专利名称：类胡萝卜素制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及类胡萝卜素组合物或类胡萝卜素分散在由脂肪酸和甘油酯化所得的油中的制剂。更具体地说，本发明涉及类胡萝卜素组合物或类胡萝卜素在中链甘油三酯油中的制剂。
本发明的背景技术近年来，不论是研究人员还是企业，对称为类胡萝卜素的这类化合物的研究兴趣都在增加。类胡萝卜素是广泛存在于植物和动物中的天然物质，并且通常是有色化合物，它们大多使水果和蔬菜呈黄色到红色。甲壳纲动物例如龙虾的红色和奶油的乳色也是由于类胡萝卜素所致。流行病学研究表明，类胡萝卜素番茄红素(番茄红素的主要饮食来源是番茄)在人体内具有抗癌作用。然而，到目前为止，没有任何关于食用番茄红素在已建立的动物模型内抑制肿瘤发展的能力的研究。
由于类胡萝卜素在低浓度也具有高强度颜色，并且从天然物中提取它们的成本很高，所以在本世纪中叶，有机化学家成功地合成了一些具有重要经济价值的类胡萝卜素。β-胡萝卜素和角黄素以及一些衍生物已经成为市售食用色素、食品强化剂和动物色素前体，特别是由Europeancompanies Hoffman-LaRoche AG和BASF AG出售的商品。
类胡萝卜素具有独特的共轭碳-碳双键化学结构。在主要的市售类胡萝卜素中，有9个双键，它们使得分子具有特殊的物理和化学性质。尤其是，类胡萝卜素与氧和游离基的反应性很强，因此类胡萝卜素可归为常用抗氧化剂。类胡萝卜素存在于人、动物和植物组织中。出于对环境的应急状态例如高于正常温度和高光强度的反应，一些生命体内也会产生较高浓度的类胡萝卜素。类胡萝卜素在水中的溶解度通常很低，因此其位于活细胞的膜和脂质聚集体内。在生命体内，类胡萝卜素的浓度通常相当低，大约为10-100ppm。
在制备现在可从天然物中提取到以及可通过化学合成方法制得的高浓度市售类胡萝卜素产品过程中，需要稳定类胡萝卜素以使其不被空气中的氧氧化。类胡萝卜素分子也会由于酶或微生物作用而降解，但是这种情况通常在低浓度(例如低于0.1％)和水环境下发生。氧化速率与类胡萝卜素的化学结构有很大关系。一些类胡萝卜素的反应性非常强，并且其均匀分散的高浓度晶体形式在空气中能自动引发反应。番茄红素是其中一种最易氧化的常见类胡萝卜素，并且在制备市售产品的过程中，稳定番茄红素或含番茄红素的组合物对于整个产品非常重要。不能防止一些类胡萝卜素的氧化已给其带来了商业化困难。
据证实，类胡萝卜素的稳定通常很困难。其中一种有助于防止氧化的手段是在惰性气体中保存纯的结晶类胡萝卜素物质，然而，这仅在实验室规模上有实际意义，并没有商用价值。还已知将类胡萝卜素组合物悬浮在甘油三酯油(例如大豆油)中以帮助防止氧化。虽然据证明使用用溶剂和大豆提取的大豆油(碳链长主要为C16-C18的油)对一些类胡萝卜素如β-胡萝卜素非常有效，但是在商业规模上其不能阻止其它类胡萝卜素如番茄红素的降解。
发明简述因此，本发明的目的是提供抗类胡萝卜素氧化的方法。令人惊奇的是，已经发现，类胡萝卜素组合物或类胡萝卜素在由脂肪酸和甘油酯化所得的油(不是用溶剂从天然物中提取的油)中的悬浮液或分散液能减轻类胡萝卜素的氧化。此外，已发现，类胡萝卜素组合物或类胡萝卜素在链长为C6-C12的油(下文称为“中链甘油三酯油”)中的悬浮液或分散液使类胡萝卜素的氧化显著下降。
附图的简要说明附
图1图解说明了实施例1中所述的两种组合物的稳定性(各测试小瓶的平均值)。
附图2描述了实施例2所述的10周试验的时间线以确定番茄红素在雄性大鼠(结肠模型)和雌性大鼠(乳房模型)中的最大耐受剂量(MTD)。
附图3表示海胆酮和番茄红素的HPLC数据。
附图4表示所有5种标准类胡萝卜素，即玉米黄质、角黄素、海胆酮、番茄红素、和β-胡萝卜素的HPLC数据。
附图5表示用结晶番茄红素和海胆酮产生的番茄红素的标准曲线。
附图6表示番茄红素悬浮液的HPLC分析结果。
附图7表示番茄红素悬浮液中存在的类胡萝卜素的化学结构。
附图8-11表示番茄红素对动物体重增加的影响。
附图12表示从肝脏中提取的皂化有机提取物的HPLC-MS分析结果，该结果表明其中含有大量的番茄红素、六氢番茄红素和八氢番茄红素及它们的几何异构体。
本发明优选实施方案的详细描述一方面，本发明提供了包含胡萝卜素组合物或类胡萝卜素在由脂肪酸和甘油酯化所得的油中的悬浮液/分散液的制剂。使用这样已酯化的油基本上减小了制剂中出现杂质—即在用溶剂从天然物如大豆中提取的油中存在的杂质的可能性。优选使用基本上纯净的脂肪酸和甘油来进行酯化。优选通过蒸馏来纯化脂肪酸。所用油优选为中链甘油三酯油。甘油三酯是脂肪酸和甘油成的酯。脂肪和油的主要组分—甘油三酯具有通式CH2(OOCR1)CH(OOCR2)CH2(OOCR3)，其中R1、R2和R3可具有不同链长。在本发明说明书上下文中，优选的甘油三酯的链长为C6-C12、更优选C8-C10。
另一方面，本发明提供了包含类胡萝卜素组合物或类胡萝卜素在中链甘油三酯油中的悬浮液/分散液的制剂。再一次优选的是，中链甘油三酯油的链长为C8-C10。所述中链甘油三酯油优选用脂肪酸和甘油酯化制得。同样，优选使用基本上纯净的脂肪酸和甘油来进行酯化，其中优选通过蒸馏来纯化脂肪酸。
