专利名称：软骨/骨诱导性修复用材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗骨折或骨缺损的软骨/骨诱导性修复用材料。更详细地说，本发明涉及含有骨诱导因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的软骨/骨诱导性修复用材料。
背景技术：
作为软骨/骨的修复方法，除患者本身的自体移植外，还可以采用在患部埋入由骨诱导因子和适当载体组成的软骨/骨缺损部位修补剂的方法来进行。在这种情况下，为了能在外科手术时让患部露出并直接在患部施用含有骨诱导因子的软骨/骨修复用材料，广泛采用了易于操作的块状物、海绵体和薄板材等固体形态。此外，也可以使用凝胶或膏状物等半固体形态。作为使这些固体或半固体形态成为可能的载体，利用了不锈钢和钛合金等金属或胶原和羟基磷灰石(HAP)或这些的混合剂等。
另一方面，也有人尝试了在骨折或变形关节症等的治疗中给药骨诱导因子，以使外科手术成为不必要。这种给药形态，从非侵袭性给药即注射剂形态能减轻患者的痛苦这一点来看，是人们迫切希望的。然而，若以这种形态给药单纯的骨诱导因子水基液剂，则会引起给药后药物扩散消失，因此，为了高效率地给药骨诱导因子，有必要让骨诱导因子在注射部位滞留一定时间。为此，设想了一种载体，使之在给药时呈能用针注射的液状，而在给药后发生相变而呈凝胶状，从而使骨诱导因子滞留在患部。作为这种载体，较好的是没有毒性、与生物体的适合性良好、活体内吸收性高者。
迄今为止，作为骨诱导因子的载体，胶原是已知的，而且证实有良好的生物体适合性和活体内吸收性(特公平5-75425号)。进而，可以注射的、与胶原的组合也是已知的，因而有可注射的软骨/骨形成材料的可能性(特公平7-23322号和特公平5-53140号)。然而，现在作为医药品可供利用的胶原，因其来源是牛或猪等天然来源的材料，因而其分子量、氨基酸组成量、保水量等不是恒定的。此外，这些胶原由于是与人体中不同种的蛋白质，因而有抗原性等的副作用。特别是关于抗原性，即使使用去除了胶原的末端肽部位的非末端胶原，也不能完全没有(J.American Academy of Dermatology 10，638-646和647-651，1984和J.American Academy of Dermatology21，1203-1208，1989)。
另一方面，已知可以用聚乳酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物等可生物降解聚合物作为医药用载体(美国专利5385887号和特公平6-22570号)。但是，这些可生物降解聚合物的形状是固体形态或半固体形态的，从保持一定形态这一点而言，属于适用于外科手术时的材料群。即使可以用这样的可生物降解聚合物制作可注射的复合体，在其制造步骤中也不能不使用有机溶剂，因而很容易预测有效成分骨诱导因子的失活会成为问题。
发明公开本发明的目的是要提供能克服如上所述的先有技术方法的不利点乃至缺点，生物体内吸收性高、与有效成分骨诱导因子的亲合性良好，通过引起温度依赖型溶胶-凝胶可逆变化而使骨诱导因子的药效持久，而且抗原性等的副作用少的软骨/骨诱导性修复用材料。
本发明者等人在不必进行外科手术的骨修复方法方面对成为有效成分的骨诱导因子与其载体的关系进行了锐意探讨，当时发现某种聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类中有生物体内吸收性高、与骨诱导因子的亲合性良好、能引起温度依赖型溶胶-凝胶可逆变化者。本发明者等人还发现，在聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类水溶液中混合骨诱导因子，制成给药时在1℃～30℃可以注射的液体、给药后3分钟以内在37℃左右能凝胶化的骨形成材料，经小鼠大腿部肌肉内给药后能使骨诱导因子保持在给药部位，在此有异位软骨/骨形成能力，从而完成了本发明。
本发明涉及含有聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类与骨诱导因子的软骨/骨诱导性修复用材料。
所谓聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类，是以亲水性低的聚二醇为疏水基、以环氧乙烷为亲水基加成的高分子量非离子型表面活性剂的总称，通过改变聚丙二醇的分子量和与环氧乙烷的混合比，可以构成有各种特性的表面活性剂。可以合成的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的组成是聚丙二醇的分子量在900～4000的范围、总分子中环氧乙烷的重量是5％～90％。例如，旭电化公司制的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类(ADEKA)是按照聚丙二醇的分子量和加成环氧乙烷的重量比系统命名的，其分类图表示在
图1中。
聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类在产业上的利用，除作为一般洗涤剂、消泡剂使用外，在医药领域中可用于缓泻剂、软膏基剂、人造血液、锭剂包衣、赋形剂、注射剂增溶剂和溶解促进剂等。尤其普郎尼克F-68(聚丙二醇的分子量1750、环氧乙烷含量80％)的抗溶血作用显著，已由绿十字公司以EXOCOPOL名称作为血液体外循环用添加剂销售。从各种动物的毒性试验结果来看，显然聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的毒性和刺激性是极低的，也没有关于显示抗原性等副作用的报告(FragranceJournal 7，82-87，1974)。毒性试验的结果列于表1中。
表1ADEKA普郎尼克的急性毒性试验结果ADEKA普郎尼克动物种LD50(g/kg)L-44，L-62，L-64 大鼠 5F-68 小鼠 ＞15F-68 大鼠、兔、狗 无急性毒性反应P-85 大鼠 34.6另一方面，在使用上，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类就显示可逆溶胶-凝胶相变这一点而言也比胶原的温度变化时发生不可逆相转移优异。这种性质可以通过选择能使显示相变的温度达到最佳的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类和改变该聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的水溶液浓度来控制。(Int.J.Pharm.22，207-218，1984，EP 0551626A1号)。
从以上所述可见，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类有作为医药用载体的优异资质，也已经进行了与局部麻醉剂、抗癌剂等低分子量药物组合(Int.J.Pharm.8，89-99，1981和Chem.Pharm.Bull.32，4205-4208，1984)和混合间白细胞素等高分子量生理活性蛋白质的尝试(Pharm.Res.9，425-434，1992)。
本发明涉及含有聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类和骨诱导因子的软骨/骨诱导性修复用材料，并涉及作为聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类构成成分的聚丙二醇的分子量在约1500～4000范围内且环氧乙烷含量在约40～80％/分子的范围内的软骨/骨诱导性修复用材料。如果在这种构成成分范围内，就会成为能表现出本发明普郎尼克特性的温度依赖型溶胶-凝胶可逆变化的普郎尼克。
进而，本发明还涉及呈水溶液形态、以上所述聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类水溶液浓度为约10～50％的软骨/骨诱导性修复用材料。也已知，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的可逆变化温度一般是以水溶液的配制浓度等而异的，而且处于上述构成成分范围内的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类在体温附近即37℃左右能引起凝胶化的水溶液浓度范围为约10～90％。作为最好的实例，配制了聚丙二醇分子量3850、环氧乙烷含量为70％的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类(普郎尼克F-127)的15～30％水溶液。
所谓骨诱导因子(Bone morphogenetic proteinBMP)，系指具有能使未分化间质细胞诱导成软骨细胞并形成骨组成的活性的蛋白质。
作为本发明中使用的骨诱导因子的实例，可以列举属于TGF-β基因超级家族的BMP-2～BMP-9等一系列蛋白质，称之为MP-52的蛋白质、称之为GDF-5的蛋白质等，但不限于这些。作为BMP-2，是按照Wang等人报告的遗传工程技术用中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary，CHO)细胞生产的蛋白质BMP-2(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2220-2224，1990和US4877864号)，而作为MP-52，是按照本发明者等人提出的遗传工程技术制造的新型蛋白质MP-52(特愿平7-93644号)，这些都是特别好的。这种新型蛋白质可以按如下得到构筑一种质粒，使之含有在能使从MP-52产生的序列表中1号序列所述氨基酸序列编码的DNA序列的N末端上加成了能使甲硫氨酸编码的密码子的DNA；使该质粒在大肠菌中发生形质转换；培养该大肠菌，得到一种内含体；使该内含体增溶、精制，得到一种单体蛋白质；然后使该蛋白质再生成二聚体，再将其精制。
