专利名称:含有合成肽的复合免疫原的制作方法
本发明涉及一种含有一个或多个独特合成多肽的复合免疫原。尤其涉及一种含有皂素衍生物的核心结构，它含有几个类似乙型肝炎病毒外壳蛋白的合成多肽。
要使人工合成的病毒蛋白的多肽类似物具有疫苗一样的潜能，即诱出保护性抗体，它不仅应该含有这些抗体的结合位点，而且还必须具有与T细胞受体和Ia抗原反应的功能区(J.Berzofsky，“Antigenic Structural Requirements foz MHC-Restricted Helper T Cell Recognition，”《Modern Approaches to Vaccines”，21-23，Edited by R.Chanock，R.lerner & F.Broun，Codl Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Laboratory，(1985);J.Berzofsky，“Intrinsic，and Extrinsic Factors in Protein Antigenic Structure”，《Science》229，932-940(1985);T.Watts，J.Gariepy，G.Schoolnik，H.Mcconnell，“T-Cell Activation by Peptide AntigenEffect of Peptide Sequence and Method of Antigen Presentation”，《Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，82，5480-5484，(1985))。
与对蛋白质的免疫应答相比较，对合成肽类的免疫应答具有较窄的遗传限制性，因而合成肽类作为自动免疫的免疫原的可用性很可能受到限制。(A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，D.Stark.和P.Sproul，“Genetic Restriction of Immune Responsiveness to Synthetic Peptides Corresponding to Sequences in the Pre-S Region of the Hepatitis B Virus(HBV)Enuelope Gene”，《Journal of Medieal Virology》，17，119-125，(1985))。
本发明也涉及不适合于作人体疫苗的蛋白质载体和佐剂(即完全和不完全弗氏佐剂)，它们在很多实验中用于帮助证实合成多肽的预防作用。
克服这些问题是有益出的。本发明的一个目的就是通过制备聚合的合成免疫原来克服这些问题，这些免疫原含有多拷贝的几个明显不同的合成肽。这些多聚物很可能具有与T细胞受体和Ia抗原反应的位点。人们也指望着对于含有几个不同的多肽类似物的多聚物的免疫应答要比对于单个肽的应答受到的遗传限制少。而且，多聚免疫原应该具有固有的佐剂性，且不需要蛋白质载体(A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Location and Chemical Synthes is of a pre-S Gene.Coded lmmunodominant Epitope of Hepat it is B Virus，Science，224，392-395，(1984);A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Antiboclies to Hepat it is B Surface Antigen(H Bs Ag) E cited by lmmunization with a Synthetic Peptide Covalently Linked to Liposomes”，The Journal of General Virology，65，1009-1014，(1984);A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Immune Respose to Hepat it is-Virus Determinants Coded by the Pre-S Gene”，Vaccines，85，185-189，Edited by R.A.Lerner，R.M.Chanock & F.Brown，Colel Spring Harbor，NY Cold Spring Harbor Laboratory，(1985))。
现有研究表明，对合成肽的免疫应答可以通过将合成肽整合进脂质体来增强(A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，“Antibodies to Hepat it is B Surface Antigen(H Bs Ag)Elicited by lmmunization with a Synthetic Peptide Covalently Linked to Liposomes”，The Journal of General Vieology，65，1009-1014，(1984);A.R.Neurath，S.B.H.Kent和N.Strick，”，lmmune Response to Hepat it is-B Virus Determinants Coded by The Pre-S Gene”，Vaccines’85，185-189，edited by R.A.Lerner，R.M.Chanock和F.Brown，Cold Spring Harbor，NY∶Cold Spring Harbor Laboratory)或是整合进胶粒(T.P.Hopp，“lmmunogenicity of a Synthetic H Bs Ag Peptide∶Enhancement by Conjugation to a Fatty Acid Carrcer”，Molecular lmmunology，21，13-16，(1984))，并且可以不需要蛋白质载体。但是，为了获得好的抗体应答，在两种情况下都使用了弗氏佐剂。
