专利名称：人多潜能白血病细胞分化相关基因的制作方法
技术领域：
本发明为两种人多潜能白血病细胞分化相关基因ASH2L及PHF2与白血病细胞增殖与分化状态的关系，涉及生物医学高技术中基因的开发与应用领域。
PHD(plant homeodomain)锌指结构(C4HC3)蛋白广泛存在于不同生物体内。作为转录因子其主要功能是在染色质水平调节同源异形盒(HOX)基因的转录。编码含PHD结构蛋白的基因在进化过程中十分保守。这一锌指结构的基本特征是在50-80个氨基酸残基范围内有一个C4HC3基序(motif)。通过对人体白血病细胞染色体易位的研究发现，具有PHD结构特征的蛋白质与造血系统恶性疾病有关。如定位于人类染色体11q23区域的MLL(mixed-lineageleukemia，又名HRX、ALL1、HTRX1)基因编码的蛋白质就包括有连续4个串联的PHD结构。位于8p11区域的MOZ(monocytic leukemia zinc finger protein)基因编码的蛋白质也包含有2个PHD锌指结构。甚至有作者将PHD锌指结构称为白血病相关蛋白(leukemia-associated-protein，LAP)结构域。克隆编码PHD锌指结构的基因并研究其功能和应用具有重要的理论价值和实际意义。
我们实验室应用基因组信息学原理、分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术等技术，克隆到人类编码PHD锌指蛋白新基因PHF2和ASH2L的cDNA及编码蛋白质的序列，本发明目的是研究人类编码PHD锌指蛋白基因PHF2和ASH2L与白血病细胞增殖与分化状态的关系。
我们实验室应用基因组信息学原理、分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术等技术，克隆到人类编码PHD锌指蛋白新基因PHF2和ASH2L，本发明应用Northern印迹杂交及细胞诱导分化技术等，对人类编码PHD锌指蛋白基因PHF2和ASH2L它们与白血病细胞增殖与分化状态的关系进行了鉴定。
对PHF2和ASH2L基因鉴定达到的技术指标为1、两种新的编码PHD及PHD相关的锌指蛋白基因及其相应可变剪接异构体1)PHF2cDNA全长2104bp，相应蛋白质有567aa，在靠近N端的150aa范围内编码两个连续排列的PHD锌指结构。PHF2蛋白与果蝇的PCL蛋白具有43％的同源性；2)ASH2L1及其可变剪接异构体ASH2L2cDNA及相应蛋白的长度分别为ASH2L12381bp，628aa；ASH2L22450bp，534aa。它们与果蝇的ASH2基因同源性约为60％。但在ASH2蛋白PHD锌指结构相应区域，ASH2L1、ASH2L2蛋白则为(C2C2)锌指结构(图1，2，3)。
2、这两个基因在有巨核及红系特点的Hel、Dami及K562白血病细胞系中表达量明显增高(图4)。
3、在白血病细胞向巨核细胞分化过程中ASH2L表达水平明显下降，诱导后0.5、1、2及4小时分别下降32％、56％、77％及90％；而PHF2则表现为一定水平的上调，诱导后2、4及8小时分别上升1.3、4.4及7倍(图5)。
4、研究结果表明人类基因ASH2L及PHF2在维持多潜能白血病细胞系Hel、Dami及K562细胞的增殖状态及诱导分化过程中起着重要的调控作用。
本项发明的优点是对筛选出的人多潜能白血病细胞分化相关基因PHF2和ASH2L与白血病细胞增殖与分化状态的关系进行了鉴定，这对阐明该类肿瘤发生与分化的生物学机制具有一定的意义，也为该类肿瘤的临床诊断和治疗提供了目标基因和辅助诊断指标。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1 PHF2 cDNA及相应蛋白质序列图。下画线部分为PHD锌指结构域。
