷帕霉素(1uM)完全阻断FK506(1uM)的作用，因此FK506的作用对FKBP显示药物特异性特点。然而FK506在不加NGF时不刺激PC-12细胞中轴突的生长，在感觉神经节中，FK506单独是神经营养性的。神经节中的Schwann细胞可产生NGF，并且蛋白磷酸化作用调节Schwann细胞产生NGF。为了确定FK506的作用单独涉及内源的NGF的增强作用，我们检查了抗体对NGF的影响(图13)。抗-NGF显著减小FK506(1uM)的神经营养作用。抗NGF不以毒性放射起作用，因为我们在加入的NGF存在或不存在下将细胞暴露于抗-NGF未观察到形态学毒性。FK506刺激轴突生长作用极强。1pM时就产生易发现的增加。从0.1到10nM的FK506，其生长作用逐渐增大(数据未显示)，而达到最大生长作用需1uMFK506。NGF和FK506在所有浓度时的轴突生长过程都是类似的。1天时的某些生长是明显的，而在大约5-6天时生长开始达到平台。FK506神经营养作用涉及感觉神经节中的FKBP(FK506结合蛋白)，因为低浓度的雷帕霉素(一种FKBP水平的已知的FK506拮抗剂)逆转FK506的作用。雷帕霉素不阻断PC-12细胞中的FK506的作用可能反映雷帕霉素特异的刺激作用。雷帕霉素对PC-12细胞中的轴突生长的刺激作用的机制不是一下子就能够明白的。认为其免疫抑制作用涉及与FK506不同的机制。雷帕霉素可抑制磷酸化S6核糖体亚单位的S6激酶。雷帕霉素也抑制磷脂酰肌醇-3-激酶。蛋白激酶C(PKC)介导的磷酸化和神经再生时的轴突生长过程有关。其它证据暗示PKC在神经延伸过程中的抑制作用。GAP43是一种重要的在轴突中高度浓缩的钙调磷酸酶底物，并且通过FKBP调节其磷酸化。GAP43可能不直接参与轴突延伸，因为具有低浓度GAP43的PC-12细胞系显示正常的轴突生长。然而，GAP43及其磷酸化作用可能涉及靶轴突，因为当轴突到达其靶位时，磷酸化的GAP43的浓度增加。GAP43的磷酸化也可影响Ca2的流动，以调节轴突延伸。磷酸化的GAP43抑制磷脂酰肌醇二磷酸酯的形成，减小肌醇1，4，5-三磷酸酯的浓度并且与Ca2+释放有关。另外，GAP43的磷酸化减小与钙调蛋白的亲和力，而产生游离的能与Ca2+结合的钙调蛋白。除了影响Ca2+的钙调磷酸酶之外，免疫亲和蛋白可在位点上起作用，调节轴突生长。FKBP结合ryanodine受体，它是Ca2+释放通道。在骨骼肌肌浆网中，FK506从ryanodine受体分离FKBP来促进诱导Ca2+释放机制的Ca2+。另外，FK506在其它部位起作用，包括FKBP25甾体受体和其它未鉴定的靶位如与FKBP13有关的。因此，其它潜在的机制可在轴突延伸中起某些作用。免疫亲和蛋白的非免疫抑制的和免疫抑制的配体刺激PC-12细胞中轴突生长在本研究中，我们检查了免疫亲和蛋白对PC-12细胞和未受损小鸡感觉神经节中轴突延伸的多种配体的详细影响。我们报告非免疫抑制的和免疫抑制的配体在PC-12细胞和感觉神经节的轴突生长中具有极强的增加作用。在我们的较早研究中，我们发现免疫抑制剂通过增加神经生长因子(NGF)10倍来刺激PC-12轴突生长(Lyonset.al.，1994)。在不加NGF时，没有观察到神经营养作用。在本研究中，我们评价免疫抑制剂药物FK506和雷帕霉素在0.1-100ng/mlNGF存在下对PC-12轴突生长的影响。在不加NGF时，没有药物刺激轴突生长。单独加入0.1ng/mlNGF，在轴突延伸上产生小量增加，仅为50ng/ml明显最大作用的15％(图14)。雷帕霉素刺激轴突生长的程度比其它药物大，为0.1-0.5ng/mlNGF的刺激作用的3-4倍。由雷帕霉素产生的增加程度被高浓度的NGF减小并且在5-50ng/mlNGF时没有统计意义。FK506也是神经营养性的，其作用在较低的NGF时最显著并且在0.5ng/mlNGF时产生最大2.5倍的轴突生长增加作用。有三个与结构相关的免疫抑制剂药物的基本结构分类，环孢菌素A、FK506和雷帕霉素。尽管FK506和环孢菌素与独特的免疫亲和蛋白蛋白结合，但它们都通过抑制钙调磷酸酶来起免疫抑制剂的作用。雷帕霉素以非常高的亲和性与FKBP-12结合但药物-免疫亲和蛋白复合物不依次与钙调磷酸酶结合。然而，由雷帕霉素-FKBP-12复合物与近来鉴定并克隆的定名为RAFT-1(雷帕霉素和FK506靶向物)也被定名为FRAP的蛋白结合产生免疫抑制剂的作用(Sabatini和Snyder，1994；Brown等，1994；Chen等，1994)。因为雷帕霉素与FKBP-12强烈结合但不抑制钙调磷酸酶，所以可作为FK506的拮抗剂。雷帕霉素存在有非免疫抑制的衍生物。