专利名称：对治疗rsv感染有效的rna酶l激活剂和反义寡核苷酸的制作方法
本申请要求受益于美国发明申请序列号60/011,725,1996年2月15日提交。1．发明领域本发明涉及可用于治疗人类呼吸道合胞病毒，一种负链RNA病毒，感染的化合物和其使用方法。特别是本发明涉及一个和RSV的反基因组链一部分互补的寡核苷酸和一个共价连接的RNA酶L的激活剂的复合物(此后，称之为“反义激活剂复合物”)。更特别地，本发明涉及反义激活剂复合物，其中选择的寡核苷酸结合于RSV反基因组链通常无自身杂交二级结构的一部分。2．发明背景呼吸道合胞病毒(RSV)，一种非片段，负链RNA病毒，属于副粘病毒科肺病毒属，是一种广泛传播的人类病原体，世界范围内每年引起超过一百万人死亡(McIntosh和Chanock 1990)。其中主要的严重病例是发展中国家的儿童，美国估计每年有300,000住院病例(Zisson,1993)。据估计呼吸病毒感染引起的肺炎造成儿童死亡62％归因于RSV(Heilman,1994)。唯一证实的RSV的治疗是雾化病毒唑(1-b-D-呋喃核糖-1,2,3-三唑-3-碳酰胺)。病毒唑以吸入方式的气雾剂给药。病毒唑治疗有几个局限包括临床应用的低效率，病人周围需要气罩，堵塞通气单元的可能，某些动物模型中观察到的致畸作用(Froelich,1994)，明显的副作用和高费用。
RSV在多种类型的小泡细胞中复制，包括巨噬细胞和上皮系细胞(Panuska等，1992,Midulla等，1993)。因此，病毒唑通过吸入气雾剂对RSV感染个体用药。Taber等，1983，儿科学72:613-18；Hall等，1983，新英格兰医学杂志308:1443-7；Englung等，1994，儿科学杂志125:635-41。
反义激活剂复合物(称为“2-5A:AS”)前已述及(Torrence等1993,WO94/09129出自Torrence等)。尽管反义寡核苷酸已用作抗病毒药物，例如抑制HIV复制，参见Zamecnik等，1986；Goodchild等，1988；Letsinger等，1989；Balotta等1993；抑制RSV感染，WO95/22553，出自Killkuskie等，还没有成功应用反义激活剂复合物作为抗病毒治疗的例子的报道。
反义激活剂复合物的作用机制与其它反义寡核苷酸的作用机制不同。反义激活剂复合物的激活剂部分激活RNA酶L且反义区作为靶RNA的特异的，高亲和力结合位点。结果是靶RNA被RNA酶L选择性剪切。
生理上，RNA酶L作为干扰素系统的一部分在高等脊椎动物的细胞中在限制病毒复制中起作用(Silverman综述，1994)。对细胞的干扰素治疗激活编码2-5A合成酶的基因，该酶是双链RNA(dsRNA)依赖的从ATP合成5’-三磷酸化的，2’,5’-连接的寡聚腺苷酸(2’,5’A)的酶。病毒dsRNAs是这些酶的潜在激活剂(Gribaudo等，1991)。2’,5’A结合并激活RNA酶L导致细胞和病毒RNA的普遍剪切；这样限制一些小核RNA病毒的复制(Chebath等，1987；Rysiecki等，1989；和Hassel等，1994)。
RNA酶L非特异剪切病毒RNA。例如，在干扰素治疗脑心肌炎病毒感染细胞中，RNA酶L引起核蛋白体RNA降解(Wreschner等，1981)。通过反义激活剂的作用，RNA酶L由非特异核酸酶转变为高度特异的选择性剪切mRNA靶的核酸内切酶。这已在来自Daudi细胞，一种人类淋巴瘤细胞株，的无细胞体系中证实，其中一个修饰的HIV-1 vifmRNA被定为反义激活剂复合物剪切的靶(Torrence等，1993)。接着，纯化的RNA酶L由反义激活剂复合物指导在非靶mRNA存在时选择性剪切一编码蛋白激酶PKR的mRNA靶(Maran等1994)。进一步，在HaLa细胞中，应用针对PKR mRNA的一段序列的反义激活剂复合物导致PKRmRNA和酶活性的切除(Maram等，1994)，这样dsRNA介导的转录因子NF-kB激活被解除。最近，发现反义激活剂复合物激活RNA酶L导致PKR mRNA的催化降解(kcst大约7秒-1)(Maitra等，1995)。3．发明概述本发明提供了可用于治疗RSV感染的复合物。复合物的基本元件是具有与一RSV株的反基因组RNA链(即，基因组合成的模板链)的大约10到大约30个核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，和RNA酶L的激活剂(此后称之为“反义激活剂复合物”)。反义激活剂复合物的元件优选由连接臂(linker)共价连接。
在一可选方案中，本发明包括一非共价连接的复合物，其包括一个或两个激活的RNA酶L分子和至少一条和RSV反基因组RNA链的大约10到30个核苷酸互补的反义寡核苷酸(此后，称之为“反义酶复合物”)。在进一步可选方案中本发明包括含有至少10-30核苷酸的序列并优选15-25核苷酸，更优选18或19个核苷酸的反义寡核苷酸。
本发明的反义激活剂复合物穿过细胞膜不用载体或渗透剂。一旦内化反义激活剂复合物导致反义酶复合物的形成，它引起反义定靶RNA的破坏。为治疗RSV感染，反义复合物可通过气雾吸入给药，与病毒唑(ribavirin)给药方法相同。病毒唑和本发明的反义复合物因此可以普通药学组成给药。4．附图简述
图1:1-1:10。RS病毒株A2的序列，以5’-3’方向计数位置。
图2A-2H:3.RSV反基因组RNA部分的二级结构MFOLD计算波状图输出，以5’-3’顺序计数位置。图2A.RSV反基因组RNA的7900-8800残基的波状图。图2B:1-2B:3.RSV反基因组RNA的1-1124残基的三个可选波状图。图2C:1-2C:3.RSV的1100-2400残基的三个可选波状图。图2D:1-2D:3.RSV反基因组RNA的2200-3300残基的三个可选波状图。图2E:1-2E:2.RSV反基因组RNA的3100-4300残基的二个可选波状图。图2F:1-2F:3.RSV的4200-5599残基的三个可选波状图。图2G:1-2G:3.RSV反基因组RNA的5600-6999残基的三个可选波状图。图2H:1-2H:3.RSV反基因组RNA的6600-7999残基的三个可选波状图。
图3.spA4-抗RSV3’-3T/(8281/8299)和spA2-抗RSV3’-3T/(8281/8299)的抗-RSV活性比较。5．发明详述本发明的一实施方案包括RNA酶L激活剂和寡核苷酸的共价连接复合物，寡核苷酸能结合到RSV的反基因组模板RNA链和/或结合到一种RSV蛋白的mRNA(一种“RSV反义寡核苷酸”)。本发明的一可选方案包括非共价连接的激活的RNA酶L和RSV反义寡核苷酸的复合物。
在优选方案中反义寡核苷酸和通常是单链的RSV反基因组的一部分互补。激活剂通过连接臂和反义寡核苷酸的5’或3’末端连接。在一实施方案中，一个阻断剂连接到反义寡核苷酸的3’末端且连接臂接到反义寡核苷酸的5’末端。在一可选方案中连接臂连接到反义寡核苷酸的3’末端，既作为连接臂又作为阻断剂。反义寡核苷酸长度在大约15到大约20核苷酸之间且优选18或19核苷酸长。本领域熟练技术人员能理解富含GC的寡核苷酸可比含GC少的寡核苷酸短。
根据本发明，与反义寡核苷酸互补的一RSV株的反基因组部分可由此RSV株的序列和二级结构计算法如MFOLD确定。合适的RSV反基因组部分一般是单链构象，例如，形成茎的环和RNA二级结构环。
由于RSV是一种负链病毒，反义寡核苷酸不仅和反基因组RNA互补，还和指导病毒蛋白翻译的mRNA互补。
反义寡核苷酸核苷酸间的磷酸二酯键可以是适合与互补RNA形成Watson-Crick碱基对的任何键。这些非限制性例子包括磷酸二酯，硫代磷酸二酯，甲基磷酸二酯和甲基硫代磷酸二酯，它们可增加给药后的抗降解能力。反义寡核苷酸的核苷酸可以是2’-脱氧核苷酸或2’O-甲基核苷酸。
5.1反义寡核苷酸序列的确定RSV株A的序列在图1:1-1:10中，以5’-3’方向给出。本发明可由按病毒株A2指导的寡核苷酸例证，但本发明可以其它任何有已知的基因组序列RSV株实施。RSV反基因组RNA序列可由常规技术获得。RSV是具有多个基因的负链RNA病毒，即病毒颗粒含有编码链的补充。进入宿主细胞后基因组转录产生各种编码病毒蛋白的mRNA并产生一完整的互补RNA,RSV反基因组，后代病毒的基因组链从中转录。根据本发明选择反义寡核苷酸的序列以便反义激活剂复合物的结合并由此引起RSV反基因组的催化破坏或mRNA的改变。这里所用的词“反基因组链”，“RSV反基因组”和“RSV mRNA”是同义词。
这样，在本发明的一实施方案中选择本发明的反义寡核苷酸的序列以便反义寡核苷酸和RSV反基因组的一部分互补并与之结合，即反义激活剂复合物使激活的RNA酶L定靶于与反义寡核苷酸互补的RSV反基因组部分。单链RNA分子含有通过自身杂交多聚物“反折”的区域。这些自身杂交双链RNA区(“茎”)与单链“环”和“泡”可分开。这样，并非RSV反基因组的所有部分都易于以同样亲和力结合反义寡核苷酸，并非RSV反基因组的所有部分适于做反义激活剂复合物的靶点。
鉴于本发明的目的，RNA分子的哪一部分是茎，哪一部分是环或泡可以通过位于公用区的计算机模拟程序如“FoldRNA”或“MFOLD”确定(例如，通过生物计算室，生物系，印地安那大学，Boomington，印地安那州)。这些程序系统分析了所有可能的构象并确定了热力学最优化的构象，即具有最低的“自由能”。常规地，具有与优化构象5％或10％以内自由能差别的构象也被确定。多数情况这些近似优化构象是互相紧密联系的。例如某个小泡的位置可以有一两个核苷酸的区别。如这里所用，当单链构象具有最低自由能或相当于最低自由能的自由能时一条RNA链被称为“正常单链”。
这些程序所实施的计算法在Zuker等，1989，科学244:48中描述。按照Zuker的计算法，计算一个聚核苷酸的最低自由能态所需的步数和聚核苷酸的长度的立方成比例。目前，2KB的聚核苷酸构象可以常规计算而计算整个RSV反基因组全长(约15KB)的聚核苷酸是负担沉重的。
然而，由于聚核苷酸分子间的杂交的动态，尽管模拟程序提示可能提供更低的自由能态，相隔很远的聚核苷酸的部分之间事实上也不可能形成杂交构象。这样计算整个RSV反基因组的热力学最稳定构象是不能满足实际目的的。而为了本发明的目的，RSV反基因组的构象可以用约1-2KB长的片段来计算。如果预测的一RSV反基因组的特定部分的构象依赖被模拟的核苷酸片段的长度或边界，那么更短片段的模拟程序，长度大于1KB，和该部分定位于最接近片段中间的片段可认为是“正常”发生的构象。
