专利名称：利用－氧化氮抑制鼻病毒感染的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学领域。更具体地，本发明涉及人鼻病毒领域。
背景技术：
鼻病毒感染是一般感冒的主要原因(18)，是人发病率最高的呼吸道疾病。近来还有证据表明鼻病毒感染在以下疾病的恶化过程中发挥着重要的作用哮喘(21、22、37)、慢性支气管炎(35)、窦炎(19、50)以及中耳炎(3)。尽管在鼻病毒感染上已经投入了巨额的医疗费用，但是对于病毒感染导致临床症状出现的潜在发病过程还知之甚少。
上皮细胞是鼻病毒的主要侵袭位点(6、51)。但是与流感病毒等其他呼吸道病毒不同，上皮细胞在感染后出现的细胞损伤似乎与鼻病毒感染的发病机理无关，因为在感染后的人上皮细胞培养物(49)或者患者鼻黏膜上(53、54)都没有观察到细胞毒性。有鉴于此，研究重点就集中到了这样的思路上，即症状是由于促炎细胞介素的作用引发的，而这些细胞介质正是鼻病毒感染引发产生的。这一设想的证据来源于以下两方面1)对实验诱发或天然发生感冒的受试者研究发现，包括细胞分裂素(36、4)、白介素1(IL-1)(40)以及白介素6(IL-6)在内的几种细胞介素在鼻腔分泌物中的水平升高，以及2)发现用鼻病毒感染纯化的人上皮细胞群，可以引发包括白介素8(IL-8)、白介素6(IL-6)以及粒细胞巨嗜细胞-集落刺激因子(GM-CSF)在内的促炎细胞因子的生成(49、55)，这些因子可能与疾病的发病机理有关。然而，迄今为止，对与上述这些鼻病毒导致产生的细胞因子中的每种有关的特定生化事件还一无所知，并且感冒过程中出现的特定细胞因子以及其他细胞介素的作用还有待研究。
发明概述本发明一个目的是提供减轻鼻病毒感染引发症状的方法。
本发明另一目的是提供减少鼻病毒复制的方法。
本发明一个目的是提供减少因鼻病毒诱发生成的细胞因子的方法。
本发明还有另一目的是提供一种对化合物进行筛选从而鉴定出能用于鼻病毒感染治疗或预防的药物。
本发明的上述以及其他目的可以通过下述提供一种能够减轻因鼻病毒感染诱发症状的方法来实现，该方法包括向感染鼻病毒的患者施用一种化合物。该化合物能够释放出一氧化氮(NO)。化合物的用量足以减轻与所述感染有关的一种或多种症状。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于减少鼻病毒复制的方法。该方法包括让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触。所述化合物能够释放出NO。施用足量的化合物可以抑制鼻病毒的复制。
根据本发明的另一方面，还提供了用于减少因鼻病毒感染诱发生成的细胞因子的方法。该方法包括下述步骤让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触。所述化合物能够释放出NO。施用足量的化合物可以抑制鼻病毒的复制。
本发明的另一个实施方案是一种用于减轻鼻病毒诱发症状的方法。该方法包括向感染了鼻病毒的人施用有效量的化合物。所述化合物能够诱导人呼吸道上皮细胞中的一氧化氮合成酶(NOS)，从而减轻感染引发的症状。
本发明另外还有一个实施方案提供了一种用于减少鼻病毒复制的方法。该方法包括让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触。所述化合物能够诱导人呼吸道上皮细胞中的NOS。该化合物以能够有效抑制鼻病毒复制的量施用。
本发明的另一方面还提供了一种减少鼻病毒诱发生成的细胞因子的方法。该方法包括让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触。所述化合物能够诱导人呼吸道上皮细胞中的NOS。该化合物以能够有效抑制鼻病毒复制的量施用。
本发明还有另一个实施方案是一种用于测试化合物从中鉴定出能用于治疗或预防一般感冒或与鼻病毒感染有关的其他疾病的侯选药物的方法。该方法包括下述步骤用人鼻病毒感染人呼吸道上皮细胞；让这些细胞与一种待测化合物接触；以及对至少一种促炎或嗜曙红一活性细胞因子的量进行测定，其中一种待测化合物能够减少上述细胞因子的生成量，它就是可以用于预防或治疗人鼻病毒感染的侯选药物。
本发明的另一个方面是另外一种用于测试化合物从中鉴定出能用于治疗或预防一般感冒或与鼻病毒感染有关的其他疾病的侯选药物的方法。该方法包括下述步骤用人鼻病毒感染人呼吸道上皮细胞；让这些细胞与一种待测化合物接触；对上述呼吸道上皮细胞中复制的鼻病毒基因组的量进行测定，其中一种化合物能够减少被复制的鼻病毒基因组的量，该化合物就是可以用于治疗或预防人鼻病毒感染的侯选药物。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗鼻病毒感染的药物组合物。该组合物包括一种液体制剂，该液体制剂中含有一种能释放出NO的化合物。所述液体制剂是滴鼻剂。
本发明的另一实施方案是用于将药物组合物施用到人鼻腔中的鼻用喷雾或点滴瓶。这种瓶包括一种液体制剂，该液体制剂中含有一种能释放出NO的化合物。
本发明另一方面是一种用于将一种抗鼻病毒组合物释放到人呼吸道的吸入器或喷雾器。这种装置包括一种液体制剂，该液体制剂中含有一种能够释放出NO的化合物。
因此，本发明向本领域提供了用于治疗鼻病毒感染的组合物、装置及方法，而且还提供了用于鉴定其他侯选治疗及预防药物的方法。
附图简述
图1用几株人鼻病毒(HRV)分别感染BEAS细胞24小时后细胞因子的生成情况。图1A显示的是IL-8的生成情况，图1B显示的是IL-6的生成情况。
图2HRV-14感染的BEAS-2B中，IL-8(左)和IL6(右)的稳定态mRNA水平及蛋白的诱导时程。图2A和图2B显示的是各种细胞因子及持家基因GAPDH的Northern印迹分析。图2C和图2D显示的是光密度比率，图2E和图2F给出的是在标记出的各个时间点生成的蛋白水平。数据出自典型实验(n＝3)。