其中之一为WAY-124466，一种雷帕霉素的三烯衍生物，它以高的亲和性与FKBP-12结合并且抑制旋转异构酶活性，但没有免疫抑制剂的活性。环孢菌素A是大环十一肽。仅在6位丙氨酸上加入甲基产生一个不抑制钙调磷酸酶且缺乏免疫抑制作用的试剂，尽管它将亲环蛋白的旋转异构酶活性抑制到环孢子菌素A的类似程度(参考MeCsA)。为了确定免疫抑制剂活性是否需要神经营养作用，我们比较FK506、雷帕霉素和环孢子菌素A与非免疫抑制剂WAY-124466的神经营养作用，评价在PC-12细胞上以宽的浓度范围进行(图15、16)。所有研究都有0.5ng/ml的NGF。如上所述，FK506非常强烈地刺激轴突延伸，在0.5nM时具有最大刺激作用的一半并且在5-100nM时具有最大的作用。雷帕霉素是检查中最强的试剂，产生最大的轴突生长水平。在重复实验中，大约0.2-0.4nM产生50％的最大延伸而在大约10-100nM时产生最大的作用。雷帕霉素的最大轴突延伸作用类似于50ng/mlNGF的最大作用。WAY-124466也是神经营养性的，但作用是较弱的，比雷帕霉素产生低的最大作用。大约10nM的WAY-124466产生最大刺激一半的作用并且在100-1000nM时产生最大的作用。因此，雷帕霉素比WAY-124466强100倍，类似地，在与FKBP-12结合能力上强40倍(表II)。环孢菌素A在刺激轴突生长作用上基本上低于FK506或雷帕霉素，相应地，抑制旋转异构酶活性上也较低。在50nM时产生环孢菌素轴突生长最大刺激50％的作用而在100nM时产生最大的作用，并且在环孢菌素A浓度较高时轴突生长作用减小。环孢菌素A的最大刺激作用大约是50ng/mlNGF作用的60％。延伸过程的一般模式与各种免疫亲和蛋白配体和NGF是类似的。在产生50％最大作用的浓度NGF(1-5ng/ml)时，细胞至少延伸细胞体的40-50％，同时宽度生长15％，直到细胞体长度的3-5倍。模式与各种检查的药物非常类似。雷帕霉素和WAY-124466在每个细胞中比FK506产生更多的突起。环孢菌素A在突起的数量上处于中间水平。在小鸡脊根神经节中由免疫亲和蛋白的非免疫抑制的和免疫抑制的配体产生的神经延伸在我们的前面研究中，我们观察了在用1皮摩尔浓度的FK506观察的神经生长中具有明显增加的大鼠脊根神经节的外植块中的免疫抑制剂药物的神经营养作用(Lyons等，1994)。在大鼠神经节中，用FK506甚至在没有NGF的情况下观察神经营养作用。在本研究中，我们使用小鸡脊根神经节，在神经生长研究中小鸡脊根神经节更容易使用。在不加入NGF时，我们观察了免疫亲和蛋白配体药物的最小作用。小鸡细胞比PC-12细胞对NGF更敏感，因此我们使用0.1ng/mlNGF来产生最小轴突生长并且证明免疫亲和蛋白配体的神经营养作用(图17、18)。从十天怀孕的小鸡胚胎中解剖脊根神经节。所有神经节外植块都在涂铺有薄层Matrigel的12孔板上于37℃下含有5％CO2的环境中培养，所述板上具有补充2mM谷胺酰胺和10％胎牛血清并含有10uM胞嘧啶β-D阿拉伯呋喃糖苷(arabinofuranoside)(AraC)的LiebovitzL15加高葡萄糖培养基。24小时后，用各种浓度的神经生长因子、免疫亲和蛋白胚胎或者NGF和药物的组合物处理DRG。药物处理48小时之后，在相差或Hoffman调制相差ZeissAxiovert倒置显微镜观察神经节。进行外植块显微照相，定量轴突生长。将轴突比DRG直径长的记作阳性，记录每次实验条件下定量的轴突总数。每孔培养3-4个DRG，将每次处理重复两次。各种免疫亲和蛋白胚胎的刺激神经节神经生长的相对能力类似于它们在PC-12细胞上的能力。因此，雷帕霉素是最强试剂，EC50为1nM，比WAY-124466强10倍，而FK506的EC50为1-2nM。免疫亲和蛋白胚胎和NGF的最大有效浓度(100ng/ml)对突出的数量、它们的长度和分支上的最大增加是十分类似的。逐渐增加各种药物的浓度，观察到较大数量的轴突、延伸更长的分支和更长的各个突出。通过检查结合的3H-FK506对重组FKBP的抑制作用，我们评价药物与FKBP-12结合的能力。在药物与FKBP-12的亲和性及其刺激轴突生长的能力和抑制旋转异构酶活性之间存在有惊人的平行。神经生长刺激作用显然与钙调磷酸酶的抑制作用无关。钙调磷酸酶抑制作用与免疫抑制剂作用非常吻合，WAY-124466不是免疫抑制的，并且不抑制钙调磷酸酶。雷帕霉素是强的免疫抑制剂，但雷帕霉素-FKBP-12复合物与RAFT-1结合来启动免疫抑制过程(Sabatini和Snyder，1994；Snyder和Sabatini，1995)。结果显示在表2中。