在选择反义基因组的哪一部分作为适合靶点时有以下几个主要考虑。
1．由于RNA酶L只对单链序列而不对双链序列有活性，在所选RNA靶序列附近有明显的非碱基对或最少碱基对核苷酸延伸是重要的。
2．由于RNA酶L优选在UNp序列后切割，优选有可能发生切割的单链区应该含有尿苷。这是优选而非必需的，因为已有显示反义激活剂复合物可以直接切割其它核苷酸。Maran等，1994。
3．由于切割发生在RNA靶序列的5’一侧，优选含尿苷的单链区在靶序列的5’一侧。
4．由于反义激活剂复合物的反义区必须和RNA靶序列形成双螺旋复合物，优选靶序列定位于靶RNA的单链或主要是单链区。这是根据这样的复合物形成是一平衡过程的考虑，且根据特定靶序列内二级结构的程度和稳定性，该过程的缔合常数的数值有所降低。
5．由于上述(4)所述原因，用Zuker的MFOLD计算法得出一组近似合理的RNA二级结构。能量上有微小差别的一系列结构可利用此程序产生。典型地，折叠程序产生的二级结构有0.1千卡/摩尔增加的区别，即在能量方面是极为相似的。
6．上述(1-5)的考虑导致对靶DNA中最优化靶序列的搜寻。理想的靶点中作为反义结合位点的整个序列和RNA上游至少16且优选至少21核苷酸区是完全单链的。因此在理想情况下优选靶位点长度应为反义区长度(如，18)加16等于34核苷酸。这样，搜索至少34核苷酸长且更优选至少45核苷酸长单链区以寻找潜在的靶RNA区。
7．设计反义激活剂复合物时一附加优化涉及反义寡核苷酸的组成。由于反义激活剂复合物催化性运作，必须有将复合物从其靶RNA互补序列上解离的必不可少的机制。这样，可以预期有大比例GC碱基对的双链进行解离比有大比例dA-rU或dT-rA配对的双链更困难。这个考虑也是一优选的设计考虑。
图2A显示mRNA或反基因组链的7900-8800残基的模拟结果。图2A也含有下面例子中测试过的反义寡核苷酸定位指示。图2B:1-2H:3分别显示RSV反基因组链的1-7999,1100-2400,2200-3300残基片段的可选模拟结果。显示每个区域具几乎相等能量的2或3个不同模型。这些图表明，例如优选方案中本发明的靶残基2490-2534，在所有三种模型中都是单链，残基617-663,3212-3247和5240-5288在至少两种模型显示中是单链，残基718-772在三种模型的一种中是单链。应该记得所产生的整个模型家族仅有1.1千卡/摩尔的区别，且因此每个模型代表的构象可在RSV反基因组证实。
5.2激活剂的结构激活剂结构的例子在专利WO94/09129中描述，在10,45和46-51页，在此引为文献参考。简要地说，激活剂含有至少三个腺苷酸残基，通过2’-5’磷酸二酯键连接，有一游离的5’一，二或三磷酸酯或硫代磷酸酯。5’硫代磷酸酯-四-腺苷酸激活剂(sp5’A2’(p5’A2’)3-O-)是优选激活剂。其它激活剂包括p5’A2’(p5’A2’)2-O-,sp5’A2’(p5’A2’)2-O-,和p5’A2’(p5’A2’)3-O-。
腺嘌呤核苷酸间硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯连接可以和磷酸二酯键一样应用。应用这些连接导致降解减慢但活性也降低。Beigelmann,L等，1995，核酸研究23:3989-94。应用5’-硫代磷酸酯导致活性和稳定性的巨大改善。本领域技术熟练人员了解其它核苷酸可以连到2’-5’三或四腺苷酸的3’羟基或2’羟基而不改变其作为RNA酶L激活剂的活性。这样，这些方案也被包括在所谓“RNA酶L的激活剂”的范围内。本领域技术人员进一步认识到也可以使用在第二核苷酸(由5’-3’计数)含有除腺嘌呤以外的碱基如次黄嘌呤核苷的寡核苷酸。本领域技术熟练人员可进一步认识到RNA酶L的非核苷酸激活剂可用于本发明且等效于核苷酸激活剂。如此处所用术语“2-5A”指RNA酶L的任何核苷酸激活剂且术语“RNA酶L的激活剂”指任何RNA酶L的激活剂包括2-5A。术语2’,5’A特指2’,5’连接的寡聚腺苷酸。
5.3反义寡核苷酸的结构反义寡核苷酸可以有任何反义领域现有的或将被发展的结构。这些包括磷酸二酯，硫代磷酸二酯，甲基磷酸二酯和甲基硫代磷酸二酯，使给药后降解阻力增加。反义寡核苷酸的核苷酸可以是2’-脱氧核苷酸或2’O-甲基核苷酸。
修饰和未修饰寡核苷酸的制备在本领域是熟知的(Agrawal等综述(1992)生物技术进展10:152-158；Agrawal寡核苷酸及其类似物的方法，合成及特点(Agrawal编)，Humana出版，Totowa，新泽西(1993),20章)。例如，核苷酸可以用本领域认可的技术例如氨基磷酸酯法，H-磷酸酯化学法，或甲基氨基磷酸酯化学法共价连接(参见，例如，Uhlmann等(1990)化学综述90:543-584；Agrawal等(1987)四面体快报28:(31):3539-3542；Caruthers等(1987)酶学方法154:287-313；美国专利5,149,798)。寡聚硫代磷酸酯类似物可以用本领域熟知的方法制备如甲氧基亚磷酰胺法(参见，例如，agrawal等(1988)美国国家科学院院刊85:7079-7083)或H-磷酸酯化学法(参见，例如，Froethler(1986)四面体快报27:5575-5578)。Bergot等(色谱杂志(1992)559:35-42)描述的合成方法可以应用。
5.4连接臂的结构任何共价连接RNA酶L激活剂和反义寡核苷酸且不阻止激活剂激活RNA酶L的连接臂都可使用。在优选实施方案中连接臂连接到2-5A激活剂的3’或2’末端。在进一步优化方案中连接臂包括一个连接2-6A激活剂的3’或2’末端和反义寡核苷酸5’或3’末端的双-1,4-丁二醇-磷酸二酯。选择连接到反义寡核苷酸的末端以便合成。本领域的技术人员知道连接到一个内部的2’羟基或对碱基成对不重要的核苷酸碱基的一部分是本发明的一可选方案。
5.5反义激活剂复合物的应用本发明的反义激活剂复合物可通过任何有效将反义激活剂复合物给药至患者的支气管，细支气管和肺泡上皮的路线给药至有RSV感染的个体。在一实施方案中反义激活剂复合物通过吸入气雾剂给药，按照本领域熟知的病毒唑给药技术。在本发明进一步的方案中病毒唑和本发明反义激活剂复合物的混合物可以用一般药用载体给药。
在一可选实施方案中反义激活剂复合物可通过胃肠道外给药，例如，通过静脉内输注。当静脉给药时，反义激活剂复合物的剂量可用药学工作者熟知的常规方法测定，以便血清浓度接近下文描述的体外实施例中所见的抗病毒活性的浓度，例如大约10μM的spA4-抗RSV3’-3’T/(8281-8299)的浓度。气雾剂给药时应选择剂量以便肺部组织浓度接近体外实施例中所见的抗病毒活性浓度。
实施例6．材料和方法序列惯例。
RSV文献实施中，RSV基因组(病毒RNA)的1位是3’末端，RSV反基因组(mRNA)的1位是5’末端。这样，例如，标记为反RSV/(8490-8509)的反义寡核苷酸具有RSV基因组的8509-8490残基的序列(5’-3’)，和RSV反基因组的8490-8509残基互补。但是注意，图1:1-1:10的RSV株A2基因组序列习惯为5’到3’顺序。此后其中激活剂是2’,5’A的反义激活剂复合物称为“2-5A反义嵌合体”。
2-5A反义嵌合体的合成和纯化。
合成的寡核苷酸结构型。
下列同属的寡核苷酸类型是为本研究制备的。
Ⅰ． (p5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅡ．A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅢ．dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅣ．p5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)m5′dN3′p-3′pdN5′Ⅴ．sp5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)m5′dN3′p-3′pdN5′Ⅵ．A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)m5′dN3′p-3′pdN5′Ⅶ．sp5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅧ．p5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-3′dN5′(p3′dN5′)np3′dN用于合成以上Ⅰ-Ⅷ类2-5A-反义嵌合体寡核苷酸的以下方法已阐明。一般依照Lesiak等，1993所发展的合成策略。
所用试剂和化学品。
1．合成起始于固体载体dA-3’-lcaa-CPG(500)5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷-3’-lcaa-CPGdC-3’lcaa-CPG(500)5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2’-脱氧胞苷-3’-lcaa-CPGdG-3’lcaa-CPG(500)
5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷-3’-lcaa-CPGdT-3’-lcaa-CPG(500)5’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3’-lcaa-CPG这些固体载体都用于合成具有正常的3’→5’磷酸二酯键的寡核苷酸。它们均为1μmole大小。这些DMT保护的核苷酸通过一个琥珀酰基固定于控孔玻璃珠(CPG)，而长链烷基胺(lcaa)连接臂是AppliedBiosystems(Foster City，加拿大)商业产品。这些载体用于合成同系寡核苷酸类型Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ，和Ⅶ。