在本发明优选的形式中，类胡萝卜素组合物主要包含类胡萝卜素。类胡萝卜素优选选自番茄红素、β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素和六氢番茄红素或它们的混合物。番茄红素是优选的类胡萝卜素。类胡萝卜素组合物和类胡萝卜素优选得自天然物。
在本发明优选的实施方案中，中链甘油三酯油是市售的Delios VTM，这是由Grunan Lebensmitteltechnologie生产的中链甘油三酯油。另一优选的中链甘油三酯油被登记为CAS 73398-61-5，这是用辛酸和癸酸制成的混合甘油三酯。该中链甘油三酯油可以其商品名Neobee从Stepan Co.，Northfield，lllinois购得。中链甘油三酯油的酸单体优选选自C6己酸、C8辛酸、C10癸酸和C12月桂酸或它们的混合物。优选使用纯化的脂肪酸和甘油来制备中链甘油三酯油，因为使用这些材料能减小油中含有还会引起类胡萝卜素氧化的杂质的可能性。在优选的实施方式中，中链甘油三酯油得自天然物。
在本发明另一优选的实施方案中，类胡萝卜素占制剂重量的高达10％。类胡萝卜素优选占制剂重量的4％-5％。在本发明另一优选的实施方案中，油占制剂重量的高达98％、更优选20％-80％、最优选30％-70％。
组合物优选含有油溶性抗氧化剂。加入抗氧化剂进一步有助于防止类胡萝卜素氧化。抗氧化剂优选选自生育酚、丁化羟基苯甲醚、丁化羟基甲苯、没食子酸丙酯、乙氧喹、和抗坏血酸棕榈酸酯以及其它可从草药中得到的天然抗氧化剂提取物，优选天然生育酚、及其混合物。生育酚优选选自β-、γ-和δ-生育酚或它们的混合物。在本发明其它优选的实施方式中，抗氧化剂占制剂重量的高达15％、优选5％-10％。
对于口服给药，本发明组合物还选择性地还含有适于口服给药的可药用载体。本发明口服组合物可用制药领域已知的常规混合方法制得，即将活性物质与适于系统给药并在口服剂型中常用的、可食用的可药用无毒惰性、固态或液态载体和/或赋形剂混合。口服药物组合物可以制成包括缓释片剂在内的片剂、锭剂、口香糖、和胶囊。最优选软明胶胶囊剂型。本领域技术人员可按照本领域已知技术制备这些剂型，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990)，MackPublishing Co.，Easton，PA中描述的技术。
本发明还提供了提供生物可利用抗氧化剂的方法，包括将有效量悬浮或分散在中链甘油三酯中的番茄红素对宿主口服给药。在本发明说明书上下文中，应当理解术语“宿主”不仅包括人，还包括非人动物、尤其是哺乳动物。该方法包括，将有效量的包含类胡萝卜素的油悬浮液/分散液的组合物、例如以约1-1000μg/kg类胡萝卜素的剂量给药到患者体内。优选的剂量约为10-100μg/kg类胡萝卜素。在实施本发明方法过程中，本发明组合物可每天给药一次或每天给药多次。治疗方案可能需要在延长的期间内给药。每次给药剂量或总给药剂量将由医师根据例如疾病的类型和严重程度、患者的年龄及健康状况、以及患者对该化合物的耐受性等因素确定。
本发明还提供了在需要治疗的患者中治疗或防止癌症的方法。在本发明说明书上下文中，应当理解术语“患者”不仅包括人，还包括非人动物、尤其是哺乳动物。该方法包括，将有效量的包含类胡萝卜素的油悬浮液/分散液的组合物、例如以约1-1000μg/kg类胡萝卜素的剂量给药到患者体内。优选的剂量约为10-100μg/kg类胡萝卜素。在实施本发明方法过程中，本发明组合物可每天给药一次或每天给药多次。治疗方案可能需要在延长的期间内给药。每次给药剂量或总给药剂量将由医师根据例如疾病的类型和严重程度、患者的年龄及健康状况、以及患者对该化合物的耐受性等因素确定。
可通过将本发明组合物本身、或将其与包括其它抗氧化剂在内的其它活性组分和/或治疗剂在药物组合物中一起给药来实施该方法。其它适用于本发明的治疗剂是能通过相同或其它机理有效地实现本发明目的的任一可配伍药物，或其活性与本发明制剂或组合物的活性具有补充或协同作用的药物。
联合治疗所使用的化合物或活性剂可与本发明组合物在不同或同一制剂中同时给药，或在不同时间给药、例如依次给药，这样就达到了联合治疗的效果。给药剂量和方案将由医师调节，优选先降低其标准剂量，然后确定所获得的结果，来确定最佳给药剂量和方案。
在下面本发明优选实施方案的详细描述及后面所附权利要求中，进一步解释了本发明的特征，本发明的上述和其它目的、优点和特征将变得更加清楚。
实施例实施例1制剂和稳定性测试为了证实酯化油的改善了的抗氧化作用，用含有番茄红素作为类胡萝卜素的类胡萝卜素组合物(“番茄红素组合物”)进行两个比较试验。其中一个试验包括番茄红素组合物在用溶剂从大豆中提取的大豆油中的悬浮液/分散液，另一试验包括番茄红素组合物在由脂肪酸和甘油酯化所得的中链甘油三酯油中的悬浮液/分散液。然后比较试验结果。
材料试验所用番茄红素组合物是从番茄中提取的。
所用中链甘油三酯油是通过将椰子油的脂肪酸分馏，然后将所选的具有8个和10个碳原子的脂肪酸的馏分与高纯度甘油酯化而制得的。以这种方式形成油可减少在直接从动植物中提取的油中所出现的杂质。大豆油是从大豆中提取的标准油。
将两批10千克番茄红素组合物分别分散在作为稀释剂或悬浮/分散油的各15千克大豆油(“组合物1”)和中链甘油三酯油(“组合物2”)中，用有效的混合方法将其混合来形成连续相。各取1克每一组合物的样本放在玻璃小瓶中以测试。