表2免疫亲和蛋白配体神经营养作用与旋转异构酶，而不是钙调磷酸酶的抑制作用平行药物〔3H〕-钙调磷酸旋转异构轴突生长FK506-酶酶(K1)(ED50)FKBP12抑制作用(IC50)FK5060.6nM是0.4nM0.5nM雷帕霉素0.5nM非0.2nM0.5nMWAY-12446610.0nM非12.0nM10nM环孢菌素(C、A)无是20nM50nM我们比较了非免疫抑制的免疫亲和蛋白配体促进小鸡脊根神经节外植块培养物轴突生长的能力(表3)。这些化合物均不能抑制钙调磷酸酶，但与免疫亲和蛋白FKBP-12相互作用并以表3中所列的各种抑制常数抑制其旋转异构酶活性。这些化合物促进DRG轴突生长的能力与它们抑制FKBP-12的旋转异构酶活性的能力之间有非常好的相关性。表3免疫亲和蛋白配体神经营养作用与旋转异构酶，而不是钙调磷酸酶的抑制作用平行药物〔3H〕-FK506-钙调磷酸酶旋转异构轴突生长FKBP12(IC50)抑制作用酶(K1)(ED50)实施例128uM非250nM300nM实施例134uM非25nM80nM药物在免疫亲和蛋白结合、抑制其旋转异构酶活性和刺激轴突生长能力之间的非常密切的关系暗示抑制旋转异构酶活性引起药物的神经营养作用。药物刺激轴突生长和与免疫亲和蛋白结合的非常高的能力使得几乎不可能由任何其它靶物引起亲神经营养作用。可以想象免疫亲和蛋白而不是旋转异构酶的生物活性可受药物介导神经营养作用的影响。然而，仍没有报道这种活性。因为药物的非常强的能力和旋转异构酶抑制作用和神经营养作用的密切关系，我们推断旋转异构酶抑制作用似乎涉及神经营养作用。已经报告许多蛋白作为免疫亲和蛋白包括胶原(Steinmann等，1991)和转铁蛋白(Lodish和King，1991)的旋转异构酶活性的底物。最近，已经报道ryanodine受体和IP-3受体(重要的细胞内钙通道)的高纯度制剂以FKBP-12复合物形式存在。FKBP-12从这些复合物中分离引起钙通道“渗漏”(Cameron等，1995)，在轴突延伸中涉及钙流，因此在药物的神经营养作用中可涉及IP-3受体和ryanodine受体。因为，药物与IP-3受体或Ryanodine受体的FKBP-12上的相同部位结合，药物必然置换FKBP-12通道。已经报道亲环蛋白中的这些钙通道之间没有相互作用，因此这些模型不能解释环孢菌素A的神经营养作用。这里研究的药物的神经营养作用是在极低的浓度下产生的，表明那些神经营养蛋白如大脑来源的生长因子、神经营养蛋白-3和神经营养生长因子的能力是相似的。下面实施例详细说明本申请的优选实施方案并且不对本发明构成限制。所有聚合物分子重量是平均分子重量。所有百分含量都是最终释放体系或制剂的重量的百分比，除非另有表示，并且总量等于100％(重量比)。可用于本发明目的的2-2-哌啶酸衍生物化合物的实施例包括实施例1该2-哌啶酸衍生的化合物实例由Ocain等人在生物化学与生物物理研究通讯，Vol.192，No.3，1993中公开。在Wyeth-Ayerst中，Dr.PhilHughes等人通过将4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮与雷帕霉素反应合成该化合物。实施例2该2-哌啶酸衍生的化合物由Chakraborty等人在化学和生物学，1995.3，2157-161中公开。实施例3-5该2-哌啶酸衍生的化合物实例由Ikeda等人在美国化学联合会杂志1994，116，4143-4144中公开，并且引入本文供参考。实施例6-9该2-哌啶酸衍生的化合物由Wang等人在生物有机和医学化学快报，Vol.4，No.8，pp.1161-1166，1994中公开，尤其是化合物2a-2d，并且引入本文供参考。实施例10该2-哌啶酸衍生的化合物10实例由Birkenshaw等人在生物有机和医学化学快报，Vol.4，No.21，pp.2507-2510，1994中公开并且引入本文供参考。实施例11-21该2-哌啶酸的衍生化合物的实例由Holt等在美国化学联合会杂志1993，115，9925-9938，特别是化合物4-14公开，并在此引入作为参考。实施例22-30该2-哌啶酸衍生化合物的实例由Caffery等在生物有机和医学化学快报，Vol.4，No.21，pp.2507-2510，1994公开并在此引入作为参考。实施例31该2-哌啶酸衍生的实例化合物31，由Teahue等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.3，No.10，pp.1947-1950，1993中公开并且引入本文供参考。实施例32-34该2-哌啶酸衍生的化合物实例由Yamashita等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.4，No.2，pp.325-328，1994中公开，尤其是化合物11，12，和19，并且引入本文供参考。