dA-5’-lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷-5’-lcaa-CPGdC-5’lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2’-脱氧胞苷-5’-lcaa-CPGdG-5’lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷-5’-lcaa-CPGdT-5’-lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-5’-lcaa-CPG这些固体载体从Glen Research(Sterling,VA)获得并用于合成具有反向极性5’→3’磷酸二酯键的寡核苷酸。它们均为1μmole大小。这些载体用于合成同系寡核苷酸类型Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ和Ⅷ。
2．DNA反义链的延长。
为了合成正常3’→5’磷酸二酯键寡核苷酸，总量500mg的下列每一种亚磷酰胺(phosphoramidite)(Applied Biosystems)溶于所示量的无水乙腈以形成0.1M亚磷酰胺溶液5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(5.6ml)5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2’-脱氧胞苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(5.9ml)
5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(5.8ml)5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧胸苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(6.6ml)前述用于制备同系寡核苷酸类型Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ和Ⅶ。
为合成具有反向极性的所有DNA磷酸二酯键，以下亚磷酰胺从Glen Research(Sterling,VA)获得。
3’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(5.6ml)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2’-脱氧胞苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(5.9ml)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(5.8ml)3 ’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧胸苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(6.6ml)以上中间体用于合成同系寡核苷酸类型Ⅷ。
3．连接嵌合区的连接臂。
连接臂，(2-氰乙基-N,N-二异丙基)-[4-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)丁基]亚磷酰胺，通过上述方法的改进法进行合成(Lesiak等，1993)，将100mg连接臂溶于1.7mL无水乙腈制成0.1M溶液。
4．嵌合体的2’,5’-寡聚腺苷酸区的合成。
5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基腺苷-2’-N,N-二异丙基氰乙基亚磷酰胺(ChemGenesCorp.,Waltham,MA,cat no.ANP 5681)。将500mg单体溶于5.0mL无水乙腈制成0.1M溶液。
5．嵌合体的2’,5’-寡聚腺苷酸区的5’末端所用磷酸化试剂。
用浓度为0.2M的2-[2-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)乙基磺酰基]乙基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(GlenResearch,Sterling,VA.cat no.10-1900-90)的无水四唑/乙腈(ADI)溶液进行半自动合成。
6．其它试剂。
所有其它DNA合成试剂从Applied Biosystems Inc。获得，包括稀释剂(乙腈)，活化剂溶液(四唑/乙腈)，加帽溶液(A乙酸酐溶液及B:N-甲基咪唑溶液)，脱保护试剂(三氯乙酸溶液)，氧化剂(碘溶液)，和二硫化四乙基硫羰硫化试剂。
用氟化四丁基铵的四氢呋喃溶液(Aldrich,Milwaukee,WI)脱去(2’,5’)-寡核糖腺苷区保护3’羟基的叔丁基二甲基甲硅烷基。
7．合成步骤2’,5’-寡聚腺苷酸/反义嵌合体用修改的自动或半自动法合成。
所有化学品用前在真空中用P2O5干燥过夜。使用1μmole脱氧核苷酸-lcaa-CPG柱。
核心(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合体是指完全2’,5’A-反义嵌合体减去5’-末端单磷酸基团且有为合成目的定义为三区一个反义区，一个连接臂区，和(2’,5’)-寡聚腺苷酸区。应用表1所列的自动方法合成2’,5’A-反义嵌合体。
应用1μmole规模标准合成循环。对每一不同的区改变偶合时间(单体偶合)来修改循环。通过二变方法将单体/乙腈溶液装入DNA合成仪以避免污染。每一区合成后，柱子用氩完全干燥至少3分钟。且为预期寡核苷酸的下一区的合成编辑合成循环，三苯甲基模式，和序列。
为制备没有5’-单磷酸基团的核心2’,5’A-反义嵌合体，表1的最后步骤被省略。为半自动制备5’单磷酸末端嵌合体，核心寡核苷酸在具有三苯甲基情况下合成，柱子干燥后移出DNA合成仪。5’末端磷酸化依据表2列出的方法手动合成。
切割和脱保护1．通过室温2小时浓氢氧化铵/乙醇(3∶1 v/v)处理将寡核苷酸从CPG载体上切下来。
2．将粗品寡核苷酸的氢氧化铵/乙醇溶液转移到一个3ml管形瓶中并封紧。溶液在55℃孵育8小时以除去碱基上的保护基。
3．所得寡核苷酸的氢氧化铵/乙醇溶液转移到一玻璃管中，冰浴中完全冷却。溶液在一快速浓缩器上蒸干并加入氟化四丁基铵(2ml,1.0M)的THF溶液，整个混合物振荡至少1分钟。此反应混合物在室温下放置至少10小时。
加入等体积的0.1MTEAA(四乙基铵乙酸盐)(pH7.0)缓冲液，混均并蒸至半体积以去除THF。残余物用HPLC纯化。
寡核苷酸的纯化1．聚苯乙烯反相离子对色谱法(PRP-IPC)(Swiderski等，1994方法的改进)。
将寡核苷酸溶于大约4-5ml水得到透明溶液(有必要可离心)，透明溶液直接注入PRP-1 HPLC柱(300×7mm)。反应混合物由此同时脱盐并纯化。
溶剂A:10mM磷酸四丁基铵(TBAP),pH7.5，水中。
溶剂B:10mM TBAP pH7.5 乙腈/水(8∶2 v/v)。
样品在60分钟内用A中5-90％峰梯度的溶剂B洗脱，流速1.5mL/分钟。
合并含有目的寡聚体的馏分并蒸发至大约1-2mL。寡聚物-TBA离子对通过以下步骤转化为其钠盐形式1mL Dowex 50W离子交换湿树脂(Na+形式)加入到寡核苷酸/水溶液中。溶液在冷室中搅拌至少30分钟。通过使溶液经过Poly-Prep色谱柱(Bio-Rad,Cat#731-1550)将树脂除去。再用水洗树脂直到树脂上没有寡核苷酸。
或者，Dowex处理前，寡核苷酸依照下面方法通过C-18 Sep-Pak柱。
a．C-18柱用10mL甲醇和10mL水预洗。
b．寡聚物溶液加入柱子。
c．柱子用20mL水洗以除去柱中的盐。
d．寡核苷酸用10mL 50％甲醇水溶液洗脱。
e．脱盐的寡核苷酸用紫外分光光度计检测，合并含有寡聚物的馏分并浓缩。
透析(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合体用HPLC和离子交换纯化后，透析寡核苷酸(钠盐)以除去小分子和剩余的盐。透析在4℃进行。寡核苷酸先用0.02M NaCl透析4-6小时，再用水透析48小时。若寡核苷酸HPLC纯化后用C-18sep-pak柱脱盐，透析时间可缩短至6-10小时。
寡聚腺苷酸/反义嵌合体的后处理透析后的寡核苷酸通过0.22μmillex-GV滤器(Millipore,Cat.No.SLGV025LS)除菌。所得溶液用UV/Vis分光光度计用0.D.A260定量。
(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合体的核苷酸组成分析1．核苷酸组成分析嵌合寡核苷酸的核苷酸组成通过用蛇毒磷酸二酯酶(响尾蛇durissus)(Pharmacia,cat# 27,0821-01)酶消化分析。
纯化的寡核苷酸(0.2 A260 O.D.U.)与蛇毒磷酸二酯酶(0.15单位)在50mMTris/HCl,pH8.0,0.5mM MgCl2,pH8.0中孵育。100μL混合物于37℃孵育至少3小时。对于含有3’-3’dN的嵌合寡核苷酸如寡核苷酸结构类型Ⅳ(部分6)，孵育时间延长至10小时。
消化后，溶液用Microcon-10(Amicon,Inc.产品号42406)处理。加入100μL样品溶液前microcon首先用水漂洗。典型离心时间为45分钟。透明溶液用于HPLC分析。
一份(5-10μL)水解产物通过反相HPLC用Bekman UltrasphereC-18 ODS柱(0.46×25cm)分析。在下面条件下完成消化产物的分离2％B等浓度20分钟，线性梯度2-50％B15分钟。维持等浓度10分钟，其中溶剂A是100mM磷酸铵，pH5.5且溶剂B是甲醇/水(1∶1v/v)。流速0.5mL/分钟。标准标记物dCMP,TMP,dGMP,AMP和dAMP(AldrichChem.Co.)用于比较水解产物的保留时间和洗脱顺序。一般地，寡核苷酸酶水解产物所得的峰的保留时间是9.7分钟(dCMP),27.3分钟(TMP),29.6分钟(dGMP),31.7分钟(AMP),39.5分钟(Alinker)和41.2分钟(dAMP)。保留时间随柱，流动相的pH值，柱的平衡时间而变化。积分峰面积提供了每种核苷酸的相对含量。260nm 100mM磷酸铵pH5.5中测定的消光系数7610(dCMP),8158(TMP),9969(dGMP),12342(AMP&Alinker),14361(dAMP)用于分析。