测试过程和结果用分光光度计分别测定组合物1和组合物2中番茄红素的浓度，以确定在下述时间番茄红素的浓度0月(即组合物制备后不久)；1个月；2个月；和3个月。
(a)分析方法将各样本溶解在氯仿中，并用环己烷稀释至适当浓度。在20℃、特定波长处测定吸光度，由已知的消光系数计算浓度。
使用下述试剂和仪器配有10mm玻璃比色槽的分光光度计分析天平100ml容量瓶50ml容量瓶2.0ml球吸管氯仿，AR级环己烷在进行测试时，药物番茄红素在光照下会缓慢降解，因此使用低闪光玻璃。对于每一样本，都进行下述操作。将各0.5-1.0克5％的番茄红素油悬浮液分别精确称重到100ml容量瓶中。加入约5ml氯仿，将试剂充分混合以使样本溶解。
对着光观察各样本，以确保其完全溶解。
为了确保各样本完全溶解，将其放置5分钟，再加入5ml氯仿，并在热自来水下保温(如果需要的话)。
用环己烷将溶液稀释至容量瓶体积并充分混合。此为溶液A。将2ml溶液A吸量到50ml容量瓶中，用环己烷稀释至容量瓶体积并充分混合。此为溶液B。
将2ml溶液B吸量到50ml容量瓶中，用环己烷稀释至容量瓶体积并充分混合；此为溶液C。
用环己烷在两个比色槽中将分光光度计(具有2nm狭缝宽度)调零，以环己烷作为空白，在472nm波长处测定溶液C的吸光度。该分析重复进行两次。
在计算结果过程中，使用下述标准A＝溶液C在472nm波长处的吸光度m＝样本重量E＝在472nm波长处的消光系数E1％/1cm＝3450C＝番茄红素的浓度(％)C＝(A×稀释度)/(E×m)在测试的间隔期内，两种组合物都在25℃摄氏温度下贮存。
在测试期间发现，贮存数月后番茄红素趋于形成大晶体，有时晶体会达到2-3mm。因为形成的大晶体可能会由于取样误差而严重影响分析结果，所以玻璃小瓶中的1克该材料样本是制备后立即采取的样本，并在25℃温度下贮存。每间隔一个月，取小瓶来检测，并且检测全部含量来克服结晶所带来的取样问题。
(b)结果如附图1和表1所示，将各个测试小瓶中的两种组合物的稳定性测试结果平均表1
结果讨论上述试验结果表明，在3个月期间内，番茄红素在中链甘油三酯油(组合物2)中的浓度恒定，实际上，3个月后平均百分浓度与组合物2制备后的即时浓度相同。在3个月期间内，番茄红素在大豆油(组合物1)中的浓度测试结果表现为，番茄红素的％重量浓度稳步下降。
这些结果证实，由脂肪酸和甘油酯化所得的油(在本项试验中是中链甘油三酯油)具有防止番茄红素氧化的稳定作用。
实施例2番茄红素的临床前毒性和稳定性本实施例试验的目的是确定食物中番茄红素的生物可接收剂量范围、摄取和组织分布。
具体目的确定在AIN-76A食物里给药的番茄红素在雄性和雌性Fischer 344大鼠中的最大耐受剂量，和评价食物中的番茄红素在血液、粪便和不同器官如乳腺、前列腺、结肠和肺中的摄取和分布。
方法同系繁殖的雄性(n＝70)和雌性(n＝70)Fischer 344大鼠得自Taconic Farms，Germantown，NY.在大鼠长到约35天大小时，将所有大鼠从隔离区转移到实验室中。然后用常规随机法将大鼠分配成测试组，以确保各组包含具有相同平均体重的大鼠。
如表2及附图2所示，进行10周试验，来测定番茄红素在雄性大鼠(结肠模型)和雌性大鼠(乳房模型)中的最大耐受剂量(MTD)。剂量范围的选择是根据已公开的β-胡萝卜素的值。将含有5.7％类胡萝卜素、其中包含3.7％纯番茄红素的混合的类胡萝卜素组合物悬浮在中链甘油三酯中(该组合物在下文中称为“番茄红素悬浮液”)。把该番茄红素悬浮液掺入 AIN-76A食物中。
表2MTD试验
a基于番茄红素MW＝536
在弱光下配制食物，并以4千克批量贮存在-4℃温度下的密封容器中。AIN-76A食物的组成如表3所示。
表3标准AIN-76A食物
通过在饮食中补充适当量的Neobee中链甘油三酯(Stepan Co.，Maywood，NJ)来控制各治疗组所摄取的脂质含的差异，这样包括对照组在内的所有大鼠就摄取了相同量的食用脂肪。
试验结束前，将各组中的3只大鼠置于代谢笼中，采集24小时内的尿和粪便以进行随后的番茄红素分析。通过在麻醉状态下的心脏穿刺术采集血液来进行番茄红素分析，通过CO2麻醉将所有大鼠处死。在-20℃贮存血液和粪便。在尸体剖检时，将所有主要器官系统进行粗检。把任一显示异常的组织置于福尔马林中，并保存以进行以后的组织学检查。
每周记录一次大鼠体重，评价大鼠外貌(外表特征)和食物回避行为。通过集中，最大耐受剂量是导致平均体重下降＞10％的剂量。
表4检测番茄红素的HPLC方法
进样溶剂混合物40％乙腈20％甲醇20％己烷20％二氯甲烷通过HPLC定量测定番茄红素
HPLC装置、溶剂系统、和溶剂程序列在表4中。用类胡萝卜素结晶作为标准，包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄质、隐黄质、和海胆酮(Hoffmann-LaRoche)。使用β-胡萝卜素的酮衍生物海胆酮作为内标。用进样溶剂(表4)将标准物制备成浓度为30μg/ml的储备溶液。
(1)番茄红素(RO 01-9251-00)(2)玉米黄质(RO 01-9371-000)(3)隐黄质(RO 04-0763-000)(4)9-胡萝卜素(RO 01-8300-000)(5)海胆酮(RO 04-2847-000)通过用5天时间比较从番茄红素和海胆酮的标准溶液取样的多样本来检测该系统的变异性和可靠性(表5)。番茄红素的保留时间从最低32.58分钟变化到最高35.95分钟；海胆酮的保留时间从最低28.54分钟变化到最高30.64分钟。番茄红素/海胆酮的比例从最低1.12变化到最高1.20。当比较曲线下积分面积时，发现了类似低水平的样本内差异(表5)。