实施例35-55该2-哌啶酸衍生的化合物实例由Holt等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.4，No.2，pp.315-320，1994中公开，尤其是化合物3-21，和23-24，并且引入本文供参考。实施例56-68该2-哌啶酸衍生的化合物实例由Holt等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.3，No.10，pp.1977-1980，1993中公开，尤其是化合物3-15，并且引入本文供参考。实施例69-83本发明化合物实例由Hauske等人在医学化学杂志1992，35，4284-4296中公开，尤其是化合物6，9-10，21-24，26，28，31-32，和52-55，并且引入本文供参考。实施例84该2-哌啶酸衍生的化合物实例由Teague等人在Bioorganic&Med.Chem.Letters，Vol.4，No.13，pp.1581-1584，1994中公开并且引入本文供参考。实施例85-88该2-哌啶酸衍生的化合物实例由Stocks等人在Bioorganic&Med.Chem.Letters，Vol.4，No.12，pp.1457-1460，1994中公开，尤其是化合物2，15-17，并且引入本文供参考。实施例90-111该2-哌啶酸衍生的其它化合物实例在方案10，表1-5中描述。方案01</tables>方案2实施例/化合物编号R2方案3实施例/化合物号结构式方案4表1表2表3</tables>方案5实施例/化合物编号结构式32R＝苯基33R＝N(丙烯基)2方案6表1实施例/化合物编号结构式表2实施例/化合物编号结构式方案7表156X＝OH57X＝OMe58X＝OiPr59X＝OBn60X＝OCHMePh61X＝OCH2CHCHPh62X＝OCH2CH2CH2(3，4-OMe2)Ph63X＝NHBn64X＝NHCH2CH2CH2Ph表265R＝Me66R＝Bn表3方案8表1实施例/化合物编号结构式R2＝Phe-o-叔丁基70式R2＝Phe-o-叔丁基表271R1＝m-OCH3Ph；R31＝Val-o-叔丁基72R1＝m-OCH3Ph；R31＝Leu-o-叔丁基73R1＝m-OCH3Ph；R31＝Ileu-o-叔丁基74R1＝m-OCH3Ph；R31＝六氢-Phe-o-叔丁基75R1＝m-OCH3Ph；R31＝烯丙基丙氨酸-o-叔丁76基R1＝B-萘基；R31＝Val-o-叔丁基表3实施例/化合物编号结构式77R1＝CH2(CO)-m-OCH3PHR41＝CH2PhR51＝OCH378R1＝CH2(CO)-3-萘基R41＝CH2PhR51＝OCH3表4实施例/化合物编号结构式79R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHR41＝HY＝OC(o)Ph80R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHR42＝HY＝OC(o)CF381R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHIR41＝-Y＝-82R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHR41＝HY＝OCH2CH＝CH283R1＝m-OCH3PhX＝C＝OR41＝HY＝Ph方案9表185表286R1＝H，R2＝OMeR3＝CH2OMe87R1＝H，R2＝R3＝H88R1＝Me，R2＝R3＝H方案10表1实施例R＝903，4-二氯913，4，5-三甲氧基92H933-(2，5-二甲氧基)-苯基丙基943-(3，4-亚甲基-二氧)苯基丙基表2实施例R＝954-(p-甲氧基)-丁基963-苯基丙基973-(3-吡啶基)-丙基表3实施例R＝983-吡啶基丙基991，7-二苯基-4-庚基1004-(4-甲氧基)丁基1011-苯基-6-(4-甲氧基苯基)-4-己基1023-(2，5-二甲氧基)苯基-丙基1033-(3，4-亚甲基二氧)-苯基丙基1041，5-二苯基戊基表4实施例R＝1054-(4-甲氧基)丁基1063-环己基丙基1073-苯基丙基表5实施例R＝1083-环己基丙基1093-苯基丙基1104-(4-甲氧基)丁基1111，7-二苯基-4-庚基旋转异构酶抑制剂的神经营养作用如上所述，表I中列出了大量权利要求实施例及其在所培养的感觉神经元中产生营养作用的功效。图19和20表明实施例111和实施例17在脊根神经节中促进轴突长出的显微照片。