增强生物分子的细胞摄取的配体的制作方法

专利名称：增强生物分子的细胞摄取的配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于以组织特异性方式经配体直接的、受体介导的胞吞途径将抗生物降解的均相寡核苷缀合物引入细胞中的释放系统。
用于药物设计的反义(反密码)或反基因(antigene)策略是基于通过合成寡脱氧核苷酸(oligo dN)和它们的类似物(1)分别结合和掩蔽靶mPNA或基团组DNA而使蛋白质合成序列特异性抑制。在这种策略中暗含着oligo-dN穿过细胞膜的能力，由此得以出入含有它们的预定目标的细胞区室，并以足够的量这样做来结合出现的那些目标。对于作为反义、非离子型寡脱氧核苷膦酸甲酯(oligo-MP)应用的许多oligo-dN类似物已进行了广泛研究(2)。oligo-MP是完全抗核酸酶降解的(3)，并且是已证明具有对抗Ⅰ型单纯疱疹病毒(4)，水泡性口炎病毒(5)和人类免疫缺陷病毒(6)的体外活性的有效的反义试剂，而且还能抑制ras p21的表达(7)。不过，oligo-MP若要显示出反义活性，它们必须以不超过100μm的浓度存在于胞外介质中(4-7)。为了治疗目的要达到并维持这些浓度存在许多困难，包括费用，由于oligo-MP的非特异性结合而存在的潜在副作用和免疫原性。这些困难可用两种方式来克服1)增强oligo-MP穿过靶细胞系膜的转运以得到局部高浓度的oligo-MP。2)仅向靶细胞系特异性释放，从而避免对其他组织的毒副作用。这两种策略可大大降低产生反义作用所需的oligo-MP的浓度并因组织特异性而避免了毒副作用。
通过将外源DNA的摄取与受体介导的胞吞作用偶联可大大增强外源DNA向胞内介质的释放。Wu和Wu(8)所做的先行工作显示静电络合到与脱唾液酸血清类粘蛋白相联的聚-L-赖氨酸上的外源基因(8a-c)或oligo-dN(8d)是通过与脱唾液酸糖蛋白受体的直接相互作用而有效并特异性地吸收到人肝细胞癌(Hep G2)细胞中的。从这些初始研究开始已公开的受体介导的DNA释放的其他例子包括四触角半乳糖新糖肽·聚-L-赖氨酸缀合物(9)，三半乳糖基化双吖啶缀合物(10)，叶酸缀合物(11)，抗体缀合物(12)，运铁蛋白缀合物(13)和经二硫键连接到反义oligo-dN上的6-磷酸甘露糖基化蛋白质(14)。最近，与本身连接到聚-L-赖氨酸上的人血清白蛋白共轭的三触角N-乙酰半乳糖胺新糖肽YEE(ah-GalNAc)3(15)显示出可有效地将DNA释放到Hep G2细胞中(16)。尽管经过了改进，但这些释放方法仍有一些缺点(1)由于起始物质(例如最经常是聚-L-赖氨酸或牛血清白蛋白)的结构不均一性和所用的合成策略，由这些物质产生的复合糖在功能上是相当的，但结构是不均一的，因此它们的物理和生物性能难以完全确定；(2)用于在体外释放DNA和oligo-dN的这种浓度的聚阳离子化合物(例如聚-L-赖氨酸和阳离子脂质)是有毒的，并推测在体内也是这样；(3)在每种条件下都必须用实验测定oligo-dN或DNA与阳离子缀合物的比例。
已描述了大量用于oligo-dN释放的合成产物，它们是缀合物的不均一混合物。例如，Bonfils等人描述了6-磷酸甘露糖基化蛋白质和寡核苷之间的缀合物的形成，因为蛋白质的修饰和二硫键的形成不是区域化学控制的，所以得到了功能相关但结构不同分子的混合物。
有一些研究已描述了含有可生物降解的磷酸二酯核苷酸间连键的寡脱氧核苷酸或DNA的胞内释放。由于这一点，它们在细胞内的半衰期相当短，因此效能降低。例如，所有的磷酸二酯16-基体，d(T)16，在细胞中仅两个小时后就大范围减少。反义研究界已普遍认识到oligo-dN和DNA的这一缺点。本发明可利用本文中描述的释放策略使生物学稳定的oligo-MP，其他寡脱氧核苷酸类似物(见表1)和其他生物稳定的药物前体释放。因此，由于其生物稳定性，可进一步降低反义试剂的浓度。
Merwin等人描述了利用新糖肽YEE(ah-GalNAc)3来合成缀合物。它们的释放系统是不均一的并含有聚-L-赖氨酸，用来将DNA静电结合到缀合物上。这种释放策略的缺点是它的结构不均一性；由于其寡阳离子电荷而存在的潜在毒性；和配制困难，因为要得到最佳释放则需要用实验测定阳离子载体与oligo-dN或DNA的比例。本发明的释放策略排除了所有这些困难，因为它是化学确定的且结构均一，它是用来释放生物学稳定的反义试剂和其他生物稳定的药物前体。
因此，迄今可得到的用于将oligo dN和oligo dN类似物释放到它们的胞内目标的缀合物有不均一性和/或可迅速生物降解的缺点，结果是最有效的化合物可能以稀释形式与可能是无效和/或有害的外来化合物一起释放到目标。
本发明的一个目的是提供均一的寡脱氧核苷膦酸甲酯缀合物，它含有不能生物降解的膦酸甲酯核苷酸间连键。它能将生物学稳定的、非离子型寡脱氧核苷类似物释放到细胞中。
本发明的另一个目的是提供合成寡脱氧核苷嵌合体的缀合物的方法，该缀合物含有所有2′-O-甲基核糖核苷和在膦酸甲酯与磷酸二酯或任何其他生物稳定的寡聚体之间变化的核苷酸间连键。这样的生物稳定的寡聚体包括但不限于寡脱氧核苷酸类似物，它含有所有2′-脱氧核糖核苷和在硫代磷酸酯与膦酸甲酯之间交替的核苷酸间连键；所有2′-脱氧核糖核苷和硫代磷酸酯核苷酸间连键；所有2′-O-甲基核糖和硫代磷酸酯核苷酸间连键。
本发明的另一个目的是提供生物学上不能降解的(或抗水解酶的)缀合物，它包含可有效地穿过细胞膜并可以与细胞质接触的oligo dN和/或oligo dN类似物。本文中所用的术语“有效地”是指例如，如果缀合物存在于胞外介质中，然后在37℃下培养24小时后，则胞内浓度将至少为胞外浓度的约3倍，优选约10倍。
本发明的另一个目的是提供结构确定的和化学均一的“释放系统”，它由配体-接头-药物前体组成，用于在靶细胞/组织中不能生物降解的药物的组织/细胞类型特异性的、配体直接的、受体介导的胞吞释放。配体和药物前体之间的键是共价的，是通过能与配体和药物前体形成共价键的交联试剂形成的。能与存在于配体和药物前体上的各种官能团起反应的多种交联试剂是可得到的，因此，可构造许多化学相异键。例如，配体YEE(ah-GalNAc)3(参见1；

图1)的氨基末端上含有游离氨基。它将区域特定地与异双功能交联试剂SMCC(表4，第3项)反应形成酰胺键。如果药物前体被化学修饰成含有游离的硫氢基(例如参见表2第9-14项)，则它将与SMCC化学结合形成硫醚键。在这个例子中，配体和药物前体之间形成的键可概括为酰胺/硫醚。显然，配体、交联试剂与药物前体(见表1-4和图1)以所有可能的组合方式结合可得到数百种结构。因此其他键包括但不限于酰胺/酰胺，硫醚/酰胺，二硫化物/酰胺，酰胺/硫醚，酰胺/二硫化物。这些键可进一步分为生物学稳定的(硫醚，胺)，稍微生物学稳定的(酰胺)，和生物学不稳定的(二硫化物)。因此，该释放系统可进行结构修饰以在胞外和胞内介质中遇到的各种化学环境中起作用。用于这种释放系统的配体包括但不限于图1中显示的那些。本文中所用的术语“附着基团”指的是这些配体。这些配体由合成的、化学确定的、结构均一的用任何数量的糖残基糖基化的寡肽支架组成，糖残基包括但不限于葡萄糖；N-乙酰葡糖胺；半乳糖；N-乙酰半乳糖胺；甘露糖；和岩藻糖。本文中使用的术语“新糖肽”是指这些以及类似的结构。另外，这些寡肽提供了与叶酸构造多价配体的构架。
本文中所用的术语“药物前体”是指随着特异性化学键的水解或生物还原作用而从缀合物释放成为活性或比作为缀合物的一部分时更具活性的化合物。
本文中所用的术语“化学均一”是指至少95％的释放系统，最优选99％，在组成和连通性方面是单一种类的。化学均一性是用聚丙烯酰胺凝胶电泳，反相高压液相色谱，核磁共振，质谱和化学分析法测定的。短语“化学确定的和结构均一的”可与“化学均一的”交换使用。