图3HRV-16感染的BEAS-2B中，IL-8(左)和IL6(右)的稳定态mRNA水平及蛋白的诱导时程。图3A和B显示的是各种细胞因子及持家基因GAPDH的典型Northern印迹分析。图3C和3D给出的值是4个实验的光密度比率的平均值±标准误。图3E和3F给出的是各个时间点4个实验生成蛋白的平均值加SEM。星号表示各个数据相对于零时间点对照的显著增加(所有情况均为p＜0.05)。
图4放线菌酮没有改变HRV-16感染后1小时测量的IL-8(左)和IL-6(右)的稳定态mRNA水平。图4A和4B显示的是典型Northern印迹实验，图4C和4D显示的是4个实验的光密度比率的平均值±标准误。
图5布地奈德(budesonide)(10-7M)对HRV-16感染的BEAS-2B细胞中IL-8(左)和IL-6(右)的稳定态mRNA水平及蛋白的影响。图5A和5B显示的典型Northern印迹实验使用的是感染后1小时提取的mRNA。图5C和5D给出的是来自3个实验的光密度比率的平均值±标准误。图5E和5F给出的是3个实验中感染后7小时生成蛋白平均值±标准误。
图6HRV-16感染的BEAS-2B细胞中细胞因子生成受NONOate剂量依赖性抑制。图6A给出的是4个实验中HRV-16感染后4小时和24小时IL8生成的平均值±标准误，图6B显示的是IL-6生成的数据。星号表示在NONOate缺乏情况下感染后同一时间点的生成水平相比有显著抑制(所有情况均为p＜0.05)。
图7接种病毒24小时后收获的BEAS-2B上清液中HRV-16的滴度受NONOate剂量依赖性抑制。数据代表来自4个实验的平均值±标准误。星号表示与NONOate缺乏情况下的生成水平相比有显著抑制(所有情况均为p＜0.05)。
图8在感染操作过程的不同时间点加入失活的NONOate及活性NONOate，比较二者对BEAS-2B细胞中HRV-16诱导的细胞因子生成的作用。NONOate的使用终浓度为1000μM，蛋白水平是在感染后4小时测定的。图8A给出的是来自3个实验的IL-8生成的平均值±标准误。图8B给出的是IL-6的数据。星号表示与单独使用病毒时的生成水平相比有显著抑制(所有情况均为p＜0.05)。
图9感染HRV-16后的不同时间点，NONOate(500μM)对IL-8(左)和IL-6(右)的稳定态mRNA及蛋白的影响。图9A和9B显示的是各种细胞因子及持家基因GAPDH的典型Northern印迹分析。图9C和9D给出的值是在每个时间点3个实验光密度比率的平均值±标准误。图9E和9F给出的是各个时间点3个实验生成蛋白的±标准误。星号表示与单独使用病毒时的生成水平相比受到NONOate的显著抑制(所有情况均为p＜0.05)。
图10NONOate对HRV-16感染后24小时BEAS-2B细胞中GM-CSF(左)及RANTES(右)的生成的影响。数据表示来自4个实验的平均值±标准误。
图11HRV感染人支气管上皮原代细胞培养物能够诱导iNOS的mRNA的表达。细胞单独暴露于单独的培养基(泳道2和4)或暴露于HRV-16(泳道3和5)。在24小时(泳道2和3)和48小时提取细胞总RNA，并将起用于iNOS的RT-PCR扩增。用于PCR的引物能够扩增出一段长为500bp的产物。泳道1中是用于显示分子大小的DNA梯子(ladder)。
发明详述我们发现人鼻病毒能够诱发人呼吸道上皮细胞生成促炎细胞因子。而且，我们发现一氧化氮能显著抑制鼻病毒复制及病毒诱导的细胞因子表达，但不影响该细胞因子的mRNA水平。因此，可以通过施用NO供体或一氧化氮合成酶(NOS)诱导剂，从而实现预防及治疗的目的。由于NO可以影响复制及炎症状况，所以这样的治疗不仅可以减轻症状，而且能缩短炎症的病程。
优选地，以能够实现下述目的的量施用NO供体或NOS诱导剂，即能够对症状的出现、促炎因子的合成、嗜曙红-活性细胞因子的合成和/或病毒复制实现显著的抑制。这样的抑制至少为10％，优选至少20％，以及递增地更优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％或99％。通常与人鼻病毒有关的症状包括一般感冒、哮喘、窦炎、中耳炎以及支气管炎。上述这些以及其他症状都可以通过本发明得到减缓或抑制。
根据本发明，治疗方法包括所有能够将活性化合物施用到人呼吸道上皮细胞的方法。这类方法包括但不限于局部用药、滴鼻、吸入、汽雾、喷雾、含漱或冲洗。
可以使用能在原位产生NO的化合物。这类化合物包括但不限于硝化甘油、有机硝酸盐、林西多明、吗多明、以及乙酰青霉胺、3-吗啉代圣多尼明(3-morpholinosyndonimine)(SIN-1)、释放NO的阿司匹林衍生物、NOC-18、硝普钠、GEA3162、GEA3175、GEA5171、尼可地尔、C873754、N)及洛森(naroxen)、S-亚硝基索多斯坦(S-nitrosogsteine)、S-亚硝基谷胱甘肽、FR144420以及FK409、NOR4、NOC-7、[N(O)NO]-聚合体、婆西多明(pirsidomine)、2，2-二乙基-1-硝酰基肼(2，2-diethyl-1-nitrexylhudrazine)、呋罗森(furoxan)。优选地，这类化合物包括一个N2O2-部分。更优选地，该化合物是3-(2-羟基-2-亚硝基-1-丙基肼基)-1-丙胺(为NONOates这类物质中的一个成员)。已知可以糊剂和补片的方式将这类化合物应用于心脏组织。这些化合物可以应用于鼻腔、口腔、咽喉、支气管或呼吸系统的任一部分。也可以采取静脉内给药以及直接药物注射。通常，合适的剂量范围为每次使用约0.01mg～约10mg，优选0.1mg～5mg，以及更优选1mg～3mg。
可以用作NOS诱导剂的化合物包括本领域已知的任一物质。它们包括但不限于γ干扰素、TNF-α、IL-1β以及细菌脂多糖。根据本发明的方法，用于将上述组合物或化合物释放到呼吸道或耳道中的装置可以包括本领域中用于同类目的的任一常用装置。这些装置包括吸入器、喷雾器、滴鼻瓶、点滴瓶。适合用于释放药物到鼻腔、口腔、咽喉、支气管、肺、耳和/或窦中任一制剂形式都可以选用。
上述公开内容对本发明做了一般描述。参照下列特定实施例可以获得更加全面的理解，本发明中提供这些实施例只是用来说明，而非用来限制本发明的。