表I试验实施例的体外功效实施例旋转异构酶抑制作用神经营养ED50Ki，nM鸡DRGs，nM6140259130.0301117011225030013258015170.3019120.01736＞10,000＞10,000411300500050＞10,000＞10,0009018002500912820092399093753594708951655-109674010-20977251509813075993051006043101150.17102122.5103120310420.016105103610676011072100.82108320.2910920.08110240.00211150.08实施例化合物在体内神经再生模型中的活性坐骨神经轴突切除(Axotomy)将6周龄的雄性Sprague-Dawiey大鼠麻醉，并在髋部，用镊子将坐骨神经暴露并弄碎。在损伤前，皮下给予试验化合物或载体并且每天一次，共给予18天。用Holmes银染料将坐骨神经部分染色以便确定轴突的数目，并用Luxol坚牢蓝来确定髓鞘形成的含量。损伤18天后，在用载体治疗的动物中，轴突数目(与未受损对照组相比减少50％)和髓鞘形成含量(与未受损对照组相比减少90％)明显减少。在损伤前，给予实施例12(30mg/kg皮下)，或实施例13(mg/kg皮下)并在受损后每天一次，共给予18天，与载体治疗的动物相比，轴突数目(与未受损的对照组相比，分别减少25％和5％)和髓鞘形成含量(与对照组相比，分别减少65％和50％)明显再生。实施例12和实施例13的显著功效与其抑制旋转异构酶活性和在鸡DRGs中刺激轴突长出的活性是一致的，并且其体内功效与其相应的体外功效是相同的(表I)。这些结果显示于图21。“Sham”指接受载体但未受损的对照组动物；“Vehicle”指受损并且只接受载体(即，没有药物)的动物。对于假性治疗的动物，实施例12和实施例13惊人地相似，这证明了这些化合物在体内较强的神经再生作用。这些数据显示于表II。表II治疗轴突数目髓鞘质含量(％对照)假性治疗100100损伤5010+载体(皮下)+实施例127535(30mg/kg皮下)+实施例1310050(30mg/kg皮下)显然，本发明可以在很多方面修改。这些修改并不违背本发明精神和范围并且所有这些修改包括在下列权利要求范围内。权利要求1.治疗动物神经病学疾病的方法，它包括给予动物有效量的、对FKBP-型免疫亲和蛋白类具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来刺激受损外周神经生长或促进神经元再生，其中，FKBP-型免疫亲和蛋白显示旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。2.权利要求1的方法，其中，所述神经病学疾病选自由物理性损伤或疾病状态引起的外周神经病，对脑的物理性损伤，对脊髓的物理性损伤，由脑损伤引起的中风，与神经退变有关的神经病学疾病。3.权利要求2的方法，其中，所述神经病学疾病选自早老性痴呆，帕金森病，和肌萎缩性侧索硬化。4.权利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生的化合物为免疫抑制性的或非免疫抑制性的。5.权利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Way-124，666。6.权利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为雷帕霉素。7.权利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为FK506。8.权利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Rap-Pa。9.权利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为SLB-506。10.权利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物选自化合物3-84，和86-88。11.治疗动物神经病学疾病的方法，它包括给予动物有效量的、对FKBP-型免疫亲和蛋白具有亲和力的2-哌啶酸衍生物和有效量的神经营养因子，所述神经营养因子选自神经营养生长因子，脑来源的生长因子，神经胶质生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3，来刺激受损外周神经的生长或促进神经元再生，其中，FKBP-型免疫亲和蛋白显示旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。