寡核苷酸纯度确证(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合体的纯度通过HPLC或毛细管凝胶电泳(GCE)检查。纯度通过260nm检测到的峰面积积分获得。
1．毛细管凝胶电泳法(GCE)寡核苷酸纯度测定在Applied Biosystems 270A-HT毛细管电泳仪上用MICRO-GEL100(Applied Biosystems Inc.)凝胶充满毛细管(50μM i.d.，有效长度27cm，缓冲液，75mM Tris磷酸(pH7.6),10％甲醇)进行。260nm检测。用以下条件获得典型的(2’,5’)寡聚腺苷酸/反义嵌合体电泳图样品浓度大约0.1O.D./mL，动电输入为-5kv 2s。电压为-14mA(19mA)，操作温度为30℃。在此条件下，(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合体有比其核心类似物早大约1分钟的洗脱时间。
2．Dionex PA-100离子交换HPLC法寡核苷酸的纯度也可用Dionex离子交换HPLC测定。通常，对(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合体的分析，Dionex PA-100离子交换柱比其它HPLC色谱法能提供更高分辨率和更好峰形。
用以下条件获得典型的(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合体色谱图Dionex PA-100(4X250mm)柱(dionex,cat#43010)。溶剂A为25mMTris/HCl,0.5％乙腈(pH7.0)，溶剂B为25mM Tris/HCl,0.5％乙腈1M氯化铵(pH7.0)。样品在30分钟内用10-70％B溶于A线性梯度洗脱。以1mL/分钟的流速维持等浓度10分钟在260nm检测。
细胞培养，RSV病毒繁殖和感染，及病毒滴度测定。
人类气管上皮细胞株，9HTE,(Gruenert等1988)和CV-1细胞(American Type Cuiture Collection,Rockville,MD,CCI#70)，一种对RSV感染高度敏感的绿猴肾细胞株，在基础培养基(MEM)中培养，加入10％(v/v)胎牛血清(FBS),2mM L-谷氨酰胺，1XMEM氨基酸溶液，1XMEM非基本氨基酸溶液，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B(“培养基”)(所有试剂来自GibcoBRL,Bethesda,MD)。RSV株A2(ATCC No.VR1302)在CV-1细胞中繁殖。CV-1单层细胞在0.2多重感染(M.O.I.)情况下感染并在MEM,2％FBS,1X青霉素/链霉素(PS),5％CO2,95％O237℃培养46小时。然后细胞在MEM中洗两遍接着用MEM,2％FBS,1XPS,50mMHEPES(pH7.5),100mM Mg(SO4)覆盖。37℃2小时后，刮下细胞并如前述声处理(Panuska等，1995)。声处理的等份细胞(每份1ml)在刮下20分钟内在乙醇/干冰中速冻。若干份细胞接着融化，通过前述CV-1细胞空斑法测定滴度(Cirino等，1993)。本方法产生的病毒的滴度范围是每毫升2到7×106空斑形成单位(pfu)。
9HTE细胞RSV感染前后以寡核苷酸，干扰素α和病毒唑治疗。
9HTE细胞的感染以前述进行(Merolla等，1994)。简明地说，37℃5％CO2,95％O2，成片的单层细胞暴露于稀释在MEM,2％FBS中的RSV 2小时。暴露后，细胞用无血清MEM培养基洗两遍再加入新鲜培养基(含10％FBS)。寡核苷酸可在感染前4小时(t-4)或感染后立即加入(t+2)也可在t+14和t+26加入。细胞于感染36小时后收获如前述进行空斑测定以测定病毒滴度(Cirino等，1993)。细胞洗两遍以除去任何残留的反义寡核苷酸然后刮入含2％FBS,1XPS的MEM.9HTE细胞冰浴中声处理20秒后，提取物连续稀释并转移到成片的单层CV-1细胞进行感染病毒颗粒定量。CV-1暴露于声处理的9HTE2小时然后MEM洗一次并铺于含2％FBS,200U/ml青霉素，200μg/ml链霉素，0.5μg/ml两性霉素B，和0.4％琼脂的Eagle’s极限必需培养基上(EMEM,BioWhittaker,Walkersville,MD)。五天后，细胞在10％福尔马林中固定1小时，除去琼脂填料，加入溶于10％福尔马林的0.2％结晶紫2分钟。CV-1接着用水洗以除去多余的染料，溶胞(空斑)数在显微镜下定量。
在特定试验中(数据未显示)，干扰素α(Schering,IntronA，干扰素α-2B,105U/ml)或病毒唑(ICN Pharmaceuticals,Costa Mesa,CA,100μg/ml)也在感染后加入。当反义嵌合物加入时，即t+2,t+14和t+26，干扰素α加至最终浓度为50U/ml。作为对照，病毒唑，体内半衰期为40天，仅在T+2加至终浓度10-13M。
逆转录酶偶联的聚合酶链反应(RT-PCR)从2×105感染后8小时(M.O.I.=10)的9HTE细胞中用RNAzol依照厂家(Tel-Test,Inc,Freinswood,TX)描述处理提取RNA.8小时后分离RNA以限制RSV复制于单个循环。分离的RNA(约1μg)与100pmoles合适的下表所列下游(-)引物或100pmoles随机六聚体(用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶，GAPDH，仅限mRNA)孵育。RNA和引物加热至70℃保持10分钟然后迅速在冰上冷却5分钟。最终30ml反应体积包括300μM每种dNTP,200U SuperScipt逆转录酶(GibcoBRL,Bethesda,MD),50mM Tris-HCl(pH8.3),75mMKCl,3mMMgCl2，和10mMDTT.逆转录在37℃进行1小时。
PCR反应用50μl Hot-Start管(Molecular Bio-products,SanDiego,CA)进行，25μl下层缓冲液含40mM Tris-HCl(pH=8.4),100mMKCl,2mM MgCl2,600μM每种dNTP，和100 pmoles每种合适的引物对；退火靶 序列 温度RSV(L+)(Seq ID NO:1) [5′-TCAATGGTCCTTATCTCAA-3′]46℃RSV(L-)(Seq ID NO:2) [5′-GAGCTTTATTAGCAGCATC-3′]GAPDH(+)(Seq ID NO:3)[5′-AAATCCCATCACCATCTTC-3′]57℃GAPDH(-)(Seq ID NO:4)[5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′]RSV(M2+)(Seq ID NO:5)[5′-AAACAATCAGCATGTGTTG-3′]46℃RSV(M2-)(Seq ID NO:6)[5′-AATGTAACGATGTGGTGAG-3′]25μl Hot-Start上层缓冲液含5U TaqDNA聚合酶(GibcoBRL)和1/10th RT反应的cDNA。PCR反应以92℃ 1分钟，上述退火温度1.5分钟，72℃ 5分钟进行30轮。等份RT/PCR混合物在1％琼脂/TBE凝胶上分析。
实施例8结果在预先感染的人类支气管上皮细胞中反义2-5A抑制RSV复制。
为发展2-5A反义嵌合物阻断RSV复制的潜能，我们首先选择病毒RNA聚合酶(RSV L)mRNA中的一个寡核苷酸结合位点，它编码一个RSV复制必需的低丰度信息。第一个合成并评价的嵌合物是pA4-antiRSV/(8490-8509)。嵌合寡核苷酸的反义区的结合位点是相应于RSV基因组8490-8509核苷酸的转录子，这跨越了L蛋白的翻译起始密码子，相应于反基因组链(基因组复制的模板)的8490-8509核苷酸。由于作为有效治疗，候选药物必须能在诊断后抑制病毒的复制，2-5A反义嵌合物的抗-RSV结果已在人支气管上皮细胞9HTE测定，在RSV感染4小时前(感染前/后处理)或感染2小时后(感染后处理)开始处理。在感染后处理中，t+2,t+14和t+25时(数字代表相对感染时间，t0的小时)加入pA4-antiRSV/(8490-8509)(10μM终浓度)。在感染前处理中，除t+2,t+14和t+26外t-4和t0时加入pA4-antiRSV/(8490-8509)(10μM终浓度)。从对照和寡核苷酸处理的9HTE细胞中收获的病毒通过感染CV-1细胞随后计数病毒空斑(参见材料和方法)来测定。发现用pA4-antiRSV/(8490-8509)感染后处理9HTE细胞与感染前/后处理同样有效；都导致RSV复制的约70％抑制。在这些试验的基础上，所有后续试验只进行感染后处理。另外，这些试验提示这些化合物与预防性测量相比作为活性感染的治疗的潜在用处。
2-5A反义和对照寡核苷酸嵌合物直接针对病毒L聚合酶mRNA翻译起始位点的抗病毒活性。