图2 ASH2L1 cDNA及相应蛋白质序列图。下画线部分为C2C2锌指结构域。
图3 ASH2L2 cDNA及相应蛋白质序列图。下画线部分为C2C2锌指结构域。
图4 人PHF2、ASH2L在不同人白血病细胞系中的表达差异。
图5 PMA诱导K562细胞系向巨核系分化时人ASH2L、PHF2基因表达水平的变化。
实施例1人多潜能白血病细胞分化相关基因 PHF2的筛选1、PCR引物设计P3A，P3B通过M96(小鼠的一种具有PHD结构的金属反应元件DNA结合蛋白)基因在GenBank人类EST(Expressed Sequence Tag)数据库中进行查询比较，选择两个同源性较高的EST(GenBank AccR13825，N48557)进行设计。2、PCR制备cDNA探针采用P3A、P3B引物对人多种组织(如心脏、睾丸、骨髓、十二指肠、胎盘、成人脑及胎脑)来源的cDNA文库进行PCR扩增PCR反应体积为25μl，含10mM Tris-HCl(pH 9.0)，0.1％Triton X-100，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1μlλ噬菌体，引物浓度为1μM，1u Taq DNA聚合酶。循环条件是在MJ Research.Inc PTC-100TM热循环仪上进行反应，94℃变性3分钟后，94℃30秒、57℃30秒、72℃ 45秒，30个循环，72℃延伸10分钟。PCR扩增得到长度为733bp的P3AB片段。3、对P3AB片段进行标记及PHF2的杂交筛选片段的标记用胶回收试剂盒进行P3AB DNA扩增片段的胶回收。取约25ng的探针模板DNA于0.5ml离心管中，用随机引物标记试剂盒(Promega-a-GeneRLabeling System)进行标记。
筛选以此随机引物标记探针，对人胎盘cDNA文库进行杂交筛选，获得阳性单克隆后，采用λgt11通用引物扩增阳性克隆的cDNA插入片段，将PCR产物直接测序即得到人PHF2全长cDNA(图1)。4、PHF2 cDNA的序列分析PHF2 cDNA共有2104个碱基(图1)，起始密码子ATG后第一个碱基为G，与Kozak共有序列最保守的碱基一致。3’端poly(A)上游11bp有加尾信号AATAAA。PHF2 cDNA包含了一个完整的开放阅读框(53-1756)，相应的蛋白质由567个氨基酸残基组成。
PHF2基因的蛋白产物与果蝇的多梳样核蛋白(PCL)具有43％的相似性，在靠近编码蛋白N端的一个富含半胱氨酸的150aa区域内有2个相隔不远的PHD锌指结构(PHD结构域在物种进化过程中相当保守。)，其特征序列为CX1-2CX12-13CX2CX4HX2CX17-18CX2C。在我们查询GenBank数据库时已有澳大利亚作者M Coulson登记了PHF基因的一个剪接异构体PHF1(97.10.9)，因此我们将我们克隆的cDNA命名为PHD锌指蛋白基因2(PHD finger proteingene 2 PHF2)，于98年3月4日送往GenBank，登记号为AF052205。实施例2ASH2L1及其可变剪接异构体ASH2L2的筛选1、PCR引物设计P2A、P2B用果蝇ASH2全长cDNA查询GenBank dbEST，获得数个相互重叠的小鼠EST，根据其中AA073756、AA102084的cDNA序列使用oligo 4.0软件设计。2、PCR筛选cDNA文库点阵杂交用特异引物P2A和P2B以PCR的方法筛选点阵排列的人胎脑λDR2 cDNA文库，筛选出胎脑文库中的阳性盒，随后筛选阳性盒的行混合管、列混合管，直至筛出单管cDNA文库。将特异引物P2A和P2B的PCR扩增产物进行随机引物标记，进行噬菌斑原位杂交筛选，最终获得阳性单克隆。