通过使用番茄红素结晶和海胆酮，产生了番茄红素的标准曲线(附图5)。试验值是从标准曲线上读取的，并且以ng/ml或ng/μg/g组织湿重来表示。
表5类胡萝卜素HPLC测试变异性和可靠性测试程序 RT番茄红素番茄红素 海胆酮比值(番茄红素/ 比值(番茄红素/海胆酮)番茄红素海胆酮 海胆酮)第一天1 33.1729.15 1.14 586,132720,121 0.812 32.912 8.89 1.14 567,339755,926 0.753 33.4929.86 1.12 527,365737,088 0.724 34.4830.47 1.13 532,491765,646 0.705 34.4730.45 1.13 527,024772,265 0.686 34.6430.64 1.13 496,268768,335 0.65第三天7 34.0528.30 1.20 511,111781,883 0.658 33.0429.03 1.14 551,826736,851 0.75第五天9 32.9928.78 1.15 624,986803,354 0.781032.5828.32 1.15 573,498793,606 0.721132.8128.54 1.15 562,057823,087 0.681235.9530.11 1.19 612,266859,039 0.711334.5029.86 1.16 543,684869,292 0.63X 33.7829.42 1.15 555,085783,576 0.71S 0.99 0.85 0.023 37,924 45,566 0.053C.V.(％) 2.9 2.92.06.85.8 7.5RT＝保留时间(分钟)AREA＝曲线下的积分面积食物如下所述从食物中提取番茄红素将含有番茄红素的样本悬浮在进样溶剂(表4)中，并在多管(polytron)匀浆器中匀浆。加入海胆酮作为内标，将混合物在4℃、3000rpm转速下离心15分钟。倾出上清液，保存，并重复提取。然后将合并的提取物在氮气下于60℃干燥，将剩余物溶解在0.5ml进样溶剂中，然后进行HPLC分析。同样的方法，进行最小的变化，适用于粪便和肺组织。提取番茄红素的效率如表6A和B所示。在所有测试浓度下，提取效率从最高浓度的75％到最低番茄红素浓度下的100％不等。
血清从血清中提取番茄红素是这样进行的将1ml血清加到0.1ml海胆酮标准物和0.9ml乙醇的混合物中。然后把混合物涡旋振荡20秒，加入2.0ml己烷，剧烈混合1分钟。然后将此混浊的混合物在4℃、3000rpm转速下离心15分钟，倾出澄清的己烷层。把上述步骤重复3-5次。合并己烷部分，然后在氮气下于60℃干燥，将剩余物溶解在0.5ml HPLC溶剂中，进行HPLC分析。
组织乳房、肝脏和前列腺组织含有会干扰本项分析的脂质。因此，组织的皂化步骤需要在器官提取之前进行。将组织在加入海胆酮作为内标的20ml甲醇中匀浆。对于包含85％脂肪细胞的乳房组织，加入8.0ml 50％的NaOH和4.0ml 25％的抗坏血酸钠，将混合物匀浆。对于含有较少脂质的前列腺和肝脏组织，加入4.0ml 50％的NaOH和2.0ml 25％的抗坏血酸钠，将混合物匀浆。皂化是在用氮气过夜饱和的50ml管中、在温度控制震动器浴中于30℃进行的。皂化后，向各管中加入10ml己烷，涡旋振荡1分钟。将混合物在4℃、2000rpm转速下离心10分钟，倾出己烷层并保存。将该己烷提取步骤重复5-7次。合并己烷提取物，然后在氮气下于60℃干燥，将剩余物溶解在进样溶剂中，进行HPLC分析。除了不进行皂化以外，按相同方式从肺和结肠组织中提取番茄红素。
表6A&B从AIN-76A食物中提取番茄红素的效率6A组号 番茄红素在食物中的浓度 提取物 进样量 提取后番茄红素的浓度样本重量体积(μg/g) (g) (ml)(μl)(μg/g)1 1,280 0.5 100 20 975 (76％)2 512 0.5 100 20 321 (63％)X403 (79％)3 256 0.5 50 20 192 (75％)4 128 0.5 50 50 122 (95％)X101 (86％)5 511.0 50 50 62 (100％)X52 (100％)6B编号 海胆酮 番茄红素比值(番茄红素/ 浓度海胆酮) (μg/g)曲线下面积标准 2,590,8062,191,3320.852,754,2532,505,1140.9112,891,2114,493,4991.55 97522,980,7581,527,3160.51 321X2,618,2661,663,1870.64 40332,804,0031,705,1600.61 19242,236,7102,179,3220.97 122X2,636,0442,087,9830.80 10152,647,4782,620,9000.99 62X2,613,3852,171,0470.83 52I.番茄红素悬浮液的分析当番茄红素悬浮液(Henkel Corporation，La Grange，IL)是通过有机提取法提取的时，主要的类胡萝卜素是番茄红素，但也存在许多其它已知在番茄中存在的类胡萝卜素、α-和β-胡萝卜素、六氢番茄红素和八氢番茄红素(附图6和7)。用安装有光电二极管阵列检测器的上述HPLC系统对番茄红素悬浮液中的类胡萝卜素进行定量分析。6种主要组分如表7所示。