一初始系列寡核苷酸包括各种对照和针对细胞培养中的酶解衰减为稳定嵌合体而设计的附加修饰(表3)。为比较这些寡核苷酸的抗病毒活性，9HTE细胞用RSV感染，接着用三种浓度的寡核苷酸(3.3,6.6和9.9μM)处理三次(t+2, t+14，和t+26小时)，病毒于36小时后收获。A4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)中仅缺少5’磷酸的反义嵌合物缺乏激活RNA酶L的能力(Maran等，1994)，用作对照。此衍生物显示最小抗RSV活性(9.9μM/处理28.3％抑制与5’-磷酸化的衍生物，pA4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)64.8％抑制相比)。为稳定嵌合物的3’末端，给这些末端加帽。在一衍生物pA4-3’ANTIRSV5’/(8490-8509)中，嵌合物的2-5A部分连接到反义部分的3’末端而非寡核苷酸的5’末端。用此法，尽管连接至连接臂，反义的3’末端被保护免受外切酶消化(G.L.,W.E,&P.F.T.，未发表结果)。在测试的最高浓度(9.9μM)此类似物对病毒复制产生69％抑制(表3)。另一嵌合物中，pA4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509),3’末端脱氧核苷酸通过3’-3’磷酸二酯键连接至倒第二脱氧核苷酸以减慢3’外切酶消化(G.L.,W.X.,&P.F.T.，未发表结果)。与标准未修饰嵌合物，pA4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)相同浓度下测试(38.8％抑制)相比，此化合物在6.6μM(64.3％抑制)产生1.6倍增强的抗病毒活性。或者，用5’-硫代磷酸使嵌合物2-5A区对磷酸酶的稳定。与标准，5’-磷酸化的2-5A和反义2-5A相比，这样的2-5A和反义2-5A的硫代磷酸衍生物前面已显示完全能激活RNA酶(Xiao等，1994和Maran等，1994)。spA4-antiRSV/(8490-8509)明确显示抗RSV效果大大增强，在处理浓度分别是6.6μM,9.9μM时对病毒生长抑制71％和94％(表3)。
实施例9．靶点选择高度有效的2-5A反义嵌合物的选择基于RNA二级结构的计算机分析。
对RSVmRNA的二级结构进行计算机辅助分析以分辨单链区作为寡核苷酸结合位点。计算机对RSV反基因组链核苷酸7900-9079，包括编码病毒外壳蛋白的M2基因的3’部分，和L基因的5’区用MFOLD程序进行二级结构预测，此程序可根据发表的堆积和环去稳定的能量值找到RNA分子具有最小自由能的二级结构。MFOLD是Michael Zuker的程序(Zuker,1989)。Zuker的程序所用的能量首先由Salser(1977)描述，现在由Turner和同事定义(Freier等，1986)。分析显示从位置8250到8299的一个大环。此环位于主要M2开放读码框架下游(3’)一未知功能90密码子开放读码框架中。合成与环中序列互补的三个嵌合体化合物，spA4-antiRSV3’-3’A/(8251-8270)，spA4-antiRSV3’-3’T/(8261-8279)，和spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)。另外，分别合成与RNA其它区，包括一个膨出，一个发夹和一个小环对应的三个寡核苷酸，spA4-antiRSV3’-3’A/(8530-8547),spA4-antiRSV3’-3’C(8562-8578),spA4-antiRSV3’-3’G/(8599-8618)。当以3.3μM的浓度加入感染的9HTE细胞时，针对大环的三个寡核苷酸具有最大抗病毒活性(78-91％抑制)(表4)。这三个寡核苷酸比前述2-5A反义分子(3-16.5％抑制，3.3μM表3)具有大大提高的抗病毒活性。具有最大抗RSV效果的嵌合物是spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)，它在剂量为6.6和9.9μM时分别产生97和99％的RSV复制抑制。针对RNA含膨出区的寡核苷酸，spA4-antiRSV3’-3’A/(8530-8547)，在3.3μM显示几乎没有抗病毒活性(表4)。针对发夹和小环的2-5A反义分子，spA4-antiRSV3’-3’C/(8561-8578)和spA4-antiRSV3’-3’G/(8599-8618)有中等活性，在3.3μM浓度有57和43％的RSV复制抑制。
图3表示spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)和spA2-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)的比较。只有四腺苷酸是RNA酶L的激活剂，由此spA4连接的寡核苷酸比spA2连接的寡核苷酸强的效能确定了本发明中RNA酶L活性在保护效果中的作用。
实施例10．结果的生化分析抗病毒活性和2-5A反义嵌合物处理后的RSV-感染的9HTE细胞的RNA水平的相关性。
为确定RSV RNA水平和抗病毒活性是否相关，从RSV感染的和未感染的，经过和未经过spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)或spA4-antiRSV3’3’A/(8530-8547)处理的9HTE细胞分离RNA进行RT-PCR分析。一RSV中M2RNA序列(从核苷酸7879到8465)被转变为cDNA并用PCR放大(材料和方法)。来自RSV感染细胞的M2 RNA产生一明显可见的RT-PCR产物。相对的spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)处理的RSV感染细胞中测不到M2RNA。直接针对RSV L mRNA和反基因组RNA中相应序列的嵌合物，spA4-antiRSV3’3’A/(8530-8547)，对M2RNA水平几乎没有影响(17％抑制)。因此，用spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)处理的9HTE细胞中病毒M2RNA明显减少而用相对失活的针对RSV L mRNA的对照嵌合物，spA4-antiRSV3’3’A/(8530-8547)处理，对M2 RNA水平没有影响。GAPDH转录子水平在所有RNA制备中类似。这些显示特异RSV mRNA靶点消失的结果与RNA酶L的涉入一致。
实施例11其它反义激活剂复合物RSV反基因组链5’末端的二级结构可比中间部分更容易破坏。这样，尽管反基因组链二级结构模型中缺少大环，但是下列反义激活剂复合物仍可用于实施本发明。
spA4-antiRSV3′-3′T/(1-19):sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′ttg(Seq ID NO:7) tac gca ttt ttt cgc g3′-3′t5′)spA4-antiRSV3′-3′T/(51-69) sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′gta(Seq ID NO:8) ctt atc aaa ttc tta t3′-3′t5′)RSV基因组的3’末端存在一组约50核苷酸没有并入编码3’邻近基因转录的蛋白，但它转录产生一种小RNA称为“前导RNA”。证据显示基因组3’末端正是转录运转的入口点并引导RNA合成，它涉及在引导物-模板-NP-基因边界的富含嘌呤序列终止，是转录酶通过基因组其它部分过程的强制性前奏。另外，由于该基因组3’末端是复制性和转录性RNA合成的起始，此点提供了一个在两种RNA合成间关键切换操作的位点。最后，RSV基因组的3’末端富含对2-5A-依赖RNA酶剪切更容易敏感的尿嘧啶核苷酸残基。
基因组链的3’末端的这些功能比基因组链的其它部分更容易破坏。这样以下结合基因组链的反义激活剂复合物可用于实施本发明。
spA4-antiRSVGe3′-3′T/(1-18):sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′acg(Seq ID NO:9) cga aaa aat gcg tac3′-3′t5′)spA4-antiRSVGe3′-3′T/(84-101) (Seq ID NO:10):
sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′ctc cct tgg tta gag atg3′-3′t5′)spA4-antiRSVGe3′-3′T/(369-386) (Seq ID NO:11):
sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′gaa atg atg gaa tta aca3′-3′t5′)实施例12spA4-antiRSV3’3’T/(8281-8299)的比较数据通过测定每种化合物的RSV抑制浓度和细胞毒浓度可获得spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)处理和常规病毒唑处理效率的比较。建立人喉癌细胞株HEp-2和鼠肾细胞株MA-104培养并以MOI=0.005感染。培养物每天喂两次。感染同时用病毒唑或spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)处理并继续4天。接着撤除处理，第5天读数。处理对RSV感染的结果报告为1)EC50，可见的感染细胞病理结果减少50％的浓度和2)EC90，病毒产生减少90％的浓度。细胞毒性浓度，IC50是导致细胞数减少50％的浓度。治疗效率通过IC50/EC50比例选择指数估计。
结果显示于表5和表6。表5显示Hep-2细胞中spA4-antiRSV3’-3’T(8281—8299)EC50为0.3μM；病毒唑的EC50为4μM.IC50s分别大于10μM和41μM。这样，spA4-antiRSV3’-3’T(8281-8299)具有比病毒唑高三倍的SI。
表6显示关于MA-104细胞的类似结果。发现spA4-antiRSV3’-3’T(8281-8299)和病毒唑的SI分别为大于500和约200。
参考文献Beigelman,L.,Matulic-Adamic,j.,et al.,2-5A二硫代磷酸酯类似物的合成及生物活性，核酸研究23:3989-94。
Balotta,C,Lusso,P.,Crowley,R,Gallo,RC,Franchini,G.1993.定靶干vpr基因抑制人类巨噬细胞中人免疫缺陷病毒类型1复制的反义硫代磷酸酯酶寡脱氧核苷酸。病毒学杂志，67:4409-4414.