实施例为了进一步阐明鼻病毒一诱导细胞因子生成的动力学及机理，以及对这些途径实施的潜在治疗干预的效果进行评估，开展了当前的这些研究。我们的重点集中在IL-8及IL-6的病毒诱生上，这是因为鼻病毒感染时它们的生成量相当大，而且它们的生物学特性与感冒的发病机理有关。IL-8是嗜中性粒细胞的强化学引诱物，并且还是活化剂(5)，而且还具有淋巴细胞趋化活性(28)，上述这两种类型的细胞是鼻病毒感染过程中的优势细胞(29、54)。IL-6不仅能刺激T细胞的活化、诱导B细胞分化及抗体的生成(1)，而且还能刺激黏膜的IgA免疫反应(42)。就潜在干预而言，我们采用了两种方法。基于糖皮质激素具有广谱的免疫调节及抗炎效应(44)，包括它们能够抑制多种类型的细胞中数种细胞因子的生成(45)，我们测试了布地奈德这种强效糖皮质激素对上皮细胞中鼻病毒感染的影响。作为另外一种新方法，我们还对能够抑制病毒复制和上皮细胞中病毒-诱导细胞因子生成的一氧化氮供体的性能进行了研究。研究表明，具有血管扩张效力的一氧化氮(NO)能对炎症发挥调节作用(39)，而且研究表明一氧化氮在动物模型中具有抗病毒作用(7、12、20、24、32)，但是没有在人呼吸道上皮细胞中对这种性能进行测试。我们的研究表明，布地奈德适度抑制鼻病毒-诱发的细胞因子的生成，而不影响病毒复制。相反，NO能显著地抑制鼻病毒-诱发细胞因子的生成以及病毒复制，而且还可以对鼻病毒感染发挥治疗作用。
实施例1细胞传代的影响初步研究显示，重复的细胞传代会对BEAS-2B细胞中细胞因子的生成产生显著的影响。尽管从定性的角度而言，每次传代所获得的数据总是相同的，但是细胞传代对所产生细胞因子的绝对水平却具有进行性作用。例如，使用同样方法连续细胞传代的4个实验中，IL-8生成的量从7690pg/ml减少到3090pg/ml。因此，下面进行的每种实验都总是与使用同样细胞传代的实验配套进行的。
几个鼻病毒株在BEAS-2B细胞中细胞因子的生成上所发挥的作用的比较对相等感染剂量的4个不同鼻病毒株在细胞因子生成上发挥的作用做了比较，采用的细胞培养物为BEAS-2B细胞。上述使用的病毒株中的3个为14型、16型和19型，它们是鼻病毒中以细胞间黏附分子-1(ICAM-1)为受体的主组(major group)的成员，而剩下的1A型是与ICAM-1无关的次组(minor group)的成员。在感染后的24小时内，对上述所有病毒株诱导IL-8和IL-6生成的情况进行测量(图10)。所有病毒株作用的情况下，所产生的IL-8水平都约比IL-6高10倍。
材料下面使用的反应试剂购自Dulbecco’s极限必需培养基(DMEM)、Eagle’s极限必需培养基(EMEM)、Ham’sF-12培养基、HBSS、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素/两性霉素B、微量元素以及视黄酸(Biofluids，Rockville，MD)；氢化可的松、上皮细胞生长因子以及内皮细胞生长补料(Collaborative Research，Bedford，MA)；胎牛血清(Gemini Bio Products，Inc.，Calabasa，CA)；运铁蛋白和胰岛素(GIBCO BRL，Grand Island，NY)；3-(2-羟基-2-亚硝基-1-丙基肼基)-1-丙酰胺(NONOate)购自Cayman化学公司(ann arbor，MI)；RNAzolTMB(Tel-Test，Inc.，Friendswood，TX)；琼脂糖(FMCBioproducts，Rockland，ME)，Mops(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，以及α32P-dCTP(Amersham，Arlington Heights，IL)。其他所有化学物品均购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。布地奈德由Per Andersson和Ralph Brattsand博士慷慨惠赠(AstraPharmaceutical Production，Lund，Sweden)。
下面的缓冲液原液是这样配制的10×Mops(0.2M Mops，0.05M醋酸钠，0.01M EDTA)；50×Denhardt’s(1％菲科尔，1％聚乙烯吡咯烷酮，1％牛血清白蛋白)；以及20×SSPE(175.3g NaCl，27.6g NaH2PO4·H2O，7.4g EDTA溶解在1升水中，pH7.4)。
病毒和细胞系人鼻病毒14型(HRV-14)、16型(HRV-16)、39型(HRV-39)以及1A型(HRV-1A)，WI-38细胞和HeLa细胞均购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。按照以前文献中描述的方法(49)，用HeLa细胞和WI-38细胞传代生产HRV-14和HRV-16另外的病毒原液。由于这两株病毒在上述细胞系中感染及复制方面表现出明显的偏嗜性，所以无法用同一细胞系生产这两株病毒的等效原液。宿主细胞对不同鼻病毒株的敏感度不同，这一点在此前的文献中已有描述(11)。在一些实验中，根据公开的方法(16)，用蔗糖离心法除去源于WI-38的核糖体及可溶性因子。按照此前描述的方法(49)，用紫外线照射30分钟灭活HRV-16。对于使用HRV-39和1A的实验而言，直接使用从厂商获得的病毒原液。提供的HRV-39原液是用WI-38细胞生产的，而HRV-1A原液是用HeLa细胞生产获得的。BEAS-2B细胞系(43)由Curtis Harris博士慷慨惠赠(国立癌症研究院，Bethesda，MD)。