本文中所用的术语“基因特异性”是指药物前体是具有通过共轭与靶组织或细胞型中发现的部分基因或部分mRNA分子互补的序列的寡核苷(特别是寡脱氧核苷膦酸甲酯或其类似物)。基因特异性药物前体和靶mRNA之间的序列特异性双螺旋的形成将抑制mRNA的表达。
附图简述图1．化学均一缀合物的附着基团。n值为0-10(包括端点)。
图2．新糖肽YEE(ah-GalNAc)3(5)和oligo-MP UmpT7(6)，以及5′-亚乙二胺覆盖的UmpT7(11)的结构。
图3．合成[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-p UmpT7(10)的反应路线。
图4．缀合物10合成中的中间体的PAGE分析(15％聚丙烯酰胺，4V/cm,2h)。泳道1,[5′-32P]-标记的6(带A)。泳道2,[5′-32P]-胱胺加合物(带B)和相应的胸苷-EDAC加合物(带C)。泳道3,[5′-32P]-硫醇5(带D)和相应的胸苷-EDAC加合物(带E)。泳道4,[5′-32P]-缀合物10(带F)和相应的胸苷-EDAC加合物(带G)。
图5．Hep G2细胞摄取1μm缀合物10的时间过程，单独(开放的圆)和在100当量游离5存在下(封闭的圆)，和摄取oligo-MP11的时间过程，单独(开放的三角)和在10当量游离5存在下(封闭的三角)。细胞在37℃下培养0,1和2小时，并如实验部分中所述收集样品。每个数据点代表三次试验的均值±标准误差。
图6．24小时内Hep G2细胞摄取缀合物10的情况。细胞在37℃培养并如实验部分中所述收集这些细胞。每个数据点代表三次试验的均值±标准误差。
图7．Hep G2,HL-60和HT1080细胞对缀合物10的组织特异性摄取。收集细胞并在3h和24h时测定每个细胞系的[32P]的量。试验重复三次，数据表示为均值±标准误差。
图8．缀合物10和缀合物12的组织分布缀合物12是用N-乙酰葡糖胺糖苷酶去除缀合物10的末端GalNAc残基从而产生的。图8A缀合物10的每克组织的百分初始剂量与注射后时间的关系图。图8B缀合物12的每克组织的百分初始剂量与注射后时间的关系图。
图9．示踪物3′缀合物的结构。
图10．用5′-硫醇修饰剂自动合成的反应路线。
图11．合成1c的反应路线。
图12A10的结构。该缀合物是用位于oligoMP部分的5′-OH上的放射性磷酸酯合成的。箭头指示32P标记的位置。
图12B简写形式的10的结构。结构12和3-6是用PAGE分析确定的代谢物的推荐结构。结构12和3-6是分别用N-乙酰葡糖胺，胰凝乳蛋白酶或0.1 HCl处理10得到的。
图13．10在Hep G2细胞中的代谢物的放射自显影分析。泳道1,1；泳道2，用N-乙酰葡糖胺糖苷酶处理的1；泳道3，用胰凝乳蛋白酶处理的1；泳道4-8,Hep G2细胞用1分别培养2,4,8,16和24小时后的提取物。
图14．10在小鼠肝中的代谢物的放射自显影分析。泳道1,1；泳道2，用N-乙酰葡糖胺糖苷酶处理的1；泳道3，用胰凝乳蛋白酶处理的1；泳道4，用0.1N HCl处理的1；泳道5-9，注射后2小时，1小时和15分钟时的肝匀浆提取物。注意泳道5和6以及7和8是同样的样品。
图15．10在小鼠尿中的代谢物的放射自显影分析。泳道1,1；泳道2，用N-乙酰葡糖胺糖苷酶处理的1；泳道3，用胰凝乳蛋白酶处理的1；泳道4，用0.1N HCl处理的1；泳道5-8，注射后2小时，1小时和15分钟时的尿提取物。注意泳道5和6是同样的样品。
简写为了方便起见，使用下列简写AET,2-氨基巯基乙醇(氨基乙硫醇)；ATP，腺苷三磷酸；BAP，细菌碱性磷酸酶；CPG，可控孔度玻璃载体；DIPEA，二异丙基乙胺；D-MEM,Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基；DMSO，二甲基亚砜；D-PBS,Dulbecco′s磷酸缓冲盐溶液；DTT，二硫苏糖醇；EDAC,1-乙基-3-[3(二甲氨基)丙基]碳化二亚胺；EDTA，乙二胺四乙酸盐；FCS，胎牛血清；GalNAc,N-乙酰半乳糖胺；MEM，带有Earle′s盐的最低必需培养基；SMCC,N-羟基琥珀酰亚胺基4-(N-甲基马来酰亚胺基)环己基-1羧酸酯；Tris，三(羟甲基)胺。[5′-32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)的合成。材料。
甲基亚膦酰胺合成子是JBL ScieHtific,Inc.慷慨赠送的，并且是商业上可获得的。它们可容易地由本领域普通专业人员按照常规方法从核苷合成。用于UmpT7的自动合成的所有其他试剂是从Glen Research,Inc.购得的。HiTrap Q阴离子交换柱从Pharmacia LKB Biotechnology购得。反相高效液相色谱利用从Rainin Instrument Co.,Inc.购得的Microsorb C-18柱进行。盐酸胱胺，1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳化二亚胺(EDAC),1-甲基咪唑，和无水二甲基亚砜(DMSO)，二硫苏糖醇(DTT)，和Ellmen试剂从Aldrich购得，不必进一步纯化即可使用。二异丙基乙胺(DIPEA)从Aldrich购得，使用前从氢化钙中再蒸馏。N-羟基琥珀酰亚胺基-4-(N-甲基马来酰亚胺基)环己基羧酸酯(SMCC)从Pierce购得。Waters SepPak C-18柱体从Millipore Corp.购得。YEE(ah-GalNAc)3是按照Lee等人(15a)的方法合成的，并以水溶液形式储存于4℃下。腺苷三磷酸(ATP)和[γ-32P]-ATP是分别从P-L Biochemicals,Inc.和Amersham购得的。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是用含有15％聚丙烯酰胺，0.089M Tris,0.089M硼酸，0.2mM EDTA(1×TBE)和7M脲的20cm×20cm×0.75mm凝胶进行的。样品溶于含有90％甲酰胺，10％1×TBE,0.2％溴酚蓝和0.2％二甲苯蓝的加样缓冲液中。实施例1UmpT7(6)的合成。利用5′-O-(二甲氧基三苯甲游基)-3′-O-甲基-N,N-二异丙基亚膦酰胺胸苷在可控孔度玻璃载体(CPG)上合成寡脱氧核苷膦酸甲酯并按照常规方法脱保护(17)。加入到寡聚体的5′末端的终合成子是5′-O-(二甲氧基三苯甲游基)-2′-O-甲基-3′-[(2-氰乙基)-N,N-二异丙基]亚磷酰胺尿苷。最终偶联步骤确定了末端5′核苷和相邻核苷间的磷酸二酯键的位置，这使得5′末端羟基被噬菌体T4多核苷酸激酶磷酸化并因2′-O-甲基的存在而确保了磷酸二酯的较好的稳定性。粗8-基体通过HiTrap Q阴离子交换色谱(用含有＜25％乙腈的缓冲液填充；用0.1M磷酸钠洗脱，pH5.8)和制备反相色谱(Microsorb C-18)利用线性梯度(溶剂A50mM磷酸钠，pH5.8,2％乙腈；溶剂B50mM磷酸钠，pH5.8,50％乙腈；梯度30分钟内0-60％B)进行精制。用分析用HPLC检验，如此纯化的寡聚体的纯度约97％，仅被少量n-1种类污染。实施例2[5′-32P]-5′-O-[(N-2-硫乙基)亚磷酰胺]-UmpT7(9)的合成。