把以BMP-2和MP-52为有效成分的15-30％聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类水基溶液注射到小鼠大腿部肌肉内，给药后使MP-52保持在给药部位，然后观察异位软骨/骨形成能力。
这样由聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类与骨诱导因子的组合组成的软骨/骨诱导性修复用注射材料迄今为止未见报告，且作为软骨/骨修复、尤其骨折治疗剂是有效的。
本发明进一步涉及含有骨诱导因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的软骨/骨修复剂。
此外，本发明还涉及软骨/骨修复治疗方法，其中包括在人体或动物的骨折或骨缺损部位施用含有骨诱导因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的软骨/骨修复剂。
附图简单说明图1是ADEKA普郎尼克分类图。横座标以重量％表示聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类总分子中的环氧乙烷含量，纵座标表示聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的构成成分中聚丙二醇的分子量。
图2是实施例4得到的小鼠右后足大腿部的骨/软骨石灰化组织的软X射线照片。(a)只注射ADEKA普郎尼克F-127，(b)注射含有MP-52的ADEKA普郎尼克F-127，分别在给药后2周拍摄的照片。肌肉内显黑的部分是异位形成的骨基质。
图3是实施例4得到的小鼠右后足大腿部的非脱灰切片组织染色显微镜照片。可以确认，在von-Kossa染色(a)中有骨基质形成，而在苏木精-曙红染色(b)中有伴随着骨芽细胞的骨基质形成和骨髓形成。
图4是参考例1(2)得到的蛋白质MP52表达载体(pKOT245)的质粒图。
发明的最佳实施形态以下提供实施例和参考例，以具体地说明本发明的效果。要注意的是，本发明不受这些实施例限制。
实施例1 含有BMP-2的软骨/骨诱导性修复用材料的制备方法已经知道ADEKA普郎尼克F-127(旭电化工业公司)是聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类中毒性最小的之一(制药工场6，875-880，1986)。这种ADEKA普郎尼克F-127 3.0g在冰冷却下溶解于注射用蒸馏水7.0g中，配制30％ADEKA普郎尼克F-127水溶液。在冰冷却下把ADEKA普郎尼克F-127水溶液以360μl/孔分注于96孔滴板中，并向各孔中滴加含有80μg BMP-2的0.01N HCl 40μl，混合后在4℃通过0.22μm过滤器灭菌，制成总量约400μl的BMP-2注射剂(ADEKA普郎尼克F-127的最终浓度是27％)。同样也制作ADEKA普郎尼克F-127的最终浓度为10％、15％、18％和22.5％的BMP-2注射剂。
其结果，ADEKA普郎尼克F-127最终浓度27％的可以在5℃以下注射，ADEKA普郎尼克F-127最终浓度22.5％的可以在10℃以下注射，ADEKA普郎尼克F-127最终浓度10％～18％的可以在25℃以下注射，而在37℃能相变成凝胶状的ADEKA普郎尼克F-127注射剂是最终浓度为15％以上的制剂。因此，在室温呈液状而在37℃显示凝胶状的ADEKA普郎尼克F-127最终浓度18％的制剂是最好的。
实施例2含有MP52的软骨/骨诱导性修复用材料的制备方法同实施例1使用BMP-2的软骨/骨诱导性修复用材料的制备方法一样，制作ADEKA普郎尼克F-127最终浓度为10％、15％、18％、22.5％和27％的MP52注射剂，其结果，即使用MP52，也能得到同BMP-2的情况一样的注射剂，即ADEKA普郎尼克F-127最终浓度27％可以在5℃以下注射、ADEKA普郎尼克F-127最终浓度22.5％可以在10℃以下注射、ADEKA普郎尼克F-127最终浓度10％-18％可以在25℃以下注射的制剂。
实施例3 活体中软骨/骨诱导性修复用材料给药后的MP52残留性在麻醉下，用23G针，对雄性小鼠(ICR品系，8周龄)的右后足大腿部经肌肉内给药在实施例2的处方中添加125I标记MP52、以同样方式制作的18％、22.5％和27％ADEKA普郎尼克F-127最终浓度的125I标记MP52注射剂100μl(约37KBq125I-MP52/部位)，观察0.5、2和8小时后右后足放射性衰减残存率。作为对照，用125I-MP52水溶液注射剂。结果列于表2中。
表2ADEKA普郎尼克F-127制剂(最终浓度18％ADEKA普郎尼克F-127)或水溶液剂给药后在右后足中125I-MP52的残存率时间(小时)普郎尼克制剂水溶液剂0.5 60.5％ 32.7％2 19.7％ 13.8％8 14.9％ 7.9％
从表2可以看出，在用聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类作为医药用载体的情况下，与在只注射MP52水溶液的情况下比较，显然能保持更多的残存MP52药物。此外，即使对于实施例1的注射剂，也得到了同样的结果。