上皮细胞培养物按照此前描述的方法，蛋白酶消化人体组织获得人气管上皮原代细胞(10)。用于培养上述两种原代细胞和BEAS-2B细胞的培养基是由含有下列物质的Ham’s F-12营养液组成青霉素(100U/ml)、链霉素(100U/ml)、两性霉素B(250ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、磷酸乙醇胺(phosphoethnolamine)/乙醇胺(0.5mM)、运铁蛋白(10μg/ml)、内皮细胞生长补料(3.75μg/ml)、内皮细胞生长因子(12.5ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、氢化可的松(10-7M)、霍乱菌毒素(10ng/ml)、3，3’，5-triodothyronine(3×10-9M)、视黄酸(0.1ng/ml)以及微量元素。以下称该培养基为F12/10X。这些细胞在含95％空气和5％CO2的环境中37℃培养。在这些实验中，细胞传代至第35～50代时，将细胞按2.5×104个细胞/cm2的浓度置于6孔平板或75cm2的培养瓶(costar，cambridge，MA)中进行培养。
用病毒感染BEAS-2B细胞用HBSS洗涤BEAS-2B细胞单层3次。按照104TCID50单位/ml HBSS的浓度把这些鼻病毒(株14、16、39或1A)加到细胞上。尽管由于鼻病毒对不同宿主细胞感染能力的差异很大(见上述内容)，这能否代表BEAS-2B细胞的感染复数(MOI-每个细胞上的感染单位)还不清楚，但可以认为这就相当于0.01TCID50单位/BEAS-2B细胞的感染剂量。34℃下用病毒温育上述细胞1h，用F12/10×洗涤3次，然后向细胞中加入新鲜的F12/10×培养基。在感染后的各个时间点从细胞培养物中收取上清，-80℃保存，以备以后分析细胞因子蛋白产量和病毒含量之用。在一些实验中，在感染后的各个时间点从细胞培养物中提取总RNA，-80℃保存以备以后分析之用。
IL-8和IL-6的定量用特定的ELISAs实验测定细胞上清液中的细胞因子水平。使用此前描述的敏感度达15pg/ml细胞因子的ELISA实验(49)对IL-8进行测量，而IL-6水平测定采用的是商品化试剂盒，该试剂盒的敏感度为15pg IL-6/ml(Biosource International，Camarillo，CA)。在我们实验中，无论是培养基还是药物使用的载体都没有对上述两种分析带来任何非特异性干扰。
统计学分析数据表示为平均值±标准误。RNA表达、蛋白分泌以及病毒滴度的动力学比较都采用一维方差分析。用Student’s t-检验对成对样品进行分析，比较放线菌酮和糖皮质激素对RNA表达和蛋白分泌的影响。除比较活性和非活性NONOate的实验外是采用一维方差分析外，NONOate对细胞因子产量、病毒滴度以及RNA表达对影响的比较采用带有1个重复度量的二维方差分析。当得到显著的方差比时，用最小方差多函数范围检验(Least Significant Difference Mulitiple-rangeTest)(47)进行平均值的成对比较。当p＜0.05时，认为这些值之间差异显著。
实施例2细胞因子mRNA表达和蛋白分泌的动力学图2显示，HRV-14感染后1小时内IL-8和IL-6的mRNA水平显著升高。在感染后24小时，最大表达已达3小时但mRNA水平仍比未感染对照高。随着mRNA被诱导，上清液中IL-8和IL-6蛋白显著升高。感染后3小时细胞因子产量增加，24小时浓度达到最大。值得注意的是，HRV-16感染后产生IL-8和IL-6的时程比HRV-14感染后更快(图3)。感染后1小时内mRNA表达水平最高，7小时内蛋白产量最大。与上述显示的数据一致(图1)，HRV-16感染后生成的细胞因子的量比HRV-14感染后约大4倍(图3与图2相比)。由于HRV-16诱发生成细胞因子的速度更快且产量更高，这株病毒可以用于以后的体内实验，所以在随后研究病毒-诱发细胞因子生成的机制的实验中使用的是HRV-16。为了确证HRV-16效果的特异性，进行了3个配套实验，通过活性的及UV-灭活的病毒制剂比较IL-8的生成情况。活性病毒诱发生成3307±1156pg/ml的IL-8，而经UV灭活后的病毒诱发生成的仅为520±90pg/ml(对照，未感染细胞生成345±110pg/ml)。在配套实验中，当用我们的标准病毒制剂或等感染剂量的蔗糖密度离心纯化的HRV-16同一批原液感染细胞时，生成的IL-8量类似(2080±340pg/ml和1750±500pg/ml，分别为，n＝3)，这一发现使上述特异性得到进一步确证。对于标准和纯化HRV-16来说，IL-8和IL-6的病毒诱生时程也是相等的(未显示)。
实施例3HRV-16感染后的病毒滴度在感染后的不同的时间点收集上清液，用WI-38细胞进行细胞毒性实验测定HRV-16的病毒滴度。感染后约7小时培养基中开始能检测到病毒，感染后的7～24小时期间呈逐渐增加(表1)。在感染后的第2个24小时的时间段收集上清液，其中病毒水平近似于24小时后观察到的病毒水平(见下表2)。实际上，这种病毒滴度模式与以前在HRV-14上观察到的一致(49)。
表1人鼻病毒-16感染后的不同时间从BEAS-2B细胞培养物中取得的上清液中的病毒含量感染后的时间 病毒滴度(小时) (LogTCID50单位)*0ND1ND3ND71.25±0.2516 2.25±0.2524 2.4±0.13*数据表示方式为来自4个实验的平均值±标准误表2在NONOate作用下病毒滴度随时间减少病毒滴度(LogTCID50单位)*处理 0-24h24-48hHRV-162.8±0.1 2.9±0.1HRV-16+300μM NONOate 2.5±0.3 2.8±0.1HRV-16+1000μM NONOAte0.5±0.5t2.4±0.2*数据表示方式为来自3个实验的平均值±标准误p＜0.05vs.HRV-16单独实施例4放线菌酮对IL-8和IL-6 mRNA表达的影响HRV-16感染细胞经放线菌酮(10μg/ml)处理后IL-8及IL-6的mRNA水平与对照用感染细胞不同(图4)。在病毒感染后1小时的时刻进行的比较，这一时刻正是上述的动力学研究中mRNA表达达到峰值的时刻。
放线菌酮对HRV-16诱导IL-8和IL-6 mRNA表达的影响在病毒感染前，用放线菌酮(10μg/ml)或培养基对照物处理BEAS-2B细胞1小时。在HRV-16感染的过程中以及感染后，该药物还存在。感染后1小时时，收获RNA用于Northern分析。之所以选用这样浓度的放线菌酮是因为，此前研究表明这种浓度能够抑制该细胞系中被TNFα和IFNβ-诱发的RANTES mRNA表达(48)。