表7番茄红素悬浮液的类胡萝卜素定量分析μg/gm％(g/100g) 占类胡萝卜素总量的％1.番茄红素 375043.7504662.β-胡萝卜素124431.2443223.六氢番茄红素 3349 0.334964.八氢番茄红素 2794 0.279455.ζ-胡萝卜素440 0.04400.76. 2，6-环番茄红素-1，5-二醇 471 0.04400.7类胡萝卜素总量 570015.7 100番茄红素的含量是3.7％，然而，类胡萝卜素的总含量约为5.7％。因此，当以占类胡萝卜素总量的％表示时，番茄红素占67％，β-胡萝卜素占20％；番茄红素的前体—六氢番茄红素和八氢番茄红素分别占5％，ζ-胡萝卜素和2，6-环番茄红素-1，5-二醇分别占0.7％。按照5.72％(而不是4％)的类胡萝卜素总含量重新计算番茄红素在食物中的浓度，结果得到了下述各治疗组的浓度组1，1280；组2，512；组3，256；组4，128；和组5，51(mg/kg食物)。因此，番茄红素悬浮液不是纯番茄红素制剂，该悬浮液含有5.9％番茄红素、α-和β-胡萝卜素、六氢番茄红素和八氢番茄红素(番茄红素的前体)悬浮在中链甘油三酯中的悬浮液。对于化学预防研究这实际上是有利的，因为番茄红素悬浮液的这种类胡萝卜素组成和含量接近于市售番茄中类胡萝卜素的组成和含量(参见Khachik，F，Beecher，G.R.食物要素国际会议(International Conference on Food Factors)化学与癌症预防。将类胡萝卜素在水果和蔬菜中的分布作为选择化学预防剂的准则。H.Ohigashi(ed.)，Springer-Verlag，Tokyo，1996(印刷))。
II.在食物中的稳定性一经将番茄红素悬浮液掺入到食物中，就马上用两种方法测定其稳定性。第一种方法是将含有该悬浮液的食物在4℃的黑暗中放置3周(表8A，B)。
表8A & 8B食物中番茄红素的稳定性试验a8A组号 日期#天数(在冰箱中) 番茄红素浓度(μg/g) ％b1 5/1 1748 1012 5/8 8728 983 5/14 14 672 904 5/21 21 534 72aAIN-76A食物b以食物的浓度(04/40)，744μg/g作为100％8B组号海胆酮a番茄红素 比值(番茄红素/海胆酮)浓度(μg/g)曲线下面积标准 246164921179040.861 230436124862901.08 7482 242213425459731.05 7283 232537922650870.97 6724 233494717876560.77 534a内标在不同时间，采取食物样本，并如下所述提取番茄红素将约0.5-1.0g样本加到15ml由40％的乙腈、20％的己烷、20％的甲醇和20％的二氯甲烷组成的提取溶剂中。将混合物超声处理2分钟，然后放置5分钟。倾出微红-橙色澄清上清液。将该操作重复4次，在重复过程中得到的上清液是无色的。然后加入溶剂至25-100ml，将混合物离心，倾出上清液。然后将所有上清液混合。上述溶剂起两个作用首先，对于提取番茄红素它是最有效的混合物，其次，它是与用于将番茄红素样本注射到HPLC中的溶剂相同的溶剂。如表8所示，在4℃的黑暗中放置3周后，番茄红素降解至约为第1天含量的72％；2周后约降解了10％。这表明，对于本项进食试验，2周的贮存时间将是最好的。
第二种方法是，将含有番茄红素的食物暴露在空气和光中，照这种方式，进行实际的进食试验。番茄红素在暴露于空气和光的食物杯子中的稳定性如表9所示。
表9AIN-76A食物中的番茄红素在室温下的稳定性日期在食物杯中放置的天数浓度 (μg/g)4/300 7445/2 2 7025/3 3 6165/6 6 5475/7 7 4395/9 9 6245/1010 5765/1313 4495/1414 4195/1515 4255/1717 4315/2020 3855/2121 376显然，在48小时内，番茄红素仅有少量减少。72小时后，番茄红素约减少了20％。3周后，初始量的番茄红素已有一半检测不到。根据这些结果，将食物在食物杯中放置不超过48小时。
含有番茄红素悬浮液的食物在20℃贮存7个月后，测定其中存在的所有主要类胡萝卜素(表10)。结果发现，番茄红素悬浮液中存在的所有主要类胡萝卜素与番茄红素代谢物以相同的相对比例存在于食物中。然而，7个月后，处理组1-5的番茄红素的净损失分别为66％、38％、40％、44％和60％；而在相同时间内，与初始值相比，β-胡萝卜素浓度仅下降了10％。
表10用番茄红素悬浮液补充的食物中的类胡萝卜素含量aμg/gm(ppm)食物mM/kgβ- ξ- 六氢番茄红素八氢番茄红素2，6-食物 番茄红素 胡萝卜素 胡萝卜素 环番茄红素-1，5-二醇1 2.5 472284 1 587022 1.0 348138 9 28231.43 0.5 16869 4 140.32 0.764 0.2592 37 2 8 5 0.465 0.1022 80 2 1 0.146 0 0 00 0 0 0a 食物在-20℃贮存7个月III.预进食试验用类胡萝卜素含量为2.5mM番茄红素(+其它类胡萝卜素)/kg食物的食物给一只雄性大鼠喂养3周。在该高剂量下，没有发现体重或食物消耗量有任何变化。粪便呈现出显著的红色，部分外皮也呈现出红色。尾部是棕色。在尸体剖检时发现，肝脏呈深红色，盲肠和小肠也是如此。在腹部脂肪组织或前列腺和小囊内发现了小程度的变色。