实施例4异位软骨/骨形成能力的药效试验在麻醉下，用23G针，对雄性小鼠(ICR品系，8周龄)的右后足大腿部经肌肉内给药实施例2制作的18％ADEKA普郎尼克F-127最终浓度的MP52注射剂100μl(20μg MP52/部位)。此时作为对照，使用了不含有MP52的ADEKA普郎尼克F-127注射剂。软骨/骨形成的判断在给药2周后进行。小鼠用颈椎脱臼法宰杀后，切出有给药部位的右后足，用软X射线照射器拍摄照片，确认给药部位有无骨形成。结果列于图2中(n＝5)。软X射线照像的结果表明，当只有ADEKA普郎尼克F-127(图2-a)时，在有给药部位的肌肉内没有观察到阴影，但在用含有MP52的ADEKA普郎尼克F-127(图2-b)进行试验的动物中，80％以上可以确认有明显阴影。
此外，在软X射线照像结束后，把样本保存在10％福尔马林中，并实施组织学检查。图2-b中显示的5只小鼠中右端小鼠的组织染色显微镜照片表示在图3中。图3中从von-Kossa染色(图3-a)可以观察到阴影部分有钙沉积，而从苏木精-曙红染色(图3-b)的结果可以确认能分辨出骨芽细胞、骨基质和骨髓的骨形成。而且没有观察到炎症反应。图中的BM、OB和MA分别表示骨基质、骨芽细胞和骨髓。
对于实施例1制作的18％ADEKA普郎尼克F-127最终浓度的BMP-2注射剂实施同样的试验时，得到了同样的结果。
从以上结果可以确认使用聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类作为骨形成因子的载体时的安全性、有用性。
参考例 新型蛋白质MP52的制备1.载体(vector)的制作(1)变异型MP52成熟型部分的分离人体MP52 cDNA是以含有WO 93/16099中所述cDNA的质粒载体(pSK52s)作为模板DNA，只使成熟部分发生聚合酶链式反应(PCR)来增幅的。
按照通过提高起始密码子ATG周围的AT含量来提高目标蛋白质的生产率的方法{M、Nobuhara等人的报告(Agric.Biol.Chem.，52(6)，1331-1338，1988)}，使成熟型MP52基因的一部分DNA置换。
置换方法是用2号序列顺向PCR引物，以PCR法进行的。PCR引物的DNA序列用2号序列所示DNA作为顺向引物而用3号序列所示DNA作为逆向引物。
PCR是通过在同一试管中一起添加模板DNA(10纳克)、顺向和逆向PCR引物各50皮摩尔、dNTP(0.2毫摩尔)和MgCl2(1.5毫摩尔)以及Taq DNA聚合酶(5U)进行的。
进行30周期的PCR，每个周期都包括变性(94℃，1分钟)、引物退火(55℃，1分钟)和引物伸长(72℃，2分钟)(以下的PCR都在这种条件下进行)。
PCR反应的生成物在1.5％低熔点琼脂糖(FMC公司)中进行电泳分离，切出由相当于1号序列的氨基酸序列的约360bp组成的DNA(以此作为片断1)。
(2)本发明蛋白质的大肠菌表达载体的构筑为了提高质粒的复制数，把复制源从pBR细胞系改变成pUC细胞系。用市购大肠菌表达载体pKK223-3(购自Pharmacia Biotech公司)的tac启动区限制酶SspI和EcoRI消化后，用绿豆核酸酶(宝酒造公司，产品目录号2420A)处理，在片断1的起始密码子一侧结合T4DNA连接酶(宝酒造公司，产品目录号2011A)，用pKK223-3的rrnBT1T2终止区限制酶Sal I和Ssp I消化，通过结合到用Sal I消化的片断1的终止密码子一侧和组入pUC18的Sma I部位，便构筑了用于本发明蛋白质生产的表达载体(pKOT245)(图4)。这种载体于1995年4月14日寄存在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)，寄存号为FERMP-14895号，1996年4月10日移交基于布达佩斯条约的寄存(FERMBP-5499)。pKOT245的DNA长度为3.7kb。制作的本发明蛋白质表达载体是借助于Pharmacia ALF DNA定序机进行其碱基序列测定的。
(3)形质转换形质转换按照Kushner等人的氯化铷法(Genetic Engineering，p17，Elsevier(1978))进行。即，按照以上提到的程序使pKOT245移入宿主大肠菌W3110M中，制成能生产本发明蛋白质的大肠菌。
2.培养(1)培养本发明蛋白质表达大肠菌用改进SOC培养基(Bacto胰蛋白胨20g/l，Bacto酵母提取物5g/l，NaCl 0.5g/l，MgCl2·6H2O2.03g/l，葡萄糖3.6g/l)进行预培养。相对于生产用培养基(Bacto胰蛋白胨5g/l，柠檬酸4.3g/l，K2HPO44.675g/l，KH2PO41.275g/l，NaCl 0.865g/l，FeSO4·7H2O 100mg/l，CuSO4·5H2O lmg/l，MnSO4·nH2O 0.5mg/l，CaCl2·2H2O 2mg/l，Na2B4O7·10H2O0.225mg/l，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1mg/l，ZnSO4·7H2O2.25mgl，CoCl2·6H2O 6mg/l，MgSO4·7H2O 2.2g/l，硫胺素·HCl 5.0mg/l葡萄糖3g/l)5L而言添加菌体悬浮液100ml，在10L培养槽中边通气搅拌边培养，在达到对数增长前期(OD550＝5.0)阶段以1mM的浓度添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，进一步培养直至OD550达到150为止。培养中，温度控制在32℃，添加氨使pH控制在7.15，为防止溶解氧浓度降低，通过提高搅拌速度把溶解氧浓度控制在空气饱和的50％。而且，为了达到高菌体浓度，以溶解氧浓度急激上升为指标，边以0.2％浓度添加50％葡萄糖边培养。