将纯化的寡聚体(168nmol),ATP(160nmol),H2O(75μl),10×PNK缓冲液(5mM DTT,50mM Tris·Hcl,5mM MgCl2,pH7.6；10μl),[γ-32P]-ATP(3000 Ci/mmol,100μCi,10μl)和PNK(150U,5μl)合并，在37℃培养16小时并蒸发至干。残余物再溶于0.2M 1-甲基咪唑，pH7.0(100μl)和1.0M含有0.3M EDAC的盐酸胱胺，pH7.2(100μl)中并在50℃加热2小时(18)。利用SepPak(用50mM磷酸钠填充，pH5.8，5％乙腈；用5％在水中的乙腈洗涤；用50％在水中的乙腈洗脱)去除过量试剂。真空蒸发溶剂，粗胱胺加合物再溶于含有50mM DTT的10mM磷酸盐(200mL)中并加热到37℃1小时。如前所述从该反应混合物中除去缓冲盐和过量还原剂，粗产物真空干燥。从6以57％的产率得到的标题化合物9，不必进一步纯化即可用于下一步骤。实施例3[5′-32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)的合成。将新糖肽5(336nmol)溶于无水DMSO(40μl)中并用DIPEA(336nmol)和SMCC(336nmol)处理。反应在室温下进行4小时，然后加入到新制备的硫醇9中。将该反应混合物脱气并在室温下缓慢真空浓缩。粗产物10溶于甲酰胺加样缓冲液(100μl)，用PAGE(4V/cm,1.5h)纯化，并通过粉碎和浸渍法(50％在水中的乙腈)回收。纯10的总收率为25％。用0.1N HCl处理10(37℃,1h)，因为P-N键水解而产生[5′-32P]-磷酸化6；不过，6对DTT(50mM,pH8,37℃,1h)，3-马来酰亚胺基丙酸(50mM,pH8,37℃,1h),Ellman试剂(50mM,pH8,37℃,1h)和BAP(70U,65℃,1h)是惰性的。用0.1N HCl和BAP连续处理10就象预期的那样导致[32P]-标记完全损失。用相同方法制备的10的未标记样品的化学计量分析表明每摩尔缀合物将含有3mol N-乙酰半乳糖胺，符合预计的结构。(UmpT7的摩尔吸光系数计算为59,750L/mol-cm，是结构中包含的每个核苷的摩尔吸光系数值的总和。该数值与所发现的包含在缀合物中的GalNAc残基的摩尔数非常相符。)气动助推电喷射质谱在M/Z4080处(计算质量为4080.7)产生母离子(阴离子形式)。细胞摄取试验。材料。添加有L-谷氨酰胺的Earle′s盐的最低必需培养基(MEM)，Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基(D-MEM)，添加有L-谷氨酰胺的RPMI培养基1640(RPMI)，Dulbecco′s磷酸缓冲盐溶液(D-PBS)，胎牛血清(FCS)，丙酮酸钠(100mM)，非必需氨基酸(10mM)，含水碳酸氢钠(7.5％)，和胰蛋白酶(0.25％，用1.0mM EDTA在HBSS中制得)是从GIBCO BRL.购得的。人肝细胞癌(Hep G2)，人纤维肉瘤(HT 1080)，和人前髓细胞性白血病(HL-60)细胞是从ATCC购得的并保存于添加有10％FCS，1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸的1×MEM中(Hep G2)，添加有10％FCS的1×D-MEM中(HT-1080)，或添加有10％FCS的1×RPMI中(HL-60)。硅油是General Electric赠送的(产品号SF 1250)。利用Coulter细胞计数器进行细胞计数。实施例4Hep G2细胞或HT 1080的摄取试验。将细胞传代到2cm加样槽中并在合适的培养基中生长到约105细胞/槽的密度。将该维持培养基吸出，细胞在37℃用含有2％FCS的0.5mL培养基培养并用[5′-32P]-标记的10处理成1μm。经过规定的时间后，保存5μl等份的培养基用于闪烁计数，剩余部分从加样槽中吸出。这些细胞用D-PBS(2×0.5mL)洗涤，用0.25％胰蛋白酶处理(37℃,2分钟)并悬浮于含有10％FCS的新鲜生长培养基中。悬浮细胞在1.7mL锥形微量离心管中在硅油(1.5mL)上分层并通过以14,000rpm(12,000g)的速度离心30秒而成颗粒状。将上清液小心滗去，细胞颗粒用含有0.5％NP 40,100mM氯化钠，14mMTris·HCL和30％乙腈的100μl溶液进行溶解。放射性的量，和推断与细胞溶解物有关的10的量利用闪烁计数进行测定。实施例5HL-60细胞的摄取试验。室温下，添加有2％FCS并用[γ-32P]-10制成1μM的RPMI培养基用7.5×106HL 60细胞预处理5分钟。通过离心(5分钟)除去细胞，将培养基(31mL)滗出并加入到7.5×106新鲜HL 60细胞中。将这些细胞均匀地悬浮并将细胞悬液分成六个0.4mL一份。将剩余物抛弃。将细胞培养规定的时间，然后通过离心(5分钟)收集，再悬浮于0.5mL D-PBS中并在1.7mL锥形微量离心(microfuge)管中在硅油上分层。这些细胞通过离心(12,000g,30s)成为颗粒状，进行溶解，并利用闪烁计数测定与细胞有关的[32P]-标记的物质的量。实施例6合成其他缀合物的方法。本发明的方法可用于合成大量有用的缀合物。表1中显示了14个寡核苷类似物的例子。表2列出了14个3′-和5′-磷酸酯修饰的例子，它们提供了用于进一步反应的1°胺或硫醇。表3显示了新糖肽，它们含有N-末端氨基，和四种将胺修饰成硫醇的方法。最后，表4列出了几种异双功能交联试剂和组织蛋白酶D敏感的寡肽，它们可用于将药物前体连接到配体上。很明显，还可得到许多其他合适的试剂。
一般说来，有两种反应方案可用于将寡聚体和新糖肽共价接合起来。第一种需要利用异双功能交联试剂将寡聚体和新糖肽偶联，并可分为三部分反应。这种方案达到了对偶联反应的完全区域化学控制并得到了结构确定的和均一的缀合物。例如，如果表1中第1项所示类型的寡聚体的5′-末端在合成后被硫醇接头(表2第10项)修饰并用SMCC(表4第3项)缀合到YEE(ah-GAlNAc)3(表3第1项)上，则将得到带有与下式相同的键的缀合物
或者，可以象表3中第2-5项所显示的那样修饰新糖肽。硫醇的活化可以利用例如2,2′-二吡啶二硫化物来完成。活性硫醇与3′或5′硫醇修饰的寡聚体之一(表1第9-14项)反应可在寡聚体和新糖肽之间形成二硫键，如下所示
第二种方案提供了利用商业上可得到的交联试剂(参见表4，第4-6项)来接近不易接近的硫原子周围的空间松密度不同的二硫键的方法。从概念上讲，这种反应方案可分为两部分反应，其中对缀合物的“一半”进行修饰，然后利用另“一半”将其活化以进行反应。
表1．寡按苷膦酸甲酯类似物
表2．用于新糖肽缀合的3’和5’修饰的oligo-MP
表3．修饰YEE(ah-GalNAc)3的官能团的举例说明a
a这些试剂可用于修饰图1中所示的任何一种配体。b参见Goff.D.A.；Carroll,S.F.(1990)取代的2-iminothiolanes；用于稳定性提高了的二硫化物交联的缀合物的制备的试剂。生物缀合化学Ⅰ,381-386表4．活性oligo-MP，活性配体和交联试剂的可能的组合的实例。