24小时内粪便团中的番茄红素分析(表11)表明，所进食的食物中总的番茄红素大约有55％分泌到粪便内。这表明剩余的番茄红素被吸收到肠中。还必须考虑一些番茄红素在提取前的贮存过程中降解的可能性。发现在提取番茄红素前将粪便团冷冻干燥是提取番茄红素的最有效方法。这毫无疑问是因为粪便团中存在水并且粪便团具有几何形状。一经冷冻干燥，粪便团即可容易地粉末化，这使溶剂能更容易地进入到粪便基层内。
表11粪便中番茄红素的分析食物中的 食物消耗量番茄红素 24小时排泄粪便中24小时粪便中 排泄量％效率番茄红素的估计总是 的粪便重量 番茄红素含量番茄红素总量 进食量(μg/g) (g/24h) (μg)(g)(μg/g) (μg)有机提取744 13-159,7841.442,992 4,309 4.309 449,784冷冻干燥+744 13-159,7841.443,754 5,406 5.405 55有机提取9,784
IV.进食试验(1)体重增加番茄红素对动物体重增加的影响如表12和13、图8-11所示。当通过分析重复测试差异来进行评价时，在用补充有不同剂量番茄红素的食物喂养的大鼠之间，体重增加没有任何不同。在10周末，对照组大鼠的体重增加程度比番茄红素补充组大鼠要高一点，但这种差异不超过10％，一般的截止点表示食物回避或毒性。
表12食物中的番茄红素对雌性F344大鼠a体重增加的影响组番茄红素混合物(ppm)体重(g×SD)周0周81 1280 86±5 168±102 521 86±5 169±93 251 86±5 171±134 128 86±5 173±85 51 86±5 168±136 对照 86±5 172±15aN＝10/组表13食物中的番茄红素对雄性F344大鼠a体重增加的影响组番茄红素混合物(ppm)体重(gms×SD)周0周81 1280 113±6 276±302 512 113±6 280±193 256 113±6 279±264 128 113±6 279±125 51 113±6 280±226 对照 113±6 285±21
aN＝10/组(2)组织和血清摄取肝脏与血清或其它器官相比，番茄红素在肝脏中要浓100-1000倍。在最高剂量番茄红素(1280ppm)下，肝脏中番茄红素水平为33-120μg/g湿重(表14)。
表14用补充有番茄红素悬浮液a的食物喂养的大鼠的肝脏中类胡萝卜素含量雌性大鼠μg/gm (ppm)mM/kg 2，6-环番茄红素ξ-胡萝卜素 八氢番茄红素食物 食物 番茄红素 β-胡萝卜素 六氢番茄红素 -1，5-二醇1 2.5120 1117 10666 92 1.0646 848 35 53 0.5668 750 40 74 0.25 497 246 46 45 0.10 424 433 38 66 0 0 0 00 0 0雄性大鼠1 2.5333 530 23 42 1.05 1 15 4 .393 0.5605 584 21 44 0.25 3 1 1- - .285 0.10 121 110 10 .346 0 0 0 00 0 0通过HPLC-MS测定肝脏的皂化有机提取物，结果表明其中存在大量的番茄红素、六氢番茄红素和八氢番茄红素及其几何异构体(附图12)。另外，还检测到低水平的ζ-胡萝卜素、所有反-β-胡萝卜素、9-顺-β-胡萝卜素和13-顺-β-胡萝卜素。
在肝脏样本中还定量检测到了已经在前面人血清中检测到的番茄红素的两种氧化代谢物—即2，6-环番茄红素-1，5-二醇I和II，和在人血清中未检测到的其环氧化物前体2，6-环番茄红素-1，5-环氧化物I和II，检测到前述代谢物表明，2，6-环番茄红素-1，5-二醇除了来源自食物以外，肝脏也能将番茄红素代谢成这些代谢物。雌性大鼠肝脏中番茄红素的量一般比雄性高，在雄性大鼠中表现出非线性剂量-反应曲线，但在雌性中则没有。这些结果表明，番茄红素悬浮液中的类胡萝卜素被吸收并贮存在肝脏中，番茄红素以类似于在人中所发现的方式在大鼠中代谢。
血清血清番茄红素水平为从80到370ng/ml不等。在用补充有番茄红素悬浮液的食物喂养的雄性和雌性大鼠中，番茄红素在血清中的浓度与剂量呈非线性关系(表15)。令人惊奇的是，在雌性大鼠中，在组3(200ppm)和组4(100ppm)而不是所预期的组1(1000ppm)中发现了最高浓度。相类似的是，在雄性大鼠中，最高浓度是在组3中。在雌性大鼠中，低番茄红素(40ppm)组表现出最低的血清番茄红素浓度，但是在雄性大鼠中，在最高和最低番茄红素组之间则没有不同。