(2)大肠菌内含体的制备用上述方法得到的培养液离心分离回收菌体，然后悬浮在含有10mM乙二胺四乙酸的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.3)中，用菌体破碎装置(Gohlin公司制)使细菌破碎，再次离心分离，回收含有内含体的沉淀。
3.精制(1)大肠菌内含体的增溶大肠菌内含体用1％Triton X-100洗涤3次后，以3000xg在4℃离心分离30分钟，得到的沉淀物在超声波作用下用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.3)、8M脲、10mM DTT、1mM EDTA增溶。
(2)单体精制其增溶液以20000xg在4℃离心分离30分钟，回收其上清液。得到的上清液通过用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、6M脲、1mMEDTA平衡的SP-Sepharose FF(Pharmacia公司)，用同溶液洗涤后，用含有0.5M食盐的同溶液溶出。溶出液中添加Na2SO3和Na2S4O6，使其最终浓度分别为111mM、13mM，在4℃进行15小时磺化。磺化溶液以用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、6M脲、0.2M食盐、1mM EDTA平衡的Sephacryl S-200HR(Pharmacia公司)进行凝胶过滤，得到单一磺化的本发明蛋白质单体。
(3)再折叠(Refolding)向磺化的本发明蛋白质单体溶液中添加9倍量的50mM甘氨酸钠缓冲液(pH9.8)、0.2M氯化钠、16mM CHAPS、5mM EDTA、2mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)之后，在4℃搅拌1天，进行再折叠。
(4)二聚体精制再折叠的试样用纯水稀释2倍，加6N盐酸使pH达到约7.4，进行等电点沉淀。沉淀物以3000xg离心分离20分钟收集后，溶解在30％乙腈、0.1％TFA中。其溶液用纯水稀释2倍，通过用0.05％TFA、25％乙腈平衡的逆相HPLC的RESOURCE RPC柱(Pharmacia公司)，用0.05％TFA、25～45％乙腈梯度洗脱。洗脱液用吸光度光度计借助于280nm吸光度监测，得到精制的本发明蛋白质二聚体级分。用Speedback Concentrator(Servan公司)使其冷冻干燥。
(5)精制的本发明蛋白质的理化性质测定(a)N末端氨基酸序列分析上述得到的精制的本发明蛋白质用476A型氨基酸定序机(AppliedBiosystems公司)分析时，确认了序列表中1号序列所示从N末端到第30个氨基酸的氨基酸序列。
(b)氨基酸组成分析用氨基酸分析仪〔PICO TAG系统(Waters公司)〕考察以上得到的精制的本发明蛋白质的氨基酸组成。其结果列于表3中。表中所列的数值表示每一个单体的氨基酸残基数。
表3氨基酸 实测值 期待值Asx 11.5 12Glx 10.9 11Ser 8.4 9Gly 4.3 4His 4.0 4Arg 7.7 7Thr 5.4 6Ala 7.3 7Pro 10.2 10Tyr 2.9 3Val 5.7 7Met 5.1 4Cys2.6 7Ile 4.9 6Leu 10.0 10Phe 4.0 4Lys 5.9 6Trp -2序列长度 119一不可能检出(c)电泳分析采用非还原条件下的SDS-PAGE确认上述得到的精制的本发明蛋白质的分子量时，显示约28KDa的分子量。
以上(a)、(b)和(c)显示的结果表明，本发明蛋白质是N末端单一地从Pro开始的119个残基组成的蛋白质。
产业上利用的可能性本发明的软骨/骨诱导性修复用材料可在一种不需要外科手术的骨折疗法中施用于患部，因其在活体内吸收性高、与有效成分骨诱导因子的亲合性良好、能发生温度依赖型溶胶-凝胶可逆变化而操作简便，不会给患者带来外科手术的痛苦。本发明还能提供骨诱导因子药效持久、进而副作用少的软骨/骨诱导性修复用材料。
序列表序列序号1序列长度119序列类型氨基酸拓扑学直线状序列种类肽片断类型N末端片断起源生物名人类(homo sapiens)组织种类人类胎儿序列特征存在位置其它信息MP52氨基酸序列从第383号到第501号的氨基酸序列。