a所示试剂不能在商业上获得。讨论[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)的合成。YEE(ah-GalNAc)3(5)(15a)和UmpT7(6)(17)的合成与纯化是按照常规方法进行的。为了在5和6之间形成共价键，6的5′末端利用Orgel的方法(18)进行修饰。这样在oligo-MP中引入了二硫化物，它又可用DTT还原得到5′-硫醇。利用能与5的N-末端氨基结合的异双功能交联试剂SMCC以互补方式修饰新糖肽5。通过SMCC引入的马来酰亚胺基和修饰的oligo-MP的5′-硫醇的偶联使得oligo-MP与新糖肽经代谢稳定的硫醚成键(图2)。为了开始合成，利用T4多核苷酸激酶和0.95当量的ATP将6磷酸化。以这种方式进行末端标记反应确保了约90％的ATP被使用以有效地利用[32P]-ATP来放射性标记缀合物。用两个步骤来完成5′-磷酸酯的修饰。在含有0.1M 1-甲基咪唑，pH7.2的缓冲液中，在0.15M EDAC存在下，用0.5M盐酸胱胺在50℃培养末端标记的oligo-MP，得到5′胱胺亚磷酰胺，产率65％。尽管试图改进反应条件(例如降低温度和降低EDAC的浓度)，但在这一反应过程中仍产生了不超过35％的胸苷修饰的oligo-MP，它的产生无法消除。这种副产物的产生大概是由于EDAC与胸苷的N-3反应形成了胸苷-EDAC加合物(19)。用50mM DTT在pH8下还原二硫化物是定量的。尽管在这个实施例中，合成后硫醇被引入到oligo-MP上，部分地允许32P酶促引入5′末端，缀合物的构建可以通过在利用例如可从Glen Research购得的6-(三苯甲游基硫)己基亚磷酰胺(19)合成oligo-MP的固相的过程中引入硫醇接头而容易地完成。
在一个独立的反应中，5与各一当量的SMCC(7)和DIPEA在无水DMSO中结合并在室温下培养。该反应混合物与硫醇9的结合完成后，SMCC没有完全被5消耗，因为反应基团存在于9上，7和9是区域特异性结合的。进行完这一流程之后，当使用两当量的新糖肽5时，9完全转化为10。缀合物10基于oligo 6的总收率为24％(三次合成的均值)。
细胞摄取试验。检验缀合物10单独和在100当量的游离新糖肽5存在下与Hep G2细胞的细胞结合情况，以证明细胞的摄取是10的新糖肽部分结合到肝糖受体上的结果。作为对照，在相同条件下用Hep G2细胞培养5′-末端用亚乙二胺修饰的oligo-MP(11；图2)。5′-磷酸酯用亚乙二胺的修饰是通过在含有0.1M咪唑，pH7的缓冲液中，在37℃，用0.1M EDAC培养5′-磷酸化的2两小时，接着用0.3M调整到pH7.0的盐酸亚乙二胺水溶液培养过夜而完成的。(Miller,P.S.；Levis,J.T.,未公开的结果)。这种修饰阻止了5′-磷酸酯被细胞磷酸酶活性除去。
在每一情况中，修饰的oligo-MP以1μM的浓度存在于含有2％胎牛血清(FCS)的培养基中并在37℃下进行培养。当仅进行培养时，缀合物迅速与细胞结合，仅两个小时后，细胞即以线性方式加样到每106细胞7.8pmol的程度(图5)。相反，当100倍过量的游离5与1μM缀合物一起存在时，10的结合仅为0.42pmol/106细胞，这个值实质上等于用对照oligo-MP 11得到的值(0.49pmol/106细胞)。作为另外的对照，Hep G2细胞用11在10倍过量的5存在下进行培养来评定尽管5和11之间没有共价键，而5能使11被Hep G2细胞摄取的可能性。培养两小时后，与细胞结合的11的量仅为0.60pmol/106细胞，显著低于用缀合物10时得到的值。另外，还检验到Hep G2细胞对10的摄取时间更长(1μM缀合物，37℃)，并发现其线性上升直到约24小时达到26.6pmol/106细胞(图6)。这些试验结果表明(1)缀合物10是通过特异性结合到脱唾液酸糖蛋白受体上而与Hep G2细胞结合的；(2)oligo-MP与新糖肽之间的共价键对于显著增强oligo-MP与Hep G2细胞的结合来说是必需的；和(3)在该研究中所用的条件下Hep G2细胞对10的摄取直到24小时都没有出现饱和。
还检验了化合物的细胞类型特异性。众所周知，在肝细胞表面发现了脱唾液酸糖蛋白受体并显示了将多种治疗剂选择性地定向释放到该组织的有效手段(21)。通过在含有1μM缀合物10和2％FCS的培养基中，在37℃，将三种人细胞系Hep G2,HL-60和HT 1080培养3和24小时来检验组织特异性。只有Hep G2细胞系显示出对10的显著摄取。培养3和24小时后，与细胞结合的量分别为8.5pmol/106细胞和26.7pmol/106细胞(图7)。与此比较，24小时后，与HL-60细胞和HT 1080细胞结合的量仅分别为0.10pmol/106细胞和0.53pmol/106细胞。这一结果与先前“缀合物YEE(ah-GalNAc)3-HSA-聚-L-赖氨酸将DNA主要释放到小鼠的肝脏”的发现(16)是一致的。
利用三种人细胞系来检验新的oligo-MP新糖肽缀合物[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)的细胞结合和细胞类型特异性。10与Hep G2细胞的细胞结合非常有效并线性上升直到24小时达到最大浓度26pmol/106细胞。利用近似法，用106细胞代表1μL的体积，则该缀合物的胞内浓度可以是26μM。另外，仅有少量缀合物与HL-60或HT1080细胞结合，证明新糖肽5能够将oligo-MP 6以高选择性方式释放到肝细胞中。整体动物的生物分布和药物动力学[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-[32P]-pUmpT7(10)和[YEE(ah)3]-SMCC-AET-[32P]-pUmpT7(12)的合成。简单地说，本发明的寡脱氧核苷膦酸甲酯(oligo-MP)，UmpT7是在5′末端用[γ-32P]-ATP和ATP标记的，从而得到具有300μCi/14 nmol特异性活性的p☆UmpT7(☆表示放射性核素的位置)。在1-甲基咪唑和水溶性碳化二亚胺的存在下用胱胺修饰5′磷酸酯。所得二硫化物用过量二硫苏糖醇还原并利用异双功能交联试剂SMCC与配体YEE(ah-GalNAc)3结合。缀合物(1)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，从凝胶中萃取并利用SepPak柱体脱盐。在酶促和化学两方面表征纯缀合物。为了完全除去GalNAc残基(12)，用N-乙酰葡糖胺糖苷酶处理一部分缀合物。通过PAGE分析鉴定，10和12均大于99％纯度。将含有缀合物的溶液加入无菌试管中并在无菌制备条件下冷冻干燥以用于整体动物生物分布和药物动力学试验。
整体动物生物分布和药物动力学试验。再次将缀合物10和12溶解于无菌水中。每只小鼠通过尾静脉注射0.11μCi(7pmol)缀合物10和0.036μCi(1.2pmol)的12。随后在注射后15,30,60,120和1440分钟时收集血液，膀胱/尿和组织样品(肝，脾，肾和肌肉)。每个时间点用三只小鼠，总共用30只小鼠。采样时通过颈脱位将小鼠处死。整个湿组织在闪烁管中称重并在50℃用NCS加溶剂进行消化。将样品脱色，溶于闪烁混合物中并通过闪烁计数测定放射性的浓度。从膀胱得到的数据表示为每个组织样品的百分初始剂量，除此以外，将其他粗数据转化为每克组织的百分初始剂量，因为要完整地得到这些组织是困难的(参见图8)。
在15分钟时，与肝结合的缀合物10为37％初始剂量/克组织，而与膀胱/尿和肾结合的更少，分别为11％和2.4％。当认为肝平均质量为1.4g时，则注射15分钟后有52％初始剂量与肝结合。所检验的其他组织在15分钟后包含小于1.2％的初始剂量。结合的肝的放射性的量在较长时间里稳定下降，最终在24小时后达到2.3％。相反，15和30分钟之间，在膀胱和尿中的缀合物的量增加，然后降低到类似水平。
缀合物12缺少三个GalNAc残基，它迅速地与膀胱/尿结合，较小程度地与肾结合，对肝没有显示出特异性。例如，在30分钟时，与膀胱/尿，肾和肝结合的量分别为40％,5.0％和1.1％的百分初始剂量/克组织。