表15大鼠血清中番茄红素的浓度(ng/ml)a组编号 x±SD 中值 范围雌性大鼠1 187±043205 123--2322 169±042180 109--2113 245±083210 174--3664 313±047308 262--3695 145±053152 081--2076 0 0 0雄性大鼠1 168±036160 134--2302 227±068225 148--3263 278±066285 174--3724 231±064215 153--3285 171±049177 100--2386 0 0 0a N＝6这些结果表明，血清番茄红素水平由体内平衡机制调节，该机制包括肝脏贮存机制和以类似于维生素A的方式释放。此处所提供的大鼠中血清番茄红素水平也在所报导的食用正常水平的番茄或番茄产品的人的范围内，即0.1-5μg/ml血清(100-5000ng/ml)。
乳腺雌性大鼠乳房颊脂垫中的番茄红素浓度为从139到460ng/g湿重不等(表16)。与血清不同，发现在乳房组织和饮食番茄红素摄取量之间有常规的剂量-反应作用(表4)。
表16大鼠乳腺中的番茄红素含量(ng/g)a组编号x±SD 中值范围1 309±131235232--4602 200±030197172--2313 215±062220139--2824 229±054217181--2885 174±057143139--2396 0 0 01N＝3前列腺雄性大鼠前列腺中的番茄红素浓度为从32到147ng/g湿重不等(表17)。番茄红素在前列腺组织中的平均浓度比在乳房组织中的浓度低一个数量级。摄取的剂量相关模式在前列腺中很明显(表17)。
表17大鼠前列腺中的番茄红素含量(ng/g)a组编号x±SD 中值范围1 97±179979-1122 95±488354--1473 50±373523--934 52±265226--775 47±164732--636 0aN＝3肺雄性和雌性大鼠肺中的番茄红素浓度为从124到424ng/g湿重不等(表18和19)。在雌性大鼠中，在组1-4之间有高顶效应，然后在最低组(组5)有明确的降低。在雄性大鼠中，获得了除了没有组4中的增加以外的相似结果。
表18雄性大鼠肺中的番茄红素浓度(ng/g)a食物中番茄红素 (ngs/gm)组编号 大鼠编号 单个浓度的浓度 平均浓度11280 36-119319036-21872512 41-117021441-22573256 46-132537546-24244128 51-123920151-216255156-11715156-213560 61-10061-20
表19雌性大鼠肺中的番茄红素浓度(ng/g)a物中番茄红素(ngs/gm)组编号 大鼠编号单个浓度的浓度 平均浓度1 12801-11842271-22702 512 6-12802466-22113 256 11-1 24319311-2 1424 128 16-1 20821116-2 2145 51 21-1 14413421-2 1246 0 26-1 0026-2 0结肠对于结肠组织，不能获得精确值，因为类胡萝卜素进入粘膜小间隙，这使得不能评价细胞内(吸收的)类胡萝卜素和腔内(未吸收的)类胡萝卜素。结肠值一般与肺和乳房的值相似。
谷胱甘肽分析测定谷胱甘肽的原理是，该三肽硫醇—谷胱甘肽(Glu-Cys-Gly)的还原形式直接参与几种重要的细胞内反应，包括防止自由基损害的保护作用。与位于脂相中的类胡萝卜素不同，谷胱甘肽位于细胞的水相中，很明显，脂相和水相中的抗氧化剂彼此之间能以下述方式相互作用高水平的抗氧化剂可“节约”或限制其它抗氧化剂的消耗。分析血液、肝脏和肾中的所有(还原和氧化的)谷胱甘肽(表20-22)。
表20全血中谷胱甘肽测定结果-总结谷胱甘肽 (μmol/g)*番茄红素(ppm) 雌性大鼠 雄性大鼠01.010±0.0627 0.936±0.088851 0.832±0.158+1.030±0.0387128 0.890±0.202 0.920±0.169256 0.848±0.0988 0.910±0.106512 0.930±0.123 0.990±0.1411280 1.080±0.104 0.948±0.294*数值是平均值±S.D.，n＝5+与对照的显著性差异，p＜0.05表21肝脏中谷胱甘肽测定结果-总结谷胱甘肽(μmol/g)*番茄红素(ppm) 雌性大鼠 雄性大鼠0 5.45±0.366 6.13±0.516516.01±0.309 6.77±1.53128 6.54±1.09+5.38±0.363256 4.87±1.14 4.59±1.37512 5.88±0.492 6.90±1.0981280 7.38±0.705+7.16±1.95+*数值是平均值±S.D.，n＝5+与对照的显著性差异，p＜0.05
表22肾中谷胱甘肽测定结果-总结谷胱甘肽 (μmol/g)*番茄红素(ppm)雌性大鼠 雄性大鼠0 0.774±0.154 0.592±0.234510.900±0.101 0.688±0.316128 0.950±0.0758 0.686±0.170256 1.030±0.414+0.624±0.104512 1.090±0.163+0.854±0.055+1280 0.089±0.045+0.828±0.128+*数值是平均值±S.D.，n＝5+与对照的显著性差异，p＜0.05谷胱甘肽的测定是通过具有双重电化学检测的HPLC进行的(参见K1einman，W.A.& Richie，J.P.，《色谱杂志》(J.Chromatogr)B67273-80，1995)。仅在最高番茄红素水平情况下有谷胱甘肽水平的显著增加，并且这种情况仅发生在肝脏中。在肝脏、肾或全血中，谷胱甘肽没有表现出与剂量有关的变化。