实施例5糖皮质激素预处理对细胞因子生成和病毒滴度的影响在感染病毒前，用10-7M的布地奈德或载体对照物处理细胞24小时。在上述动力学实验中测定的最大反映时间段，对RNA表达和蛋白生成情况进行比较；对于mRNA需要1小时，而细胞因子蛋白的生成则需7小时。HRV-16感染后的BEAS-2B细胞中IL-8和IL-6mRNA的表达并未因布地奈德的处理而发生显著变化(图5)。然而，在每个实验中，布地奈德-处理过的BEAS-2B细胞中的IL-8和IL-6蛋白的生成都比对照感染细胞低(对标准化数据成对比较的P＜0.05)。病毒滴度(2.2±0.6logTCID50单位)没有因布地奈德的处理而发生变化。
布地奈德对细胞因子生成和病毒滴度的影响将布地奈德溶于DMSO制备成10-2M的原液。由于BEAS-2B细胞通常维持在含低水平氢化可的松的生长液，所以在用糖皮质激素处理前将用于实验的细胞在不含氢化可的松的培养液中放置24小时。然后在感染病毒前，用10-7M的布地奈德或适当稀释用的载体对照物处理细胞24小时。感染病毒后，所用的培养液中也含有布地奈德。因为此前研究表明布地奈德能极大地抑制BEAS-2B细胞中TNFα-诱发的RANTES生成(48)，所以布地奈德的使用浓度是选择确定的。在病毒感染后的不同时刻收取含有以及不含布地奈德的细胞培养物的上清，-70℃储存，用于测定IL-8和IL-6蛋白和病毒含量。在一些实验中，用Northern分析对感染后1小时从布地奈德-处理的细胞中提取的RNA与对照感染细胞的提取物进行比较。
实施例6一氧化氮供体对细胞因生成和病毒滴度的影响HRV-16感染后的第4小时和第24小时，从用含NONOate或不含NONOate的培养液温育的BEAS-2B细胞培养物收取上清，并对其中病毒滴度和细胞因子水平进行了分析。NONOate以剂量依赖性模式显著抑制IL-8和IL-6的生成(图6)。IL-6生成被剂量低至100μM的NONOate显著抑制。生成的细胞因子水平的抑制在第4小时比第24小时更显著，这可能是由于第24小时NO水平衰减所致。病毒滴度也被NONOate显著抑制(图7)。在1000μM的NONOate的作用下，第24小时收集的上清中的病毒含量几乎完全小时。然而，不论细胞培养物是否经过NONOate处理，第2个24小时收集的上清中含有近似量的病毒(表2)。在平行实验中，测试了NONOate对细胞活力和细胞数目的影响。无论任何剂量或作用时间，NONOate对细胞活力都无显著影响。只是在用1000μM NONOate作用24小时的时候，细胞数目有一个小的但明显的减少(未用NONOate处理的情况为1.7±0.4×106细胞/孔，而相对用NONOate处理的情况为1.2±0.4×106细胞/孔，n＝3，P＜0.05)。在较低剂量的NONOate的情况下，未观察到这种效果。这种效果在使用纯化的HRV-16时也得到了确证(未显示)。
NONOate的抑制作用并不限于HRV-16感染。另一主要毒株HRV-14或次要毒株HRV-1A感染的BEAS-2B细胞中，细胞因子的生成也被NONOate显著地抑制。在500μM NONOate存在下，BEAS-2B中病毒诱发-IL-8的生成在第4小时被抑制了约60％(HRV-14为350±51～117×±59pg/ml，HRV-1A为1857±58～670×±64pg/ml，n＝3，P＜0.01)。此外，NONOate还抑制了HRV-14感染后24小时从BEAS-2B细胞培养物中收集的上清中的病毒滴度(数据未显示)。NONOate抑制鼻病毒-诱发细胞因子生成的能力在人原代细胞中也被观察到。在一个实验中，感染后4小时测量发现，1000μM NONOate使IL-8的病毒-诱发水平从1400pg/ml降低至366pg/ml；但是，在第2个实验中，在用500μM NONOate和1000μM NONOate处理细胞，IL-8水平由病毒-感染细胞中的3420pg/ml分别降低至1980pg/ml和1030pg/ml。
为了进一步测定NONOate的作用，另外的实验只在病毒感染的过程中或感染后加入NONOate。图8显示，只在病毒接种过程中或只在病毒感染后存在的NONOate抑制了IL-8和IL-6生成量的50％～60％。观察发现，如果在病毒接种的过程中或接种后都存在NONOAate，蛋白生成被完全抑制。
为了测定上述完全抑制是否由一氧化氮特异性引起的，使用活性NONOate和已经完全释放了其中所有可能的NO的NONOate进行实验。图8显示，失活后的化合物不能抑制IL-8的生成。
NONOate对细胞因子生成和病毒复制的影响用碱性溶液(0.01MNaOH)将NONOate制备成100mM的原液，4℃保存备用。每个实验都制备新的NONOate原液，并在制备后的1小时内使用。pH7.4和22℃条件下，测定的NO从NONOate中释放的半衰期为76分钟(Cayman ChemicalCo.，Ann Arbor，MI)。碱性条件下，所述NONOate不释放一氧化氮。将上述碱性原液的等份直接加入到BEAS-2B细胞培养基(pH7.4)中，使终浓度为100μM～1000μM。就多数实验来说，NONOate在病毒接种的过程中和接种后都存在。在一些实验中，只在接种病毒的过程中或接种后加入NONOate。在病毒感染后的不同时间，从用NONOate或未用NONOate温育过的BEAS-2B细胞培养物中收集上清，-70℃储备，用于以后的IL-8和IL-6蛋白以及病毒含量的测定。在一些情况下，在感染后的不同时间从NONOate处理过的细胞培养物和对照用的感染细胞中提取RNA，并用Northern分析对其进行比较。为了对照NONOate化合物的非特异性作用，实验中使用了用失活的NONOate溶液处理过的处理过的细胞。失活是这样完成的将1000μM的NONOate溶液置于pH7.4的培养基中室温放置24小时，使其在加入到细胞培养物前释放出所有可能的NO。