序列CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT 48Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala5 10 15CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG 96Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp20 25 30GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG 144Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu35 40 45GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT 192Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His50 55 60GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA 240Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro65 70 75 80CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe85 90 95ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val100 105 110GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 357Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg115序列序号2序列长度27序列类型核酸链数一条链拓扑学直线状序列种类其它核酸起源无生物名无株名无序列特征MP52成熟型分离用顺向PCR引物。序列ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC 27序列序号3序列长度26序列类型核酸链数一条链拓扑学直线状序列种类其它核酸起源无生物名无株名无序列特征MP52成熟型分离用逆向PCR引物。序列CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT 2权利要求
1.软骨/骨诱导性修复用材料，其中包含聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类和骨诱导因子。
2.权利要求1所述的软骨/骨诱导性修复用材料，其中作为聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类构成成分的聚丙二醇的分子量在约1500～4000的范围内，环氧乙烷含量在约40～80％/分子的范围内。
3.权利要求2所述的软骨/骨诱导性修复用材料，呈水溶液形态，且聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类在水溶液中的浓度是约10～50％。
4.权利要求1～3中任何一项所述的软骨/骨诱导性修复用材料，其中骨诱导因子是蛋白质BMP-2。
5.权利要求1～3中任何一项所述的软骨/骨诱导性修复用材料，其中骨诱导因子是蛋白质MP52。
6.骨折/骨缺损治疗剂，其中包含聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类与骨诱导因子。
7.骨折或骨缺损的治疗方法，包括把含有聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类与骨诱导因子的骨折/骨诱导性修复用材料施用于人类或动物的骨折或骨缺损部位。
全文摘要
含有骨诱导因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的软骨/骨诱导性修复用材料。在一个特别好的实例中,构成聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类的聚丙二醇的分子量在约1,500～4,000的范围内,环氧乙烷单元的重量比在约40～80%/分子的范围内,聚氧乙烯单元的重量比在约40～8090分子的范围内,聚氧乙烯聚氧丙烯二醇类在水溶液的浓度是约10～50%。这些材料可用于软骨/骨诱导方法而无需任何手术。由于其组成为一种骨诱导因子和一种在活体内容易吸收、可与骨诱导因子高度兼容且能发生温度依赖型可逆溶胶—凝胶变化的载体,因而它们可高度适用于骨折和骨缺损部位,从而产生优异的治疗效果。
文档编号A61K38/18GK1207047SQ96199564
公开日1999年2月3日 申请日期1996年11月14日 优先权日1995年11月17日
发明者志村武贞, 鸟山五月 申请人:赫斯·马里恩·鲁索株式会社