Chebath,J.,Benech,P.,Revel,M and Vigneron,M.1987.能抗小核病毒感染的(2’-5’)寡聚A合成酶的基本表达。自然330,587-588。
Cirino,NM,Panuska,JR,Villani,A,Taraf,H,Rebert,NA,Merolla,R,Tsivitse,P,Gilbert,IA.1993.人小泡巨噬细胞中呼吸道合胞病毒的有限复制，病毒学杂志74:1527-1537。
Floyd-Smith,G,Slattery,E.and Lengyel,P.1981.干扰素作用(2’-5’)寡聚胺苷酸依赖内切核酸酶的RNA剪切方式。科学212:1020-1032。
Freier,SM,Kienzek,R,Jaegar,JA,Sugimoto,N,Caruthers,MH,Neilson,T,8nd Turner,DH.1986.改进的自由能常数用于RNA双螺旋稳定性预测。1989。美国国家科学院院刊83:9373-9377。
Froelich,E.A.1994.SPI药物有限公司-公司报告，PershingDivision-Donaldson,Lufkin & Jenrette.
Goodchild,J,Agrawal,S,Civeira,MP,Sarin,PS,Sun,D,Zamecnik,PC.1988.反义寡核苷酸对人类免疫缺陷病毒复制的抑制。美国国家科学院院刊85:5507-5511。
Gribaudo,G,Lembo,D,Cavallo,G,Landolfo,S,and Lengyel,P.1991.干扰素作用在干扰素处理的脑心肌炎病毒感染的HeLa细胞中病毒RNA结合至40KD 2’-5’寡聚腺苷酸合成酶。病毒学杂志65,1748-1757Gruenert,DC,Basbaum,CB,Welsh,MJ,Li,M,Finkbeiner,WE,Nadel,JA.1988.类人猿起源缺陷病毒40转染人支气管上皮细胞的特征。美国国家科学院院刊85:5951-5955。
Hassel,B,Zhou,A,Maran,A,Silverman,RH.1993.抑制干扰素抗增生和抗病毒结果的2-5A依赖RNose的主要负性突变体，EMBO杂志12,3297-3304。
Heilman,C.1994.RFA:“RSV疫苗免疫强化的机制”。N.I.A.I.D.,N.I.H.,Bethesda,MD.
Lesiak,K.；Khamnei,S.；Torrence,P.F.1993.2’,5’-寡聚腺苷酸-反义嵌合体-合成及性质。生物缀合化学，4:467-472。
Letsinger,RL,Zhang,G,Sun,DK,Ikeuchi,T,Sarin,PS.1989.缀合胆甾醇的寡核苷酸合成、性质及在细胞培养液中作为人类免疫缺陷病毒复制抑制剂的活性。美国国家科学院院刊86:6553-6556。
Maran,A,Maitra,RK,Kumar,A,Dong,B,Xiao,W,Li,G,Williams,BRG,Torrence,PF,Silverman,RH.1994.通过2-5A-反义嵌合体对-mRNA靶的选择性摘除来阻断NF-kB信号传导。科学265:789-792。
Maitra,RK,Li,G,Xiao,W,Dong,B,Torrence,PF,andSilverman,RH.1995.由2-5A-反义和2-5A依赖的RNA酶对-RNA靶进行的催化裂解。生物化学杂志，270:15071-15075。
Mclntosh,K,and,Chanock,RM.1990.呼吸道合胞病毒。病毒学，2版。Edited by BN Fields,DM Knipe et al.,Raven Press,Ltd,New York,pp.1045-1072.
Merolla,R,Rebert,NA,Tsivitse,P,Hoffmann,SP,Panuska,JR,1995.人肺上皮细胞中呼吸道合胞病毒复制被肿瘤坏死因子α和干扰素a8247抑制。Am J Rsp and Crit Care Med.
Midulla,F,Villani,A,Panuska,JR,Dab,l,Kolls,JK,Merolla,R,Ronchetti,R.1993.简明通讯呼吸道合胞病毒婴儿肺感染感染的小泡巨噬细胞的免疫调节作用。婴儿病杂志168:1515-1519。
Panuska,JR,Hertz Ml,Taraf,H,Villani,A,Cirino,NM.1992.成人移植病人中呼吸合胞病毒对小泡巨噬细胞的感染。呼吸病年鉴145:934-939。
Panuska,JR,Merolla,R,Rebert,NA,Hoffmann,SP,Tsivitse,P,Cirino,NM,Silverman,RH,Rankin,JA.1995.呼吸合胞病毒引起人小泡巨噬细胞产生白介10早期细胞因子产生抑制和解释不完全免疫。临床观察杂志。
Rysiecki,G,Gewert,DR,Williams,BRG.1989.2’-5’寡聚腺苷酸合成酶cDNA的基本表达导致抗病毒活性增加和生长抑制。干扰素研究杂志9,649-657。
Salser,W.1977.珠蛋白mRNA序列碱基对分析和进化意义。冷泉港定量生物学论文集42:985-1002。
Silverman,RH.1994.2-5A依赖RNase的吸引一种干扰素作用时起作用的独特的酶。干扰素研究杂志，14:10l-104。
Swiderski,PM,Bertrand,EL,and Kaplan,BE(1994)嵌合核糖核酸酶的聚苯乙烯反相离子对层析法。分析生物化学，216:83-88。
Torrence,PF,Maitra,RK,Lesiak,K,Khamnei,S,Zhou,A,and Silverman,RH.1993.用2’,5’聚腺苷酸-反义嵌合物降解定靶RNA。美国国家科学院院刊，90:1300-1304。
Wreschner,DH,James,TC,Silverman,RH,and Kerr,IM.1981.干扰素处理细胞中，核糖体RNA剪切，核酸酶激活和2-5A(PPP(A2’p)nA)核酸研究。
Wreschner,DH,McCauley,JW,Skehel,JJ,and Kerr,IM.1981.PPP(A2’p)nA依赖核糖核酸酶的干扰素作用序列特异性自然289,414-417。
Xiao,W,Li,G,Lesiak,K,Dong,B,Silverman RH,andTorrence,PF,1994.2-5A的5’硫代磷酸类似物的合成，一种2-5A依赖的核糖核酸酶的磷酸抑制激活剂，生物有机和药物化学快报4,2609-2614,1994。
Zamecnik,PC,Goodchild,J,Taguchi,Y,Sarin,PS.1986，外源合成的与病毒RNA互朴的寡核苷酸在培养细胞中对人T淋巴细胞病毒Ⅲ的复制和表达的抑制。美国国家科学院院刊83:4143-4146.