肝脏中维生素A和维生素E分析研究补充番茄类胡萝卜素对两种重要脂溶性维生素即视黄醇和α-生育酚的吸收和贮存的影响。使用已建立的HPLC法，发现在雌性R-344大鼠中，肝脏中番茄红素的含量与视黄醇和α-生育酚的浓度都有很强的线性剂量-反应关系(表23)。
表23视黄醇和α-生育酚在大鼠肝脏中的浓度食物中的番茄红素 肝脏组编号mM/kg 食物 mg/kg 食物 视黄醇(μg/gm) α-生素酚(μg/gm)雌性大鼠1 2.5 1280 1302 472 1.0 512768 383 0.5 256858 394 0.25 128888 465 0.10 51 555 326 0 0 120 13雄性大鼠7 2.5 1280 388 288 1.0 512119 89 0.5 256584 2310 0.25 128--11 0.10 51 454 14对照组 0 0 16 0对于视黄醇，对照组和最高番茄红素剂量组之间有10倍的差异；对于α-生育酚，对照组和最高番茄红素剂量组之间有4倍的差异。雄性大鼠的数据也是类似于此。因为补充物含有很少或不含有视黄醇和维生素E，因此所有在肝脏中发现的视黄醇和维生素一定是来自AIN-76A食物。因此，类胡萝卜素补充物改变了肝脏对维生素A和维生素E的摄取和贮存。
总结(1)由番茄制得的番茄红素悬浮液中的主要组分是番茄红素(70％)，还含有一些包括α-和β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、黄体素、八氢番茄红素和六氢番茄红素在内的其它类胡萝卜素。
(2)在雄性或雌性大鼠中，番茄红素在所用剂量范围对食物摄取或体重增加没有不利影响。
(3)在室温光照下，番茄红素在食物中能稳定地保存7天；在4℃、黑暗条件下能稳定地保存21天。
(4)每天所食入的估计量的番茄红素大约有55％分泌到粪便中。
(5)番茄红素易于在大鼠肝脏中吸收和贮存。番茄红素还在肝脏中代谢，并且代谢途径类似于在人中发现的途径。血清中番茄红素水平不与食物摄取量呈线性关系，这表明血清番茄红素水平有相当严格的体内平衡控制。番茄红素在血清中浓度比在肝脏中浓度低2个数量级。在肺、前列腺、结肠和乳房组织中，番茄红素是以ng数量被检测到。摄取通常是与剂量有关，最低浓度一般是在喂养最少番茄红素的雄性和雌性组中、尤其是肝脏番茄红素浓度中发现的。
(6)除从以最高番茄红素水平喂养的大鼠测得的肝脏结果以外，在雄性和雌性大鼠中，全血、肝脏和肾中的谷胱甘肽浓度都与对照组相似。
(7)摄取番茄类胡萝卜素补充物后，肝脏中维生素E和维生素A浓度发生了与剂量有关的改变。因为补充物中既不含有维生素E也不含有维生素A，所以在肝脏中发现的水平增加的维生素E和维生素A是从食物中选择性摄取的。
最后，在F-344大鼠中，很明显掺入到AIN-76A半纯化食物中的番茄红素悬浮液中的整个类胡萝卜素易于吸收、进入循环中，并沉积在所有测试组织中。食物中的番茄红素大部分被吸收并贮存在肝脏中，番茄红素在肝脏中以类似于在人中所发现方式代谢。没有然后证据表明番茄红素在所用剂量范围内具有毒性。
虽然通过上述具体材料、操作和实施例描述并举例说明了本发明，但是应当理解，本发明并不限于这些特定的材料、材料的组合、和实施本发明所选的特定操作。这些详述的众多变化可以是暗含的，并且将能被本领域技术人员所理解。
权利要求
1.类胡萝卜素组合物，其中含有悬浮或分散在中链甘油三酯中的番茄红素。
2.权利要求1的组合物，其中所示中链甘油三酯是由中链脂肪酸和甘油酯化而得到的。
3.权利要求2的组合物，其中所述中链脂肪酸是C6-C12脂肪酸。
4.权利要求3的组合物，其中所述中链脂肪酸是C8-C10脂肪酸。
5.权利要求2的组合物，其中所述中链脂肪酸选自辛酸、癸酸、月桂酸、和它们的混合物。
6.权利要求1的组合物，其中含有占组合物重量高达10％的番茄红素。
7.权利要求6的组合物，其中含有占组合物重量4％-5％的番茄红素。
8.权利要求6的组合物，其中含有占组合物重量高达98％的中链甘油三酯。
9.权利要求8的组合物，其中含有占组合物重量20％-80％的中链甘油三酯。
10.权利要求9的组合物，其中含有占组合物重量30％-70％的中链甘油三酯。
11.权利要求8的组合物，其中还含有油溶性抗氧化剂。
12.权利要求11的组合物，其中所述油溶性抗氧化剂选自生育酚、丁化羟基苯甲醚、丁化羟基甲苯、没食子酸丙酯、乙氧喹、和抗坏血酸棕榈酸酯、天然生育酚、及它们的混合物。
13.权利要求12的组合物，其中所述生育酚选自β-、γ-和δ-生育酚和它们的混合物。
14.权利要求11的组合物，其中所述抗氧化剂占组合物重量的高达15％。
15.权利要求14的组合物，其中所述抗氧化剂占组合物重量的高达5％-10％。
16.提供生物可利用抗氧化剂的方法，包括将有效量悬浮或分散在中链甘油三酯中的番茄红素对宿主口服给药。
全文摘要
本发明提供了分散在由脂肪酸和甘油酯化所得的中链甘油三酯油中的番茄红素的组合物。
文档编号A61K31/01GK1272059SQ98807515
公开日2000年11月1日 申请日期1998年5月20日 优先权日1997年5月22日
发明者L·施利帕利刘斯, M·斯特拉汉, D·X·赫莱, E·G·斯佐克 申请人:亨克尔公司