12.权利要求11的方法，其中，所述神经病学疾病选自由物理性损伤或疾病状态引起的外周神经病，对脑的物理性损伤，对脊髓的物理性损伤，由脑损伤引起的中风，与神经退变有关的神经病学疾病。13.权利要求12的方法，其中所述神经病学疾病选自早老性痴呆，帕金森病，和肌萎缩性侧索硬化。14.权利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生的化合物为免疫抑制性的或非免疫抑制性的。15.权利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Way-124,666。16.权利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为雷帕霉素。17.权利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为FK506。18.权利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Rap-Pa。19.权利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为SLB-506。20.权利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物选自化合物3-84，和86-88。21.刺激受损外周神经生长的方法，它包括给予受损外周神经有效量的、对FKBP-型免疫亲和蛋白类具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来刺激或促进受损外周神经生长，其中，FKBP-型免疫亲和蛋白类显示旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。22.权利要求21的方法，它进一步包括给予神经营养因子来刺激或促进受损外周神经生长，所述神经营养因子选自神经营养生长因子，脑来源的生长因子，神经胶质生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3。23.权利要求23的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物为免疫抑制性的或非免疫抑制性的。24.权利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Way-124,666。25.权利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为雷帕霉素。26.权利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为FK506。27.权利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Rap-Pa。28.权利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为SLB-506。29.权利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物选自化合物3-84，和86-88。30.刺激受损外周神经生长的方法，它包括给予受损外周神经有效量的、对FKBP-型免疫亲和蛋白类具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来刺激受损外周神经生长，其中，FKBP-型免疫亲和蛋白显示旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。31.权利要求30的方法，它进一步包括给予有效量的神经营养因子来刺激受损外周神经生长，所述神经营养因子选自神经营养生长因子，脑生长因子，神经胶质生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3。32.权利要求30的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物为免疫抑制性的或非免疫抑制性的。33.权利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Way-124,666。34.权利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为雷帕霉素。35.