Zisson,A.1993.Shaman Pharmaceuticals,Inc.-CompanyReport.Hambrecht & Quest Institutional Research-公司报告。
Zuker,M.1989.RNA结构的计算机预测。酶学方法180:262-288。表1 合成核心(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反义嵌合物的修改方法合成区 偶合时间偶合剂和浓度三苯甲基方式(序列编辑) (秒) & concentration反义寡聚物 15乙腈中0.1M单体开(DNA合成)连接臂 300 乙腈中0.1M连接开臂(2’,5’)寡聚腺 600 乙腈中0.1M(2’， 开苷酸5’)AdoBz磷酸化 60乙腈中0.1MPⅢ试 关剂表2 5’-末端磷酸化的合成方法步 溶剂/试剂 时间 体积1．偶合0.2M磷酸化作用试3min. 0.15mL剂四唑/乙腈2．洗 乙腈 3mL3．干燥 氩3min.4．氧化 0.1M I2于二甲基0.75min. 1mL吡啶∶THF∶水(20∶80∶1)5．洗 乙腈 3mL6．干燥氩 3min.7．脱三苯甲基 3％TCA于CH2C121.5min.1mL作用8．洗 2％Py 乙腈 1mL9．洗 乙腈3mL表3 针对RSV聚合酶RNA翻译起始位点的反义嵌合物的抗病毒活性寡聚物/RSV RNA的位点化合物结构RSV复制的抑制寡核苷酸/处理 3.3μM6.6μM9.9μMA4-antiRSV3′-3′C/(8490-8509) A2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′aat ggg atc cat ttt gtc c3′-3′c5′) 20(1) 28.3(3)pA4-antiRSV/(8490-8509) pA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′aat ggg atc cat ttt gtc cc3′)3(2) 38.8(4) 64.8(5)pA4-3′antiRSV5′/(8490-8509)pA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(3′ccc tgt ttt acc tag ggt aa5′) 69(1)pA4-antiRSV3′-3′C/(8490-8509) pA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′aat ggg atc cat ttt gtc c3′-3′c5′) 2(1) 64.3(3) 74(2)spA4-antiRSV/(8490-8509) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′aat ggg atc cat ttt gtc cc3′) 16.5(2) 71(1) 94(1)感染36小时后通过病毒空斑法测定抗病毒活性。括号中是提供数据的实验次数。结果显示除一个实验数据外2-7次实验得来的平均抑制百分数。抑制百分数定义为[(寡核苷酸处理细胞中产生的感染性病毒颗粒)/(未处理细胞中产生的感染性病毒颗粒)]×100。M.O.I是2.0 p.f.u.每细胞。
为简明，2-5A-反义寡核苷酸按以下所用常规缩写。嵌合物的2-5A区以粗体大写字母表示，即，pA2’p(A2’p)3。连接臂部分缩写为[(Bu)p]2，代表两个1,4-丁二醇分子通过磷酸二酯键相互连接，及-[(Bu)p]2，代表连接于嵌合体的2-5A和反义区。在下面的例子中，以粗体三倍体重复序列代表具正常的3’,5’磷酸二酯键的反义寡核苷酸，极性如所示，即，(3’ccc tgt ttt acc tag ggt aa5’)。整个链或末端3’-核苷酸取向的例外，两者均清楚地标出。嵌合物2-5A区5’-单磷酸酯修饰为5’-硫代磷酸酯时，所用缩写为spA2’p(A2’p)3。表4 针对RVS M2和L mRNAs的不同位点的稳定的、反义嵌合物的抗病毒活性寡聚物/RSV RNA位点 化合物结构 ％RSV复制的抑制寡核苷酸/处理 3.3μM6.6μM9.9μMspA4-antiRSV3′-3′N Series:SpA4-antiRSV3′-3′A/(8530-8547) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′cta tcg gtt aga taa ac3′-3′a5′) 2.5(1)spA4-antiRSV3′-3′G/(8599-8618) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′gat aag gac cat tga ata t3′-3′g5′) 44(1)spA4-antiRSV3′-3′C/(8561-8578) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′ctc tga gaa aga gat aa3′-3′c5′) 57(1)spA4-antiRSV3′-3′T/(8261-8279) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′gat tga aat ata gtg tgt3′-3′t5′)78(2) 87(1) 87(1)spA4-antiRSV3′-′3A/(8251-8270) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′ata gtg tgt tct ttt gat t3′-3′a5′) 86.7(2)92(1)spA4-antiRSV3′-3′T/(8281-8299) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′atg gtt att tgg gtt gtt3′-3′t5′)91.3 (3) 97(1) 99.6(1)参见表3说明表5spA4-antiRSV3’-3’T/(8281)的抗病毒活性Hep-2细胞中性红化合物 EC50IC50SIspA4-antiRSV3’-3’T/(8281) 0.3μM＞10μM＞33病毒唑4μM41μM 10用RSV株A2测定，MOI=0.005新鲜培养基和寡聚物或病毒唑每天加2次共4天第5天读数。
EC50是减少RSV产生CPE 50％的有效浓液。
IC50是细胞的细胞毒性的50％抑制浓度(如用干病毒测定的迅速分裂细胞相对静止细胞的测定来测定可见和染粒摄入)。
SI选择指数=IC50/EC50表6spA4-antiRSV3’-3’T/(8281)的抗病毒活性MA-104细胞可见CPE和病毒产生的减少化合物 EC50EC90IC50SIspA4-antiRSV3’-3’T/(8281) 0.02μM 0.02μM ＞10μM＞500病毒唑1μM 7μM 210μM210如用RSV株A2测定，MOI=0.005新鲜培养苷和寡聚物或病毒唑每天加2次共4天第5天读数。
EC50是减少RSV产生的CPE 50％的有效浓度。
EC90是减少RSV产生90％的有效浓度。
IC50是对细胞的细胞毒性的50％抑制浓度(可见和染料摄入如用干病毒测定的快速分裂细胞相对静止细胞的测定)。
SI选择指数=IC50/EC50序列列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(ⅱ)发明题目对治疗RSV感染有效的RNA酶L激活剂和反义寡核苷酸(ⅲ)序列数目23(ⅳ)联系地址(A)收件人Pennie & Edmonds LLP(B)街道1155 Avenue，美国(C)城市纽约(D)州NY(E)国家U.S.A(F)邮政编码10036(ⅴ)计算机可读类型(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件Fast SEQ 2.0版(ⅵ)目前申请资料(A)申请号(B)签发日期(C)分类(ⅶ)优先申请资料(A)申请号60/011 725(B)签发日期2/15/96(ⅷ)代理人/委托人信息(A)姓名Poissant,Brian M.
(B)登记号28462(C)文献/摘要号8656-009-228(ⅸ)通讯信息(A)电话212-790-9090(B)传真212-869-9741(C)TELEX(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词RSV(L+)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:1:TCAATGGTCC TTATCTCAA 19(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词RSV(L-)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:2:GAGCTTTATT AGCAGCATC 19(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词GAPDH(+)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:3:AAATCCCATC ACCATCTTC 19(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词GAPDH(-)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:4:CACCACCCTG TTGCTGTAG 19(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词RSV(M2+)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:5:AAACAATCAG CATGTGTTG19(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词RSV(M2-)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:6:AATGTAACGA TGTGGTGAG 19(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词反义激活剂复合物(B)位置1...19(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(1-19)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:7:(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词反义激活剂复合物(B)位置1...19(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(51-69)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:8:GTACTTATCA AATTCTTAT 19(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词反义激活剂复合物(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSVGe3’-3’T/(1-18)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:9:ACGCGAAAAA ATGCGTAC 18(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词反义激活剂复合物(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSVGe3’-3’T/(84-101)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:10:CTCCCTTGGT TAGAGATG 18(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词反义激活剂复合物(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSVGe3’T/(369-386)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:11:GAAATGATGG AATTAACA 18(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...19(D)其它信息A4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:12:AATGGGATCC ATTTTGTCC 19(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...20(D)其它信息pA4-antiRSV/(8490-8509)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:13:AATGGGATCC ATTTTGTCCC 20(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...20(D)其它信息pA4-3’antiRSV5’/(8490-8509)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:14:AATGGGATCC ATTTTGTCCC 20(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...19(D)其它信息pA4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:15:AATGGGATCC ATTTTGTCC 