阳性克隆的纯化对照X光片，从培养皿上相应部位挑取阳性克隆噬菌斑，并将其悬浮于300μl SM溶液中。如克隆不是单噬斑，在90mm培养板上铺100个左右的噬斑，随机挑选5至10个单克隆，悬浮于300μl SM溶液中，4℃放置8小时以上。取1μl悬浮液用PCR鉴定，条件同前。3、将阳性λDR2噬菌体环化为质粒pDR2λDR2是一种能在多种人细胞系中高效表达的载体。当λDR2感染表达了cre重组酶的细菌菌株(如E.coli AM1)时，λDR2含有的两个噬菌体P1来源的loxP重组位点能使含插入片段的重组pDR2由λDR2自动切出和环化成质粒，而不需要插入片段的亚克隆。环化操作依据Clontech公司的操作手册进行。4、获得ASH2L1及可变剪接异构体ASH2L2用pDR2F及pDR2R引物扩增质粒的cDNA插入片段，将插入片段最长(约2.1Kb)的pDR2质粒测序即得到我们所要的cDNA(命名为ASH2L1见图2)。
在进行数据分析时，我们首先将此cDNA通过blast工具在人类EST数据库中进行了同源性比较，得到一些3′端完全相同的EST(如AA101373等)，再用这些EST查询UniGene数据库时发现它们都属于UniGene Hs.6856目录下，并在Hs.6856中发现一个长度标为4.3Kb的克隆IMAGE563828，这一结果提示我们可能有更长的克隆存在。因此我们将克隆IMAGE563828购回并测序，发现它的实际长度只有2450bp，并且是ASH2L1的一个可变剪接异构体即ASH2L2(图3)。5、ASH2L1、ASH2L2 cDNA的序列分析ASH2L1 cDNA全长2381bp，从第5到第1891个碱基为一完整的开放阅读框(ORF)，起始密码子ATG后第一个碱基为G，与Kozak共有序列最保守的碱基一致。
ASH2L2 cDNA全长2450bp，ORF的范围是296-1801bp，第一个起始密码子的前3个后1个碱基与ASH2L1的完全相同。在ASH2L2的poly(A)尾上游16bp有加尾信号AATAAA。ASH2L1及ASH2L2相应的蛋白质分别由628及534个氨基酸残基组成，由于可变剪接ASH2L2蛋白比ASH2L1蛋白少94个氨基酸残基，但它们都具有一个C2C2锌指结构。
ASH2L蛋白与果蝇三胸蛋白ASH2的同源性高达60％，根据同源基因命名原则我们将其命名为ASH2同源基因[Homo sapiens ash2(absent，small，or homeotic，Drosophila，homolog)-like gene(ASH2L)]，我们获得了ASH2L基因的两个可变剪接异构体ASH2L1、ASH2L2，并于98年4月1日送往GenBank，登记号分别为AF056718及AF056717。在ASH2的PHD结构域相应的区域ASH2L则是一个C2C2锌指结构，与ASH2L同源的其它物种(如酵母及线虫等)中的蛋白都有PHD结构，但在小鼠及人类的同源蛋白中这一DNA或蛋白结合结构域却演变成了只能结合一个锌离子的C2C2结构。在ASH2L与ASH2蛋白的C端同源性更高，但目前对该区域的生物学功能尚不了解。实施例3人多潜能白血病细胞分化相关基因的鉴定1、人类ASH2L、PHF2基因的表达特异性分析我们从10种代表不同细胞系的人白血病细胞系中提取RNA，用对PHF2、对ASH2L特异的DNA探针进行Northern印迹杂交和分析，结果表明人类ASH2L、PHF2这两个基因在人多潜能白血病细胞系(K562、HEL、Dami)中都有高水平表达，而在其余细胞内的表达量均较少(见图4)。提示这两基因在巨核系分化潜能的细胞中起着某种特殊的作用。
K562细胞系源于一位慢性粒细胞白血病患者。该细胞系具有慢粒白血病标志性染色体ph1染色体，即t(922)。易位涉及22号染色体bcr(breakpoint cluster region)区域及9号染色体的c-abl酪氨酸激酶原癌基因。编码的融合蛋白p210bcr-abl实际上是c-abl蛋白的N端由bcr的N端部分取代。从而导致了c-abl细胞酪氨酸激酶(cryptic tyrosinekinase)的激活。K562细胞具有多潜能造血细胞的特点。通过表面抗原的检测发现它能够表达红系、粒系、单核及巨核系的分子标志物。佛波酯(phorbol ester)及ganglioside GM3等可以诱导K562细胞向巨核细胞系分化。