NONOate抑制IL-6和IL-8的动力学及机理为了测定NONOate的抑制时程，含有或不含500μM NONOate的条件下，在HRV-16感染后的不同时间，对BEAS-2B进行研究。多数情况下，NONOate的抑制效果在最早的几个时间点就可以断定，在第1小时蛋白水平降低60％～70％，第3小时降低50％，以及第7小时降低30％～40％(图9)。这些结果很可能反映出了培养基中一氧化氮的浓度随NONOate降解而减少。值得注意的是，NONOate并没有改变细胞因子mRNA表达的水平。如图9所示，用HRV-16感染的BEAS-2B细胞中的mRNA水平，在NONOate存在或不存在两种情况下差异不显著。在第3和第7小时，NONOate处理的细胞中IL-8mRNA出现升高的趋势。在此外的对照实验中，NONOate单独对IL-8或IL-6的mRNA表达无任何影响，失活的NONOate也不会改变BEAS-2B细胞中IL-8或IL-6 mRNA的病毒诱发表达(数据未数据)。用于Northern印迹实验的探针用从人BEAS-2B细胞系中提取的RNA通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得IL-8的全长cDNA。将上述全长cDNA克隆到pCRII载体(Invitrogen corp.，圣地亚哥，CA)中的2个EcoR I位点之间，将重组载体转化入感受态的大肠杆菌XL1-Blue细胞中(stratagene，LaJolla，CA)。用双脱氧法测序，测得的用于Northern分析的cDNA探针的序列与公开的IL-8序列(31、34)一致。IL-6的全长cDNA由Steven Gillis博士友情提供(Immunex，西雅图，WA)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自Clontech(Palo Alto，CA)。用32PdCTP和随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)通过随机引物方法(15)将用于IL-8、IL-6和GAP的探针标记使其具有高度特异活性。用Nuctrap Push Columns(Stratagene)分离除去未掺入的核苷酸。
RNA提取和Northern分析对Chomczynski和Sacchi的方法(9)改良，用RNAzol B(1ml/10cm2)从BEAS-2B细胞中提取总细胞RNA。简而言之，用RNAzol B溶解细胞单层，将溶解物转移到聚丙烯管中，向管中加入氯仿(0.1ml/ml RNAzol B)。置于冰上冷却5分钟，然后将试样4℃下7900×g离心30分钟。将上述液相用等体积的冰-预冷95％乙醇在-20℃下沉淀过夜。重复离心后，用75％乙醇洗涤RNA沉淀2次，干燥，然后将其溶解于50μl 0.2％焦碳酸二乙酯-处理过的水中。将等份试样(0.5μg)加入1％琼脂糖凝胶电泳测试每种RNA的完整度，溴化乙锭的浓度为0.5μg/ml缓冲液。RNA-80℃保存。
就Northern分析而言，将来自每种实验条件的等量RNA(15～20μg)在1％琼脂糖/2.2M甲醛凝胶上使用Mops缓冲系统电泳。将RNA转印到尼龙膜(GeneScreen Plus，New Eangland Nuclear Research Products，Wilmington，DE)上。通过暴露于紫外光使上述膜发生交连，然后用含有下列物质的10mls缓冲液在杂交烘箱中42℃下进行2小时预杂交4.5ml甲酰胺、2.5ml 10×Denhardt’s，2ml 20×SSPE，1ml 20％SDS，and 100μg变性的鲑精DNA/ml。在预杂交后，紧接着将合适的α32P-标记的cDNA探针加入到预杂交液中，振荡上述混合物在42℃下继续反应18小时。洗涤转印条带至最终的严紧度为60℃、0.2×SSC/0.2％SDS，然后在-70℃使用Lighting Plus Screens暴光于感光胶片(Biomax MS，Kodak，New Haven，CT)。不同的时间长度常规处理胶片，以确保光密度测定法测试的条带强度落入感光胶片的线性范围内。光密度测定使用的是扫描光密度计(UVP Gel Documentation System，San Gabriel，CA)，光密度分析采用的是NIH成像软件。
实施例7本实施例显示了NONOate对鼻病毒感染中嗜曙红-活性细胞因子的影响。
由于下导气管中嗜曙红细胞的增加在哮喘中起着重要的作用，所以我们测试了NONOate对细胞因子的病毒诱发生成的作用，这些细胞因子能够影响嗜曙红细胞功能。这些细胞因子功能包括粒细胞巨嗜细胞-集落刺激因子(GM-CSF)以及RANTES，GM-CSF能够增进存活并能增强嗜曙红细胞活性，RANTES是下列细胞的强效趋化因子嗜曙红细胞、记忆性T淋巴细胞、单核细胞以及嗜碱性细胞。图10给出的是，NONOate存在或缺乏的情况下，鼻病毒(HRV-16)感染后的24小时中，上皮细胞生成的GM-CSF和RANTES蛋白水平。NONOate的加入显著地抑制了上述两种细胞因子的病毒诱发生成，这说明在病毒诱发的哮喘的发病过程中，一氧化氮在调节活化嗜曙红细胞的细胞因子的生成方面发挥着重要的作用。
我们认为一氧化氮是宿主抵抗鼻病毒的抗病毒反应中的重要部分。在近来的研究中，我们已经测定了上皮细胞的鼻病毒感染是否会改变诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的基因表达，该酶能够生产一氧化氮。在24小时和48小时，从未感染及感染了HRV-16的人原代细胞中分离RNA，然后我们使用RT-PCR，测定了其中的iNOS的基因表达。如图11所示，在病毒感染后24小时和48小时病毒感染都诱导了iNOS的mRNA的表达。这些数据证明，iNOS基因表达的诱导是宿主抗病毒感染反应的一部分。
我们以前的研究表明，HRV-14能诱导BEAS-2B细胞生成IL-8和IL-6(49)，现在研究表明其他主要组毒株(HRV-16和HRV-39)以及次要组中的1A都具有该性能，这说明促炎细胞因子的诱导可能发生在多数但并非全部的鼻病毒。我们已经发现HRV-14诱发的细胞因子生成会被抗ICAM-1抗体以及病毒的UV灭活阻断(49)。我们目前的研究表明HRV-16的作用不仅能够被UV灭活废止，而且HRV-16的纯化制剂也诱导了细胞因子的生成。总之，这些数据说明细胞因子的诱导是由病毒特异性引起的，而并非源于病毒原液的某些污染物。而且，该反应的共同本质说明，上皮细胞的细胞因子生成的诱导可能在人上呼吸道病毒感染的发病机制中发挥重要作用，下述事实进一步支持了该观点在导致明显的细胞毒性之前，流感病毒和呼吸道合胞体病毒(RSV)等其他病毒也能诱导上皮细胞的细胞因子的生成(2、8、33、38)。