19(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...20(D)其它信息spA4-antiRSV/(8490-8509)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:16:AATGGGATCC ATTTTGTCCC 20(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...17(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’A/(8530-8547)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:17:CTATCGGTTA GATAAAC17(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...19(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’G/(8599-8618)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:18:GATAAGGACC ATTGAATAT 19(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...17(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’C/(8561-8578)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:19:CTCTGAGAAA GAGATAA17(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(8261-8279)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:20:GATTGAAATA TAGTGTGT 18(2)SEQ ID NO:21信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词其它(B)位置1...19(D)其它信息寡核苷酸spA4-antiRSV3’-3’A/(8251-8270)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:21:ATAGTGTGTT CTTTTGATT19(2)SEQ ID NO:22信息(ⅰ)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词寡核苷酸(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:22:ATGGTTATTT GGGTTGTT 18(2)SEQ ID NO:23信息(ⅰ)序列特征(A)长度15222碱基对(B)类型核酸(C)链类型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名字/关键词RSV-A2(B)位置1...15222(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:1:ACGCGAAAAA ATGCGTACAA CAAACTTGCA TAAACCAAAA AAATGGGGCA AATAAGAATT 60TGATAAGTAC CACTTAAATT TAACTCCCTT GGTTAGAGAT GGGCAGCAAT TCATTGAGTA 120TGATAAAAGT TAGATTACAA AATTTGTTTG ACAATGATGA AGTAGCATTG TTAAAAATAA 180CATGCTATAC TGATAAATTA ATACATTTAA CTAACGCTTT GGCTAAGGCA GTGATACATA 240CAATCAAATT GAATGGCATT GTGTTTGTGC ATGTTATTAC AAGTAGTGAT ATTTGCCCTA 300ATAATAATAT TGTAGTAAAA TCCAATTTCA CAACAATGCC AGTACTACAA AATGGAGGTT 360ATATATGGGA AATGATGGAA TTAACACATT GCTCTCAACC TAATGGTCTA CTAGATGACA 420ATTGTGAAAT TAAATTCTCC AAAAAACTAA GTGATTCAAC AATGACCAAT TATATGAATC 480AATTATCTGA ATTACTTGGA TTTGATCTTA ATCCATAAAT TATAATTAAT ATCAACTAGC 540AAATCAATGT CACTAACACC ATTAGTTAAT ATAAAACTTA ACAGAAGACA AAAATGGGGC 600AAATAAATCA ATTCAGCCAA CCCAACCATG GACACAACCC ACAATGATAA TACACCACAA 660AGACTGATGA TCACAGACAT GAGACCGTTG TCACTTGAGA CCATAATAAC ATCACTAACC 720AGAGACATCA TAACACACAA ATTTATATAC TTGATAAATC ATGAATGCAT AGTGAGAAAA 780CTTGATGAAA AACAGGCCAC ATTTACATTC CTGGTCAACT ATGAAATGAA ACTATTACAC 840AAAGTAGGAA GCACTAAATA TAAAAAATAT ACTGAATACA ACACAAAATA TGGCACTTTC 900CCTATGCCAA TATTCATCAA TCATGATGGG TTCTTAGAAT GCATTGGCAT TAAGCCTACA 960AAGCATACTC CCATAATATA CAAGTATGAT CTCAATCCAT AAATTTCAAC ACAATATTCA 1020CACAATCTAA AACAACAACT CTATGCATAA CTATACTCCA TAGTCCAGAT GGAGCCTGAA 1080AATTATAGTA ATTTAAAATT AAGGAGAGAT ATAAGATAGA AGATGGGGCA AATACAAAGA 1140TGGCTCTTAG CAAAGTCAAG TTGAATGATA CACTCAACAA AGATCAACTT CTGTCATCCA 1200GCAAATACAC CATCCAACGG AGCACAGGAG ATAGTATTGA TACTCCTAAT TATGATGTGC 1260AGAAACACAT CAATAAGTTA TGTGGCATGT TATTAATCAC AGAAGATGCT AATCATAAAT 1320TCACTGGGTT AATAGGTATG TTATATGCGA TGTCTAGGTT AGGAAGAGAA GACACCATAA 1380AAATACTCAG AGATGCGGGA TATCATGTAA AAGCAAATGG AGTAGATGTA ACAACACATC 1440GTCAAGACAT TAATGGAAAA GAAATGAAAT TTGAAGTGTT AACATTGGCA AGCTTAACAA 1500CTGAAATTCA AATCAACATT GAGATAGAAT CTAGAAAATC CTACAAAAAA ATGCTAAAAG 1560AAATGGGAGA GGTAGCTCCA GAATACAGGC ATGACTCTCC TGATTGTGGG ATGATAATAT 1620TATGTATAGC AGCATTAGTA ATAACTAAAT TAGCAGCAGG GGACAGATCT GGTCTTACAG 1680CCGTGATTAG GAGAGCTAAT AATGTCCTAA AAAATGAAAT GAAACGTTAC AAAGGCTTAC 1740TACCCAAGGA CATAGCCAAC AGCTTCTATG AAGTGTTTGA AAAACATCCC CACTTTATAG 1800ATGTTTTTGT TCATTTTGGT ATAGCACAAT CTTCTACCAG AGGTGGCAGT AGAGTTGAAG 1860GGATTTTTGC AGGATTGTTT ATGAATGCCT ATGGTGCAGG GCAAGTGATG TTACGGTGGG 1920GAGTCTTAGC AAAATCAGTT AAAAATATTA TGTTAGGACA TGCTAGTGTG CAAGCAGAAA 1980TGGAACAAGT TGTTGAGGTT TATGAATATG CCCAAAAATT GGGTGGTGAA GCAGGATTCT 2040ACCATATATT GAACAACCCA AAAGCATCAT TATTATCTTT GACTCAATTT CCTCACTTCT 2100CCAGTGTAGT ATTAGGCAAT GCTGCTGGCC TAGGCATAAT GGGAGAGTAC AGAGGTACAC 2160CGAGGAATCA AGATCTATAT GATGCAGCAA AGGCATATGC TGAACAACTC AAAGAAAATG 2220GTGTGATTAA CTACAGTGTA CTAGACTTGA CAGCAGAAGA ACTAGAGGCT ATCAAACATC 2280AGCTTAATCC AAAAGATAAT GATGTAGAGC 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15060TTAAAAATTA AAAATCATAT AATTTTTTAA ATAACTTTTA GTGAACTAAT CGTAAAGTTA 15120TCATTTTAAT CTTGGAGGAA TAAATTTAAA CCCTAATCTA ATTGGTTTAT ATGTGTATTA 15180ACTAAATTAC GAGATATTAG TTTTTGACAC TTTTTTTCTC GT 1522权利要求
1．包括基本组成为下列的多聚核苷酸的组合物a)一段反义寡核苷酸，在第一末端有羟基部分，其中寡核苷酸和一呼吸道合胞病毒株的反基因组RNA链的15至20核苷酸互补；b)与第一末端相连的连接臂；和c)与连接臂相连的RNA酶L的寡核苷酸激活剂。
2．权利要求1的组合物，其中反义寡核苷酸与通常为单链的反基因组RNA链中至少15个连续核苷酸互补。
3．权利要求1的组合物，其中反义寡核苷酸与通常为单链的反基因组RNA链中一区的一部分互补，所述区大于34个核苷酸。
4．权利要求1的组合物，其中反义寡核苷酸与通常为单链的反基因组RNA链中一区的一部分互补，所述区大于45个核苷酸。
5．权利要求1的组合物，其中寡核苷酸激活剂从由sp5’A2’(p5’A2’)2-O-sp5’A2’(p5’A2’)3-O-,p5’A2’(p5’A2’)2-O-和p5’A2’(p5’A2’)3-O-组成的组中选择。
6．权利要求1的组合物，其中第一末端是5’末端，反义寡核苷酸的3’末端羟基被封闭剂封闭，封闭剂从由-p3’N5’核苷酸，p-O-烷基胺，p-O-羟基烷基胺，sp-O-烷基胺，sp-O-羟基烷基胺，乙基和甲基组成的组中选择。
7．权利要求1的组合物，其中第一末端是3’末端。
8．权利要求1的组合物，其中呼吸道合胞病毒株是A2株，且反义基因组的部分在残基617和663或残基718-772之间，以5’→3’方向编号。
9．权利要求1的组合物，其中呼吸道合胞病毒株是A2株，且反义基因组的部分在残基2490和2530之间，以5’→3’方向编号。
10．权利要求1的组合物，其中呼吸道合胞病毒株是A2株，且反义基因组的部分在残基8251和8299之间，以5’→3’方向编号。
11．权利要求10的组合物，其中反义寡核苷酸从由残基8251-8270,8261-8279和8281-8299组成的组中选择，以5’→3’方向编号。
12．权利要求1的组合物，其中反义寡核苷酸含有一个或多个磷酸部分，从包括硫代磷酸酯，甲基磷酸酯和甲基硫代磷酸酯的组中选择。
13．权利要求1的组合物，其中反义寡核苷酸含有一个或多个2’O-甲基核苷酸。
14．含有有效浓度权利要求1的聚合核苷酸和可药用载体的组合物。
15．权利要求14的组合物，含有可药用的，可雾化载体。
16．包含向感染呼吸道合胞病毒的受试者中形成有效数量复合物的治疗方法，复合物含有a)一段反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的序列与一呼吸道合胞病毒株的反基因组RNA链的通常单链部分中15至20个核苷酸互补；和b)激活的RNA酶L。
17．包含一步对感染呼吸道合胞病毒的主体给药有效数量含有聚合核苷酸组合物的处理方法，其基本组成为a)一段反义寡核苷酸，在第一末端有羟基部分，其中所述寡核苷酸的序列与呼吸道合胞病毒一株的反基因组RNA链的通常单链部分中约15至20个核苷酸互补；b)连到第一末端的连接臂；c)连到连接臂的RNA酶L的激活剂；和d)可药用的，可雾化载体。
18．含有一段有15到20个5’-3’连接核苷酸的反义寡核苷酸的化合物，此寡核苷酸与RSV反基因组RNA链的一部分互补，所述部分从由RSV A2株基因组残基617-663，残基718-772，残基2490-2530，残基3212-3247，残基5240-5288，和残基8251-8299组成的组中选择，以5’→3’方向编号。
19．权利要求18的化合物，其中反义寡核苷酸是18或19个5’-3’连接的核苷酸。
全文摘要
本发明涉及用于治疗呼吸道合胞病毒感染的化合物和方法。这些化合物包括一个反义部分,和正常的RSV反基因组链(mRNA链)的单链部分互补,一个连接子和普遍存在的非特异RNA酶RNA酶L的寡核苷酸激活剂。该方法包括形成激活的RNA酶L和反义分子的复合物。本申请阐述了确定RSV反基因组链的哪部分是正常单链的方法。本申请阐述具有RSV基因组8281－8299残基序列的反义寡核苷酸在实施本发明中非常有用,并提供优于传统可选药物,病毒唑的体外结果。
文档编号A61K31/7088GK1215994SQ97193797
公开日1999年5月5日 申请日期1997年2月14日 优先权日1996年2月15日
发明者P·F·托尔伦瑟, R·H·思尔维尔曼, N·M·思里诺, G·李, W·肖 申请人:国家健康学会, 克里夫兰诊所基金会