从这些数据可看出(1)缀合物10特异性地与肝结合；(2)缀合物10的结合完全依赖于配体上存在的GalNAc残基；(3)缀合物10或，更可能是其代谢物，在24小时内从肝中清除并经肾从小鼠体内消除，因此发现了其进入膀胱和尿的方法。另外，由于血液中的放射性与同肝结合的大量放射性相比浓度低，由此可得出结论缀合物10被释放到肝细胞中，而不是仅在空隙处与肝结合。化合物1b和1c的合成过程本发明化合物的其他实例显示于表5中。表5．寡核苷酸交替膦酸甲酯类似物序列1 (n=7) ApGpUpCpApGpUpCpApGpUpCpApGpU2 (n=7) GpUpUpCpUpCpCpApUpGpUpUpCpApG3 (n=10) UpUpUpApUpApApGpGpGpUpCpGpApUpGpUpCpCpApU其中p磷酸二酯键p膦酸甲酯键ps硫代磷酸酯键
寡核苷酸R1R2R3R4a H O-CH33′-缀合物b C6-巯基O-CH33′-缀合物c5′-缀合物 O-CH33′-缀合物d 配体-SMCC-AET O-CH3He EDA O-CH3H其中配体YEE(ah-GalNAc)35′-缀合物YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-S(CH2)6-ps键(图3)3′-缀合物示踪物单位(图9)EDA亚乙二胺利用下文中描述的合成方法可以将序列1-3与表5下部所示的寡核苷酸a-e的取代基连接形成本发明化合物的其他实例。例如，1b由带有按照本发明的取代基C6-硫醇-ps,O-,CH3和3′-缀合物的序列1组成(结构显示于图9)。如实施例8和9中的详细描述，按照图3所示的流程可合成1b(化合物13)和1c(化合物14)所示结构的化合物。很清楚，在起始物中用合适的取代并在合成中进行变化可类似地合成其他结合物。实施例7SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(8)的合成(另一种方法)。将约1-2μmoleYEE(ah-GalNAc)3干燥后加到1mL玻璃反应管中。向该溶液中加入无水DMSO(250μl)和无水DIPEA(3μl)，然后用含有真空干燥的SMCC(6mg)的150μl无水DMSO溶液处理。该混合物简短旋转后在室温下放置2小时。利用反相HPLC分析表明起始的YEE(ah-GalNAc)3(洗脱时间7.3分钟)完全转化为预期产物SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(洗脱时间9.8分钟)。然后用含有2％CH3CN的50mM磷酸钠(pH5.8)将该反应混合物稀释到10mL并填充到Sep-Pak柱上。该柱用10mL含有2％CH3CN的50mM磷酸钠(pH5.8)洗涤，产物用10mL 25％CH3CN/H2O洗脱。将该产物在真空离心蒸发浓缩器中减压浓缩并在半制备型反相C18柱上进一步纯化。将含有纯SMCC-YEE(ah-GalNAc)3的组分合并并在Sep-Pak上脱盐。产物的终产率为1.89°D276或1.35μmole。实施例8硫醇修饰的寡核苷酸〔(例如表5中的化合物1b)的制备。在该研究中使用新型的寡聚体，随机的(表5，序列1)，抗HBV(表5，序列2)和核(表5，序列3)，它们含有带有磷酸二酯和膦酸甲酯交替的核苷酸间连键的2′-O-甲基核糖。经亚磷酰胺合成子引入用于与新糖肽缀合的能还原产生硫醇的5′-二硫键。最后，在该研究中还使用3′-缀合物形式的寡核苷酸示踪物单元，以使可磷酸化的3′-末端可用来引入放射性32P标记。这些修饰的寡聚体利用从商业上获得的(Glen Research)相应的亚磷酰胺和甲基亚膦酰胺而在固相DNA合成仪上合成。示踪物利用作为固相的dT-5′-Lcaa-CPG和dT-5′-CE亚磷酰胺，5′-DMT-5-[N(三氟乙酰)己基-3-丙烯酰胺]-2′-脱氧尿苷，3′-[(2-氰乙基)-(N,N′-二异丙基)]亚磷酰胺合成(图10)，并且所用反应物是可从Glen Research购得的。在固相合成的最后的偶联步骤时通过与C6-二硫氰乙基亚磷酰胺合成子(Glen Research)偶联而将5′-二硫键引入这些寡聚体中。当需要时，按照标准常规方法，用Beaucage试剂(Glen Research)代替低水分氧化剂来作用于亚磷酸盐的硫化以得到硫代磷酸酯。寡聚体用Genta one-pot法脱保护，并利用trityl-on法纯化。最后的纯化利用制备反相C18柱进行。
二硫部分还原为硫醇是通过用DTT处理含有5′-二硫化物的寡聚体来完成的。因此，将2.5 OD260(～16nmol)含二硫化物的寡聚体溶于新制备并脱气的50mM DTT在10mM磷酸钠的400μl溶液，pH8中。该混合物在37℃培养2小时。利用反相HPLC分析确定定量还原，它显示含硫醇的寡聚体的洗脱快于含二硫化物的寡聚体。然后含硫醇的寡聚体在Sephadex G-25柱(10×300mm)上精制以去除DTT和盐。利用脱气的20％乙醇-水填充柱并洗脱样品。将含有纯巯基寡聚体的G-25组分立即用于下一步反应以将不希望的氧化减至最小。实施例9含有SMCC-YEE(ah-GalNAc)3的寡核苷酸(化合物14，表5中所示1c)的合成。将含有1.8OD260(12nmol)纯硫醇寡聚体(1b)的G-25组分收集后立即与SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(50nmol)混合。该混合物在真空离心蒸发浓缩器中浓缩至干。残余物溶于100μl含有0.1M磷酸钠的脱气的50％CH3CN，pH7中。该溶液在真空离心蒸发浓缩器中通过施加真空约5分钟而进一步脱气。然后将该溶液盖紧并在室温下培养过夜以使结合完全。为了测定缀合的产率，利用[λ-32P]-ATP和PNK将0.5μl反应物磷酸化并用20％变性PAGE分析。该结果表明硫醇寡聚体与新糖肽定量缀合。缀合物通过其随胰凝乳蛋白酶消化的显著迁移率变动和其不能随DTT处理而移动来确定。该缀合物最后用Sephadex G25柱进行纯化，用20％乙醇洗脱，然后用于下一步研究。实施例10Hep G2 2.2.15的细胞摄取试验Hep G2 2.2.15，人肝细胞癌细胞系用Dr.G.Y.Wu赠送的人乙型肝炎病毒DNA(22)稳定地转染。其他合适的细胞系对于本领域技术人员来说是熟知的，例如PLC/PRF/5(亚力山大细胞)，人肝癌分泌的乙型肝炎表面抗原已被描述过(23)并可从American Type CultureCollection获得。
将Hep G2 2.2.15细胞保存在1份添加有10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle′s培养基中。所用的所有其他材料与上文细胞摄取部分中提到的那些相同。
将Hep G2 2.2.15细胞接种到2cm2的加样槽中并在含有10％FCS的1×DMEM中生长到105细胞/槽的密度。将维持培养基吸出，细胞用含有2％FCS的0.5ml DMEM在37℃培养并用1c,1d或1e制成1μM[5′32P]。所有其他方法与实施例4中所述的相同。
为了测定1c的流出量，将HepG2 2.2.15细胞接种并如上所述用1μM缀合的寡聚体培养24小时。然后将含有寡聚体的培养基吸出，细胞洗涤两次，接着在0.5ml维持培养基中培养。在指定的时间收集细胞并如临时申请的细胞摄取部分所描述的那样进行溶解。通过监测放射性的量来测定流出量并推断细胞溶解物中缀合的寡聚体的浓度。讨论上述细胞摄取试验是用来检验1d与Hep G2 2.2.15细胞的细胞结合。与在oligo-MP下的情况一样，通过用亚乙二胺修饰1的32P标记的5′末端得到1e而制成对照品。