在细胞分化过程中，DAMI细胞具有较多的成熟巨核细胞的特点，HEL细胞表达αIIb及α2整合素而不能表达其它的巨核细胞标志，如GPI b，因此HEL细胞可能处在一种幼稚的巨核体状态。K562细胞表达TSP(Thrombospondin)表明其处于造血发育的早期阶段，因为TSP存在于大多数处于造血早期阶段的前体细胞中。2、人类ASH2L、PHF2基因在K562细胞诱导分化时表达水平的变化及意义我们使用化合物诱导剂佛波脂(PMA)诱导K562细胞系向巨核细胞分化。
培养细胞悬浮细胞接种于含10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃并充以5％CO2的细胞培养箱中培养生长。
诱导分化收获对数生长期细胞，并重悬于新鲜的含10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，将细胞浓度调整到4-5×105/ml。PMA溶于二甲基亚砜(DMSO)，储存浓度为1mg/mL(1.6×10-3M)避光保存于-20℃。使用时以RPMI-1640培养基将其稀释100倍，每10毫升细胞加稀释后的PMA 31μl，终浓度为50×10-9M。以不同的时间对细胞进行诱导后，收获细胞提取总RNA，进行Northern印迹杂交和分析。
结果向巨核分化过程中我们观察到了表达水平的变化(见图5)。首先是ASH2L变化最为明显。我们第一次用PMA诱导分化时收获细胞提取RNA的时间分别为6、12、24，48、72小时。发现在6小时收获细胞所得的RNA中就几乎检测不到ASH2L的表达。然后我们缩短了诱导时间，分别在0.5、1、2、4、8小时提取RNA，结果显示在1小时内转录本的量就下降了一半。说明ASH2L基因在PMA诱导分化时是一个早期反应基因，提示它的表达下调不需要细胞合成新的蛋白质，很有可能是通过转录后调控对PMA的诱导迅速作出下调的反应。
与此相反，PHF2基因在K562细胞向巨核系分化时转录水平表现出上调，诱导后2、4及8小时分别上升1.3、4.4及7倍。
因此我们认为，ASH2L及PHF2在维持多潜能白血病细胞系Hel、Dami及K562细胞的增殖状态及诱导分化过程中起着重要的调控作用，可用于该肿瘤的基因诊断和作为临床治疗中的辅助诊断指标，还可作为该肿瘤基因治疗的靶基因。
权利要求
1.本发明涉及两个人多潜能白血病细胞分化相关基因PHF2及ASH2L，分析其与白血病细胞增殖与分化状态的关系，特征在于1)这两个基因在有巨核及红系特点的Hel、Dami及K562白血病细胞系中表达量明显增高；在白血病细胞向巨核细胞分化过程中ASH2L表达水平明显下降，而PHF2则表现为一定水平的上调。
2.根据权利要求1所述之人多潜能白血病细胞分化相关基因，其特征在于这两个基因与人类多潜能白血病细胞的增殖及诱导分化状态有关，可用于白血病的基因诊断和治疗。
全文摘要
本发明涉及两个人类多潜能白血病细胞(K562、HEL及Dami)特异高表达基因PHF2及ASH2L,该基因编码含PHD锌指结构(C4HC3)及PHD相关锌指结构(C2C2)的转录因子,与人类多潜能白血病细胞的增殖及诱导分化状态有关,对阐明该类肿瘤发生与分化的生物学机制有一定意义,可用于白血病的基因诊断和治疗。
文档编号A61P35/00GK1247228SQ9911101
公开日2000年3月15日 申请日期1999年7月27日 优先权日1999年7月27日
发明者张伯勤, 袁建刚, 汪俊华 申请人:中国医学科学院基础医学研究所