因为病毒株的滴度是在几种不同的细胞系中测定的，不必精确对比，所以每种病毒诱发的细胞因子的生成水平之间差异明显，这一点就不能理解了。然而显然，细胞因子mRNA表达和蛋白分泌的动力学因鼻病毒毒株的不同而变化。HRV-14感染导致IL-8和IL-6的时间-依赖性积聚，感染后3小时观察到的水平最高，并且在感染后24小时仍然保持在升高的状态。与我们以前的研究一致，每种细胞因子的蛋白生成会增加直至感染后24小时，但是在第2个24小时中，细胞因子的生成情况与对照物未感染细胞没有区别(未显示)。这种蛋白产生时程与使用这种病毒株感染A549 II型上皮细胞时的观察结果一致(55)，尽管所述的mRNA积聚的时程稍有不同，这很可能反映了这两种细胞群体之间的差异。值得注意的是，与HRV-14感染的细胞相比HRV-16感染的细胞中mRNA表达和细胞因子生成的时程更快，反应程度更强。不仅在实现最大mRNA表达和蛋白水平方面更迅速，而且在实际上也更短促，7小时内就基本上全部完成。就HRV-16而言，用HRV-16感染后的第2个24小时期间，细胞因子的生成情况与对照物未感染细胞没有区别(未显示)。HRV-14和HRV-16诱发生成IL-8和IL-6的初速度不同的原因还不清楚，但是可能与这2个病毒株在BEAS-2B细胞中的识别、吸收或脱壳的不同有关。尽管细胞因子生成的速度不同，但是在这2个病毒株之间，病毒复制速度没有观察到任何差异。所有情况下，都是BEAS-2B细胞培养物上清中感染后7小时可检测到病毒，24小时病毒达到最高水平。第2个24小时期间收集物产生的病毒滴度与第1个24小时收集样品近似。这说明病毒增殖以及释放入培养基的速度在这个期间内是相同的。这两个病毒株在连续病毒复制情况下引发的IL-8和和IL-6的瞬时诱导，这说明是病毒感染中的一个早期事件，而非病毒复制本身刺激促炎细胞因子的生成。这种细胞因子的快速生成会引发这样的思索，感冒发病机制中的这种相关早期事件可能在启动炎性细胞的快速渗透方面发挥着重要作用。
为了进一步阐明病毒-诱发细胞因子生成的生化机理，我们测试了选定药物在细胞因子mRNA和蛋白的病毒-诱发表达方面的作用。放线菌酮，这种蛋白合成抑制剂不改变IL-8或IL-6的mRNA水平，这表明蛋白的从头合成不需鼻病毒-诱发的mRNA表达。这一点与近来在A549细胞上的观察结果一致，表明HRV-14引起的IL-6诱导是通过一种核因子κB-依赖途径发生的，该途径不受放线菌酮的影响(55)。
已经有研究表明，糖皮质激素能抑制过敏性炎症患者体内几种细胞因子的生成(46、52)，而且能抑制细胞培养系统中的生成(45、48)。我们首次评估了强效糖皮质激素对鼻病毒-感染上皮细胞中的病毒复制以及对诱发的IL-8和IL-6 mRNA表达及蛋白生成的影响。布地奈德对任何细胞因子的mRNA表达都无影响，但是对分泌蛋白的水平有适度影响。这种mRNA水平不变情况下的蛋白分泌减少可能反映的是，糖皮质激素能够改变参与细胞因子蛋白生成或分泌的翻译后事件。此前已经报道糖皮质激素最多能适度抑制BEAS-2B细胞中的IL-8 mRNA及蛋白的生成(30)。然而，布地奈德对病毒滴度无影响，以及对IL-8和IL-6的分泌适度抑制，这些都与实验性鼻病毒感染的体内实验结果抑制，该体内实验中糖皮质激素对病毒释放以及症状都几乎或根本无任何影响(14、17)。
现在清楚NO具有很宽的作用范围，可以作为血管扩张因子、神经递质、抗生及免疫调节剂(39)。近年来，研究还表明NO在鼠细胞系中以及小鼠模型体内具有病毒性能。下列几种病毒都因NO合成酶的诱导而受到抑制痘苗病毒(20)、1型单纯疱疹病毒(12、24)、水疱性口炎病毒(7)、柯萨奇病毒(32)以及脊髓灰质炎病毒(26)，NO合成酶能够生产NO，或者通过加入NO供体S-亚硝基-1-乙酰基青霉胺。在增加患有上呼吸道病毒感染患者吸入空气中的NO水平(25)，我们测试NO是否能抑制鼻病毒复制，延伸这些实验评估NO对IL-6和IL-8的鼻病毒-诱发生成的影响。尽管正常的人呼吸道上皮细胞表达了NO合成酶的组成型及诱导型两种形式(4)，但是这些酶在BEAS-2B细胞中的表达显著减少(数据未显示)。因此，为了确保NO以控制的水平释放，我们使用的NONOate是一种以特定半衰期释放NO的供体。首次，我们的研究资料显示NO能够抑制人呼吸道上皮细胞中的鼻病毒复制以及IL-8和IL-6的鼻病毒-诱发生成。这类效应是剂量-依赖性，并且对上皮细胞活力不产生任何影响。与感染后24小时相比，感染后4小时细胞因子生成的抑制现象更容易断定，而且在第2个24小时期间的收集物中病毒释放出上皮细胞的速度也恢复到正常水平。这些数据与下述事实一致NONOate只是在大量释放NO时才能引起抑制，并且表明随着该化合物降解病毒复制及细胞因子生成又恢复如初。失活后的NONOate对病毒滴度或细胞因子生成毫无影响，我们的这一研究结果为NO释放的关键作用提供了进一步的证据。
甚至当只在病毒感染期之后出现的时候，NONOate能够部分抑制细胞因子的生成，这说明NONOate不是通过直接杀死病毒或者通过抑制病毒进入BEAS-2B细胞发挥上述抑制作用的。这一点还得到了下述现象的支持，即在NONOate降解后病毒滴度能够恢复如初。相反，有可能的是，NO抑制的是病毒感染过程中的1个或多个事件。在任意一个测试时间点，NONOate都不能抑制细胞因子mRNA的表达，这表明NO可能是通过翻译后机制发挥作用的，但是这还需要进一步研究确证。然而，其他类型细胞中NO能抑制蛋白合成，已有先例(13、23)。