该试验的结果与用修饰的oligo-MP进行的试验结果非常相似。HepG2 2.2.15细胞以线性方式吸收缀合的2′OMe交替寡聚体(1d)，培养2小时后达到7.7pmoles/106细胞的程度(表6)。在三小时内摄取增加到14.2pmoles/106细胞，并在培养24小时后达到峰值28.5pmoles/106细胞。与此相比，培养2小时后EDA修饰的寡聚体(1e)与Hep G2 2.2.15细胞结合到0.275pmoles/106细胞的程度，3小时后达到0.978pmoles/106细胞，24小时后达到0.385pmoles/106细胞(表6)。
在1d的3′末端加入硫代磷酸酯保护的[32P]标记的示踪物从而将其进一步修饰得到1c。该缀合寡聚体(1c)的摄取与1d所显示的非常相似。细胞结合以线性方式发生，培养12小时后达到18.6pmoles/106细胞，培养24小时后达到峰值28.97pmoles/106细胞(表7)。
随后再评定与细胞结合的1c的流出速率。在停止处理24小时后，缀合的2′OMe交替寡聚体在Hep G2 2.2.15细胞中的浓度稳定地下降到12.45pmoles/106细胞(表8)。
上述试验证明新糖肽5能够将由所有2′-O-甲基核糖核苷和膦酸甲酯、磷酸二酯交替的核苷酸间连键组成的生物稳定的寡聚体以高效方式释放到肝细胞中。另外，硫代磷酸酯保护的示踪物置于缀合的寡聚体(1c)的3′末端对细胞摄取没有显著影响。此外，这些研究结果也显示处理终止24小时后，退出细胞的内化的寡聚体达到了摄取峰值的58％。表6 Hep 2G 2.2.15细胞在培养物中对缀合物YEE(ah-GAlNac)3-SMCC-AET-2′0-Me5′AGPUCPAGPUCPAGPUCPAGPU3′(1d)和EDA-2′-0-Me-5′AGPUCPAGPUCPAGPUCPAGPU3′(1e)的摄取(pmoles/106细胞)
表7 Hep G2 2.2.15细胞在培养物中对YEE(ah-GAlNac)3-SMCC-S(CH2)6-ps-2′0-Me-5′AGPUCPAGPUCPAGPUCPAGPU3′-UMdT*3′-3′(dT-T)-32P-EDA(1c)的摄取(pmoles/106细胞)
表8在培养物中Hep G2 2.2.15细胞放出YEE(ah-GAlNac)3-SMCC-S(CH2)6-ps-2′0-Me-5′AGPUCPAGPUCPAGPUCPAGPU3′-UMdT*3′-3′(dT-T)-32P-EDA(1c)的量(pmoles/106细胞)
实施例11进行整体动物试验来测试本发明的释放载体的能力，即含有脱唾液酸糖蛋白配体、用32P放射性标记的YEE(ah-GalNAc)3的载体将合成的oligo-MP特异性释放到小鼠肝脏的能力并检验该缀合物在分离的HepG2细胞中和在体内小鼠肝和尿中的代谢结果。
为了进行对比，合成没有三个末端Gal NAc残基的缀合物。用该无糖缀合物作为配体(GalNAc)-在小鼠体内特异性摄取研究的对照品。材料和方法实施例12组织分布和清除的时间进程。重22-35g的雄性CD-1小鼠(Charles River)经尾静脉单独注射包含在0.2mL盐水中的7-30picomoles的[32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpTr(10)或7pmole的[32P]-[YEE(ah)3]-SMCC-AET-pUmpT7(12)。在15,30和60分钟以及2,4,6和24小时时通过颈椎脱位将小鼠处死。收集血液、肝、肾、脾、肌肉、上和下胃肠道以及粪便并称重。将取自这些器官和组织的有代表性的样品称重并置于玻璃管中。为了收集尿液(注射后2小时)，在短暂醚麻醉条件下结扎小鼠的外部尿道，并在处死后，摘取膀胱并置于玻璃管中。将Solvables(NEN；1mL)加入每份样品中。然后将样品置于玻璃片上加热进行消化过夜，第二天早上去除并冷却。用3-7滴H2O2(30％w/v)将消化后的样品脱色，并加入10mL Formula989(NEN)闪烁混合物。通过闪烁计数(Packard 1900 TR；＜3％误差)测定放射性的量。等分注射剂量与样品一起计数以计算每个器官或每克组织的百分剂量。实施例13从Hep G2细胞分离出的代谢物的分析。将细胞(约105)在含有1μM[32P]-标记的1的培养基中培养2,4,8,16和24小时，用PBS洗涤(2次)，通过硅油形成颗粒并溶解(0.5％NP 40,100mM氯化钠，14mM Tris-HCl pH7.5,30％ACE)。溶解物用50％含水乙腈(v/v)萃取两次。将提取物冷冻干燥，再溶于甲酰胺加样缓冲液中并用PAGE进行分析(15％,2V/cm,30分钟)。实施例14缀合物代谢的分析。重22-35g的雄性CD-1小鼠经尾静脉单独注射40pmole的[32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)。在15,60和120分钟后将动物处死。同前收集肝和膀胱，并置于塑料管中立即冷冻(80℃)。将肝样品解冻到0℃并称重(平均质量0.25g)。将该组织(用Polytron PCU-2-110组织均化器)均匀分散于4体积的乙腈/水(1∶1)中。通过离心(10,000g,20分钟，0℃；Sorval ModelRC-5B冷冻超速离心机)除去组织残渣。将上清液除去并重复萃取过程。根据脱色匀浆和上清液等份的比较判断，一般放射性物质从肝样品中的回收为390％。将一部分上清液通过Centricon滤器过滤(30,000MWC；20分钟，0℃,10,000g；Herml Z 360 K冷冻微量离心机)并冷冻干燥。残余物再溶于10mL甲酰胺加样缓冲液(90％甲酰胺，10％1×TBE,0.2％溴酚蓝，和0.2％二甲苯蓝)中以备利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析(PAGE；15％,20×20×0.75cm,2V/cm,45分钟)。从已解冻到0℃的膀胱收集尿并用乙醇(1∶2v/v)在0℃脱蛋白质30分钟。通过离心去除沉淀的蛋白质(16,000g,20分钟，0℃)。通过对比等分上清液与蛋白质颗粒计算出放射性的回收为390％。将一部分上清液冷冻干燥，再溶于甲酰胺加样缓冲液中并用PAGE进行分析(15％,20×20×0.75cm,2V/cm,45分钟)。在不同反应中，用在50mM柠檬酸钠，pH5.0中的N-乙酰葡糖胺糖苷酶，在含有200mMKcl的10mM Tris·HCl,pH8.0中的胰凝乳蛋白酶和0.1N HCl于37℃培养全长缀合物(10)30分钟制得标准品。实施例15肝脏摄取和清除的组织分布及动力学。
为了研究缀合物10在体内组织和器官的分布，如前所述用放射性标记的缀合物经尾静脉给小鼠注射，并通过闪烁计数测定与每个器官结合的放射性的量。表9显示缀合物与肝结合到最大程度，注射后15分钟达到注射剂量的69.9％。在注射后15分钟时测定的在其他组织中的总放射性的大小顺序，从大到小为肌肉＞肾＞血液＞脾。30分钟后，尿的放射性达到峰值，为注射剂量的28％。与肾和血液结合的放射性的量随时间下降。值得注意的是，尽管期望在肝中产生的缀合物的代谢物将经胆汁分泌而沉积于胃肠道，但与胆囊，上下胃肠道和粪便结合的放射性很少(表9)。