权利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为FK506。36.权利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Rap-Pa。37.权利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为SLB-506。38.权利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物选自化合物3-84，和86-88。39.促进动物神经元再生和生长的方法，它包括给予动物有效量的、对FKBP-型免疫亲和蛋白类具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来促进神经元再生，其中，FKBP-型免疫亲和蛋白显示旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。40.权利要求39的方法，它进一步包括给予有效量的神经营养因子来促进神经元再生，所述神经营养因子选自神经营养生长因子，脑生长因子，神经胶质生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3。41.权利要求39的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物为免疫抑制性的或非免疫抑制性的。42.权利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Way-124,666。43.权利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为雷帕霉素。44.权利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为FK506。45.权利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Rap-Pa。46.权利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为SLB-506。47.权利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物选自化合物3-84，和86-88。48.抑制动物神经退变的方法，它包括给予动物有效量的、对FKBP-型免疫亲和蛋白类具有亲和力的2-哌啶酸衍生物来抑制神经退变，其中，FKBP-型免疫亲和蛋白显示旋转异构酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫亲和蛋白的旋转异构酶活性。49.权利要求48的方法，它进一步包括给予有效量的神经营养因子来抑制神经退变，所述神经营养因子选自神经营养生长因子，脑生长因子，神经胶质生长因子，睫神经营养因子和神经营养蛋白-3。50.权利要求48的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物为免疫抑制性的或非免疫抑制性的。51.权利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Way-124,666。52.权利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为雷帕霉素。53.权利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为FK506。54.权利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为Rap-Pa。55.权利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物为SLB-506。56.权利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物选自化合物3-84，和86-88。全文摘要本发明涉及利用2－哌啶酸衍生的、对FKBP型免疫亲和蛋白具有亲和力的神经营养性化合物作为与免疫亲和蛋白蛋白质相关的酶活性抑制剂,特别是作为肽酰—脯氨酰异构酶或旋转异构酶酶活性抑制剂来刺激或促进神经生长或再生的方法。文档编号A61K31/50GK1187127SQ9619455公开日1998年7月8日申请日期1996年6月5日优先权日1996年6月5日发明者J·P·斯特内尔,S·斯尼德尔,G·S·哈米尔顿申请人:吉尔福特药品有限公司,约翰斯霍普金斯大学医学院