总之，我们发现多种鼻病毒株能诱导人呼吸道上皮细胞生成促炎因子，但是在细胞因子生成的水平和动力学方面，不同病毒株之间却各不相同。尽管糖皮质激素能适度抑制鼻病毒-感染诱发的细胞因子分泌，但是不能改变细胞因子mRNA表达或病毒复制。相反，NO能显著抑制鼻病毒复制以及病毒诱发的细胞因子表达，而对这些细胞因子的mRNA水平却无影响。尽管NO抑制病毒复制和细胞因子生成的机制还有待进一步研究来阐明，但是我们的研究结果表明局部使用NO供体可以为鼻病毒诱发的感冒及其并发症的医治提供一种崭新的治疗方法。
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权利要求
1.一种用于减缓鼻病毒感染引发症状的方法，该方法包括向感染了鼻病毒的患者施用有效量的化合物，其中所述的化合物能释放出一氧化氮(NO)。
2.权利要求1的方法，其中所述的鼻病毒能够导致一般感冒。
3.权利要求1的方法，其中所述的鼻病毒能够导致哮喘。
4.权利要求1的方法，其中所述的鼻病毒能够导致窦炎。
5.权利要求1的方法，其中所述的鼻病毒能够导致中耳炎。
6.权利要求1的方法，其中所述的鼻病毒能够导致支气管炎。
7.权利要求1的方法，其中所述的化合物能够以可控制的方式释放NO。
8.权利要求1的方法，其中所述的化合物在病理生理pH值下释放NO。
9.权利要求1的方法，其中所述的化合物包括一个N2O2-部分。
10.权利要求1的方法，其中所述的化合物是3-(2-羟基-2-亚硝基-1-丙基肼基)-1-丙胺。
11.权利要求1的方法，其中所述的化合物以滴鼻的方式给药。
12.权利要求1的方法，其中所述的化合物以局部方式给药。
13.权利要求1的方法，其中所述的化合物以吸入方式给药。
14.权利要求1的方法，其中所述的化合物以喷雾方式给药。
15.一种用于减少鼻病毒复制的方法让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触，该化合物能够释放出有效量的NO，从而抑制鼻病毒的复制。
16.一种用于减少鼻病毒诱发生成的细胞因子的方法，该方法包括让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触，该化合物能够释放出有效量的NO，从而抑制细胞因子的生成。
17.权利要求16的方法，其中所述的细胞因子是一种促炎症因子。
18.权利要求16的方法，其中所述的细胞因子是白介素-8。
19.权利要求16的方法，其中所述的细胞因子是白介素-6。
20.权利要求15的方法，其中所述的化合物包括一个N2O2-部分。
21.权利要求15的方法，其中所述的化合物是3-(2-羟基-2-亚硝基-1-丙基肼基)-1-丙胺。
22.权利要求16的方法，其中所述的化合物包括一个N2O2-部分。
23.权利要求16的方法，其中所述的化合物是3-(2-羟基-2-亚硝基-1-丙基肼基)-1-丙胺。
24.权利要求1的方法，其中所述的化合物是S-亚硝基-1-乙酰青霉胺。
25.权利要求15的方法，其中所述的化合物是S-亚硝基-1-乙酰青霉胺。
26.权利要求16的方法，其中所述的化合物是S-亚硝基-1-乙酰青霉胺。
27.一种用于减缓鼻病毒感染引发症状的方法，该方法包括向感染了鼻病毒的患者施用有效量的化合物，其中所述的化合物能诱导人呼吸道上皮细胞中的一氧化氮合成酶(NOS)。
28.一种用于减少鼻病毒复制的方法，该方法包括让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触，该化合物能够诱导人呼吸道上皮细胞合成有效量的NOS，从而抑制鼻病毒的复制。
29.一种用于减少鼻病毒诱发细胞因子生成的方法，该方法包括让感染有鼻病毒的人呼吸道上皮细胞与一种化合物接触，该化合物能够诱导人呼吸道上皮细胞合成有效量的NOS，从而抑制鼻病毒诱发细胞因子的生成。
30.权利要求27的方法，其中所述的化合物是干扰素γ。
31.权利要求28的方法，其中所述的化合物是干扰素γ。
32.权利要求29的方法，其中所述的化合物是干扰素γ。
33.权利要求27中的方法，其中所述的化合物是脂多糖(LPS)。
34.权利要求28中的方法，其中所述的化合物是脂多糖(LPS)。
35.权利要求29中的方法，其中所述的化合物是脂多糖(LPS)。
36.一种用于用于测试化合物以便鉴定出能用于治疗或预防一般感冒或与鼻病毒感染有关的其他疾病的侯选药物的方法，该方法包括下述步骤用人鼻病毒感染人呼吸道上皮细胞；让这些细胞与一种待测化合物接触；以及对至少一种促炎或嗜曙红-活性细胞因子的量进行测定，其中一种待测化合物能够减少上述细胞因子的生成量，它就是可以用于预防或治疗人鼻病毒感染的侯选药物。
37.权利要求36的方法，其中所述的细胞因子是促炎症细胞因子。
38.权利要求36的方法，其中所述的细胞因子是嗜曙红-活性细胞因子。
39.权利要求36的方法，其中所述的接触步骤是在感染步骤之前实施的。
40.一种用于用于测试化合物以便鉴定出能用于治疗或预防一般感冒或与鼻病毒感染有关的其他疾病的侯选药物的方法，该方法包括下述步骤用人鼻病毒感染人呼吸道上皮细胞；让这些细胞与一种待测化合物接触；以及对上述呼吸道上皮细胞中复制的鼻病毒基因组的量进行测定，其中一种待测化合物能够减少上述细胞因子的生成量，它就是可以用于预防或治疗人鼻病毒感染的侯选药物。
41.权利要求40的方法，其中所述的接触步骤是在感染步骤之前实施的。
42.一种用于治疗鼻病毒感染的药物组合物，该组合物包括一种液体制剂，该液体制剂中含有一种能释放出NO的化合物，其中所述液体制剂是滴鼻剂。
43.一种用于将药物组合物施用到人鼻的鼻喷雾或点滴瓶，该瓶中包括一种液体制剂，该液体制剂中含有一种能释放出NO的化合物。
44.一种用于将一种抗鼻病毒组合物释放到人呼吸道的吸入器或喷雾器，该装置包括一种液体制剂，该液体制剂中含有一种能够释放出NO的化合物。
全文摘要
产生一氧化氮的化合物或能在原位诱导合成一氧化氮的化合物,它们可以用来抑制鼻病毒感染。一氧化氮能够抑制病毒复制以及细胞因子的合成,特别是促炎症细胞因子的合成。因此,通过增加呼吸道中一氧化氮的治疗手段,可以减缓鼻病毒感染的症状。
文档编号A61K31/15GK1277552SQ98810536
公开日2000年12月20日 申请日期1998年7月10日 优先权日1997年7月11日
发明者S·P·桑德斯, D·普洛德 申请人:约翰斯·霍普金斯大学医学院