表11显示缺乏三个末端GalNAc残基的缀合物12按以下顺序分布肌肉＞血液＞肾＞肝＞脾。在24小时研究过程中，肌肉和肝放射性的量似乎是恒定的，而与血液和肾结合的量下降。注射后30分钟时尿中放射性的峰值为39.9％。作为对照，用缀合物10进行相同的试验(表11)。组织分布的大小顺序，放射性的量从大到小为肝＞＞肌肉＞肾＞血液＞脾。注射后30分钟，尿中含有注射剂量的17％。实施例16缀合物10的代谢作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。图13显示了用Hep G2细胞培养2-24小时后，缀合物10的代谢作用的PAGE分析结果。将三组代谢物按照它们与对照反应物的电泳淌度比进行区分(图13中标记的Ⅰ-Ⅲ)。Ⅰ组看来由四种化学相异种类组成，其中1和2在所有时间点上均是主要的。1和2的分布在最早的时间点近似为1∶1，移动到更长的培养时间时主要是2。在每个时间点还观察到了该组的第3种代谢物(3，图12b)与1的胰凝乳蛋白酶消化产生的物质共同迁移。这种代谢物的相对量基本保持恒定直到终时间点(24小时)时只剩余了很少。第四种是未确定的，除了最后的时间点以外，在所有时间点都观察到它的淌度稍慢于3。所有Ⅰ组代谢物到终时间点时量都逐渐减少。第Ⅱ组代谢物由放射性标记物组成，与第Ⅰ组代谢物对比，它具有更大的电泳淌度。至少观察到5个带，不过，它们并非在每个时间点都出现。例如，最高和最低位置的带的代谢物似乎增加直到16小时时间点，然后在24小时下降。对于主要物质观察到了相同的行为。此带的最大增强发生在8小时，接着逐渐下降到24小时。正如从Ⅰ组代谢物观察到的，所有Ⅱ组代谢物到24小时时间点时量都逐渐减少。Ⅲ组代谢物在凝胶基质中大都是固定的，多半保留在聚丙烯酰胺凝胶的槽中。此带的增加随时间增强，24小时时达到最大值。
10在完整小鼠肝脏中的代谢率的分析用类似方式进行。图14显示了从用[32P]-标记的缀合物10注射过的小鼠的肝脏样品得到的肝匀浆提取物的PAGE分析的结果。
注射后15分钟，仍保留了大量完整的缀合物10(Ⅰ组代谢物，参见图13)。凝胶的分解不足以使两种代谢物区分开。在该样品中剩余的放射性标记的物质的迁移显著快于1和2，且不与任何对照品共同迁移。这些代谢物似乎具有更宽范围的淌度，最慢的比与Hep G2细胞等同的第Ⅱ组代谢物的移动性小得多(Ⅱ′组)。在后面的时间点，几乎所有完整的10和12都消失了，而Ⅱ′组代谢物的量却增加了。
图15显示了小鼠用放射性标记的10静脉注射给药后尿中观察到的代谢物的情况。仅有Ⅰ组代谢物是检测到的放射性标记的物质。缀合物大部分是基本完整的但带有少而明显量的转化为两种代谢物的物质，这二者都不与任何对照品共同迁移。在试验过程中，每种的相对量都保持恒定。在小鼠的尿中没有观察到第Ⅱ,Ⅱ′或Ⅲ组代谢物。讨论本文中描述的证据证明化学确定的和均一的[32P]-标记的缀合物10能以配体和细胞型特异性方式穿过Hep G2细胞的细胞膜。对这些研究的合理的扩展是测定1在体内的组织分布并对比10在体外和体内的代谢率，用得到的这些数据与缺少三个末端GalNAc残基的缀合物12对比。体内组织分布数据确证了用培养的人细胞得到的结果。寡脱氧核苷膦酸甲酯对肝的高度选择性寻靶作用(70±10％,i.d.)是通过寡聚体和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP)配体YEE(ah-GalNAc)3的共价粘附而有效地达到的。的确，缀合物在肝中的浓度以整个组织测定为基础，是在血液中的25倍，是肌肉中的约10倍(表9)。这些结果比较起来是有利地并在各个方面优于Lu等人报道的类似试验的结果，该报道中说当与其他组织对比时，[32P]-标记的反义oligo-dN向鼠肝脏的释放增强了，因为它与脱唾液酸糖蛋白-聚-L-赖氨酸缀合物复合(Lu等人，1994)。不过，正如作者提到的，由于脾，肺和肾也聚集放射性标记的oligo-dN，因此对肝的优先复合是勉强的(例如，注射5分钟后，分布于每克各组织中的量分别为注射剂量的约6％,4％,2％和2％；Lu等人，1994)。另外又将我们的结果与Eichler等人报道的那些(1992)作了比较，Eichler等人报道测定促血清脂质减少剂安沙霉素单独用药和共价键合到另一种三触角ASGP配体N-[三[(b-D-吡喃半乳糖基)甲基]-甲基]-Na-(乙酰)甘氨酰胺(tris-galacetate)上后在大鼠体内的生物分布和肝脏摄取率。作者报道游离药物和缀合物的肝脏摄取是大致相当的，由此他们得出结论三触角ASGP受体没有增强大鼠肝脏对药物的摄取。我们的发现却与此相反通过配体YEE(ah-GalNAc)3的共价粘附，大大促进了小鼠肝细胞的摄取。
作为对照，给小鼠注射缀合物12，它缺乏三个末端GalNAc残基，因此不会被ASGP受体辨别出来。正如预想的那样，在肝中只检测到很小的放射性，更多的放射性与其他组织结合了(表11)。这一结果扩展了我们以前的发现，即放射性标记的oligo-MP对肝细胞的定向作用是其共价附着到配体上的结果。
无糖配体-寡聚体缀合物的结果与分别报道的其他结果非常类似。给小鼠静脉注射单剂的除了最后的5′末端磷酸二酯键外由所有膦酸甲酯主链组成的氚标记的12基体(d-Tp*TCCTCCTGCGG)。于给药后2，5,10,30,60和120分钟时收集器官。数据显示放射性没有在肝脏，肺，肌肉或脾中分配，而是迅速从血浆排泄到肾和尿中。HPLC研究表明静脉注射后，完整的12-基体经末端核苷酸的酶促裂解代谢为11-基体，二者迅速排除到尿中。因此，本文中报道的结果与早先得到的结果很一致，证明了GalNAc末端在寡聚体缀合物直接摄取到肝脏中的重要性。
为了深入了解缀合物10在体外和体内的代谢率，我们利用PAGE分析检验了从生长于培养基中的Hep G2细胞得到的提取物和从小鼠的肝和尿中得到的提取物。我们注意到在Hep G2细胞和小鼠肝脏中产生了三组代谢物(Ⅰ-Ⅲ组)，而从小鼠尿中只分离出Ⅰ组代谢物。Ⅰ组代谢物的增加似乎是由于配体的降解。为了模拟这三种代谢物的产生使用了两种酶促反应N-乙酰葡糖胺糖苷酶和胰凝乳蛋白酶。前者处理得到的2的迁移稍快于1，因为失去三个末端GalNAc残基后质量稍有减轻。后一种处理导致淌度增强，因为二者均失去了大多数配体且总电荷从-1增加到-2(图12)。这两种模型反应产生了带有保持共价键合到完整放射性标记的oligo-MP上的修饰配体的化合物。因此可合理地得出结论其他物质迁移到凝胶的相同区域是由于配体的降解而不是在1的其他不稳定部位的键裂解。例如，单一的氨基己基侧链酰胺键的水解将得到质量在2和3之间的5(图12b)并使得负电荷从-1增加到-2。在该实施例中，通过PAGE分析可预料到淌度在2和3之间的代谢物。第Ⅱ组代谢物的迁移显著快于如Ⅰ组区别的那些。我们提出它们升高是由于位于oligo-MP的5′末端的单一磷酸二酯键的出乎意料的水解。我们预计该部位对于基于用蛇毒磷酸二酯酶引导的模型反应通过内切核酸酶活性而裂解(Sproat等人，1989)是稳定的，反应中没有观察到裂解。该部位的裂解将从1的剩余物中释放出末端的7个oligo-MP的核苷酸，最重要的是，产生支持含有放射性标记的磷酸酯的单一核苷酸的相当低分子量的物质(6，图12b)。配体的进一步降解将产生分类为Ⅱ组代谢物的多种物质。仅在Hep G2细胞中观察到的Ⅲ组代谢物看来是含有放射性磷的高分子量物质，它们在凝胶中迁移较短距离。放射性磷酸酯从1中的释放及其随后加入高分子量细胞结构(核酸或蛋白质)将与该带有关。许多资料证明当它成熟时，内体区室酸化，在与溶酶体稠合前达到pH5.5(Schwartz等人)。另外，将oligo-MP连接到配体的氨基磷酸酯键在酸性条件下容易水解得到4(图12b)。为了测试内体区室的酸化导致P-N键水解的可能性，在37℃用50mM柠檬酸钠在pH5.5和pH6.0条件下培养1，我们观察到24小时后，1在pH6是稳定的，但是在pH5.5下基本水解为4(＞50％)，如PAGE分析所测定，水解特异性发生在氨基磷酸酯P-N键(数据未显示)。因此，可合理地得出结论放射性磷酸酯加入细胞结构中是通过由于含有1的内体区室的酸化和末端磷酸酯通过磷酸酶活性而释放到细胞milleau中而使P-N键水解而发生的。
从Hep G2细胞提取物中观察到的代谢物的曲线包括各组代谢物。在较早的时间点，大多数放射性包含在Ⅰ组物质中，主要是1和2。在后面的时间点，代谢物的分布从Ⅰ组迁移到Ⅱ和Ⅲ组，在抽样的最后一个时间点，大多数放射性磷归属于Ⅲ组代谢物，表明在试验过程中P-N键已基本水解。很明显1一但摄取到Hep G2细胞中即显著代谢，暗示了利用这种方法是可实现反义oligo-MP或其他试剂的胞内释放的。
由于P-N键上只有磷被32P标记，因此不可能测定寡核苷酸类似物的代谢率。由于寡核苷酸的大范围代谢将对与胞内互补核酸序列的特异性相互作用的能力起反作用，未来需要进行利用寡核苷酸序列在其他位置进行标记的研究。
从小鼠肝和尿得到的提取物的PAGE分析结果证明代谢物在小鼠肝脏中的产生与在Hep G2细胞中观察到的不同，是两种方式。首先，1在肝脏中消化产生Ⅱ′组代谢物是明显更快的，仅1小时后就在这些物质中发现了大多数放射性。其次，Ⅱ′组代谢物在肝脏中的淌度和曲线不同于Ⅱ组代谢物在培养细胞中的，暗示1在小鼠肝脏和Hep G2细胞中遇到的酶促活性是不同的。在2小时时间过程中，很少或没有Ⅲ组代谢物产生，结果与Hep G2细胞的结果一致。与1在小鼠肝脏中的大范围降解相反，代谢物在尿中的图形是更简单的，且似乎仅仅由Ⅰ组代谢物组成。从肝脏和尿观察到的代谢物的不同图形暗示缀合物释放到了肝脏细胞中且不仅仅包含在该器官的间隙中。结论化学确定的、结构均一的新糖肽-寡脱氧核苷膦酸甲酯缀合物(10)的体内分布和代谢证明该缀合物的释放是高效的，注射后15分钟在肝脏中达到了注射剂量的约70％的水平。与配体的迅速和大范围降解一起，这些结果显示这种用于释放反义试剂，无论是膦酸甲酯还是其他类似物，以及其他有用的治疗剂的方法将是非常有用的。另外，这些结果也提供以迄今为止还未实现的特异性来测定体内细胞功能的区域异常的方法，从而显示了利用与反义基团的特异性核酸偶联的配体的组织特异性来完成诊断造影过程的潜力。表9．[32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7的动力学。以30pmol的剂量浓度给小鼠静脉注射。
a此值为三个动物的每个器官的百分注射剂量均值±标准误差。每只小鼠静脉注射约0.5microCi(30pmol)。分别测定每个器官的质量并用于从每克组织注射的缀合物的剂量百分数测定每个器官的剂量百分数。一般每个器官或组织的质量为血液=0.07×体重；肝=1.6+0.21g；脾=0.17+0.05g；肾=0.6±0.1g；肌肉=0.4×体重。平均体重为32.4±2.0g(std.dev.；n=12)。60分钟时尿中放射性的峰值为注射剂量的27.7±20.2％。大标准误差反映了个体动物间尿产物的变化和样品采集的完整性。b该值得自单一测定。c该值为两个独立测定试验的均值。表10．静脉注射[32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7后每个器官累积的注射剂量百分数。
(a此值为三个动物的每个器官的注射剂量百分数平均±标准误差。每只小鼠静脉注射约0.1microCi(7pmol)。下述值用于从每克组织的剂量百分数测定每个器官的剂量百分数；血液质量=0.07×体重；肝脏质量=1.14g；脾的质量=0.124g；肾的质量=0.4g；肌肉质量=0.4×体重。平均体重为23.7+1.2(std.dev.；n=15)。30分钟时尿中放射性的峰值为注射剂量的17.1±10.2％。大标准误差反映了个体动物间尿产物的变化和样品采集的完整性。表11．[32P]-[YEE(ah)3]-SMCC-AET-pUmpT7静脉注射后的动力学。<
a该值为三个动物的均值±标准误差。每只小鼠静脉注射约0.1microCi(7pmol)缀合物。下述值用于从每克组织的剂量百分数测定每个器官的剂量百分数；血液质量=0.07×体重；肝脏质量=1.14g；脾的质量=0.124g；肾的质量=0.4g；肌肉质量=0.4×体重。平均体重为23.7+1.2(std.dev.；n=15)。30分钟时尿中放射性的峰值为注射剂量的36.9±13.5％。大标准误差反映了个体动物间尿产物的变化和样品采集的完整性。b该值为两个独立测定试验的均值。
可以理解的是利用本文中描述的方法可以合成大量有用的化合物，特别是用表1-4中列举的试剂和化合物。本文中的实施例仅仅是为了阐述本发明而不起任何限制作用。应当清楚对本发明可作多种改进，这些都包括在本发明所要求的保护范围内。
为了方便起见，下面列出了本文涉及的参考文献，它们都结合在此作为参考1．Mirabelli,C.K.；Crooke,S.T.(1993)现代分子药物发现及发展范围内的反义寡核苷(Crooke,S.T.和LeBleu,B.Ed.)CRC Press,BocaRaton,PP.7-35。
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权利要求
1．一种下式代表的化学均一的缀合物A-L-P其中A代表附着基，P代表生物学稳定的药物前体，该药物前体在特异性生物化学键水解或还原后从缀合物释放出来的，并因此成为活性的或者比作为缀合物的一部分时更具活性，和L代表双功能接头，它与附着基和药物前体区域特异性化学结合以提供化学均一的缀合物，和A,L和P是共价键合的。
2．按照权利要求1的缀合物，其中A特异性键合到只有特定组织才有的细胞表面受体上，由此提供了用于药物前体异性靶向组织或细胞的方法。
3．按照权利要求1的缀合物，其中A是特异性键合到细胞表面受体上的配体并由此促进缀合物进入具有所述受体的细胞。
4．按照权利要求1的缀合物，其中A是新糖肽。
5．按照权利要求1的缀合物，其中A选自图1化合物。
6．按照权利要求1的缀合物，其中P是具有抗酶促水解或生物降解的核苷酸间连键的寡核苷。
7．按照权利要求6的缀合物，其中P选自表1所列化合物。
8．按照权利要求6的缀合物，其中P选自下列成员脱氧核糖核苷，核糖核苷，2′-O-甲基核糖核苷或其他核苷，及其混合物。
9．按照权利要求6的缀合物，其中P是具有选自下列成员的核苷酸间连键的寡核苷磷酸二酯、硫代磷酸二酯和膦酸甲酯键以及其他抗酶促水解或生物降解的键。
10．按照权利要求1的缀合物，其中L是表4的交联试剂的产物。
11．按照权利要求2的缀合物，其中所述组织是肝。
12．寡脱氧核苷膦酸甲酯新糖肽缀合物[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-UmpT7。
13．图10或图11所示结构的具有二酯和膦酸甲酯交替的核苷酸间连键的新糖肽缀合物的寡2′-O-甲基核糖核苷，所述结构代表一族由不同碱基和糖组成的这些寡聚体。
14．用于组织特异性释放的化学均一的释放系统，它包含寡聚体和新糖肽，其中所述寡聚体是寡脱氧核苷膦酸甲酯或其类似物，所述寡聚体和所述新糖肽是共价键合的。
15．按照权利要求14的释放系统，它是基因特异性的。
16．按照权利要求15的释放系统，它是序列特异性的。
17．按照权利要求16的释放系统，其中的组织是肝。
全文摘要
用于将生物学稳定的、非离子型寡脱氧核苷类似物组织特异性释放到细胞中的寡脱氧核苷膦酸甲酯新糖肽缀合物及相关化合物。
文档编号A61K48/00GK1211923SQ96199495
公开日1999年3月24日 申请日期1996年11月22日 优先权日1995年11月22日
发明者P·O·P·提所, J·J·汉格兰德, Y·C·李 申请人:约翰斯·霍普金斯大学