最近有人叙述过免疫刺激复合体(iscoms)，其中病毒膜蛋白以多聚物的形式存在于皂苷衍生物Quil A之表面(Spikoside)(R.Morein，B.Sundquist，S.Hoglund，K.Dalsgaard和A.Osterhaus，“Iscom，A Novel Structure for Antigenic Presentation of Membrane Proteins From Enveloped Viruses”，Nature，308，457-460，(1984);A.Osterhaus，K.Weijer，F.Uytdehaag，O.Jarrett.B.Sundquist和B.Morein，“Induction of Protective Immune Response in Cats by Vaccination with Feline Leukemia virus Iscom”，The Journal of Immunology，135，591-596，(1985))。整合进免疫刺激复合体中的病毒蛋白质在缺乏佐剂的条件下变得具有高度免疫原性。这两篇文章是用去垢剂裂解病毒而不是用人工合成的肽。将裂解的病毒放入一个含有皂苷衍生物Quil A的容器中进行离心。然后进行透析。
本发明涉及一个复合免疫原，它由多拷贝的一个或多个不同的共价地连接到核心结构上的合成肽组成，而这种核心结构又是由一种皂苷衍生物和一种有机化合物或是具有12-24个碳原子和一个活性部分的疏水肽组成，该活性部分是-COOH，-CHO，-NH或-SH基。
此合成肽类可以是乙型肝炎病毒外壳蛋白的合成肽类似物。乙型肝炎病毒外壳蛋白的合成肽类似物可以从下列的乙型肝炎病毒(HBV)外壳蛋白的三个不同区得到(1)前S1区(2)前S2区(3)S区图1是本发明的一个复合体的显微照片。
图2a和图2b是用本发明的复合体免疫家兔的抗体应答曲线图。
图3是表示用本发明的复合体免疫家兔的抗体应答的时间过程(动力学)曲线图。
图4显示从HBV DNA序列推断出的前S基因区翻译产物的氨基酸序列。该序列以一字母氨基酸密码词表示(这些密码词的规定如下)。它列出了五个不同的HBV亚型的序列。底下的第6行显示了所有五个亚型所共同的氨基酸残基定义氨基酸密码词(如图4所示)D Asp 天冬氨酸N Asn 天冬酰胺T Thr 苏氨酸S Ser 丝氨酸E Glu 谷氨酸Q Gln 谷氨酰胺P Pro 脯氨酸
G Gly 甘氨酸A Ala 丙氨酸C Cys 半胱氨酸V Val 缬氨酸M Met 甲硫氨酸I Ile 异亮氨酸L Leu 亮氨酸Y Tyr 酪氨酸F Phe 苯丙氨酸W Trp 色氨酸K Lys 赖氨酸H His 组氨酸R Arg 精氨酸合成肽一非自然存在的肽本发明涉及一种含有一个或多个下列活性基团的皂苷衍生物和一种有机化合物(即脂族化合物或芳香族化合物)或疏水肽组成的复合体核心结构)。这些活性基团是羧基、醛基、烷基胺和/或硫醇基。只要它们含有上述任一活性基团且在与水混溶的有机溶剂如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇等中是可溶的，任何脂族化合物或芳香族化合物或疏水肽都可以使用。将该复合体进行凝胶过滤以除去有机溶剂和过量的皂苷衍生物。然后将一个或多个不同的合成肽共价地连接到该复合体上。肽类是特异地共价连接到脂族化合物的活性基团上。本发明所使用的较好皂苷衍生物是Quil A。
皂苷(C32H54O18;分子量＝726.5)是得自皂草、尤其是来自Mora excelsa(英属圭亚那)的心材的一种植物糖苷。每一皂苷是由一个组成该分子的algucon部分的皂苷配基和一个糖组成。此皂苷配基可以是甾类或三萜，糖部分可以是葡萄糖、半乳糖、戊糖或甲基戊糖。
该脂族化合物有7-24个碳原子，12-18个碳原子更好，最好是14-18个碳原子，并且有一个或多个选自-COOH、-CHO、-NH和-SH基团的活性部分。用于本发明的脂肪酸(饱和的和非饱和的)的非限定例子包括硬脂酸、油酸软脂酸和豆蔻酸，它们可用碳化二亚胺例如N-乙基-N’(二甲氨基丙基)碳化二亚胺活化。较好的脂族化合物是十八烷硫醇。
肽是结合到脂族化合物的活性部位上。例如，肽的一个末端的-NH基(N-末端)可以与该复合体的-COOH或-CHO活性部位相结合。或者，肽的-COOH末端可与复合体的-NH2活性部位结合。进而，肽的C-末端高丝氨酸内酯端可以与复合体的氨基部位结合(T.Kempe，S.B.H.Kent，F.Chow，S.M.Peterson，W.I.Sundfuist和J.J.L’ Italien，《基因》，39卷，239，(1985))。此外，肽中的巯基(＝半胱氨酸)也可与复合物(例如含有十八烷硫醇)中的巯基结合。
本发明特别针对含有多拷贝的三个不同的合成肽的复合免疫原，它们分别得自乙型肝炎病毒(HBV)外壳蛋白的前S1、前S2和S区。本发明的申请者已经发现，本发明的刺激复合体在没有附加佐剂的情况下在家兔中诱出了识别天然HBV外壳蛋白的抗体。
本发明的含有几个不同肽类似物的复合体使以下情况成为可能(1)克服了在单个肽免疫原中所固有的潜在问题，即在免疫应答过程中T-B细胞协同作用的不足和免疫应答的遗传限制较窄;(2)含有参与病毒中和反应和抗感染保护作用的主要抗原决定基的疫苗的设计;(3)研究对于遗传限定的动物的不同抗原决定基的免疫应答的调节以及评价单个抗原决定基对于位点特异性抗体应答的相互影响。
在本发明中尤其适用的肽是前S(120-145)(A.R.Neurath，S.B.H.Kent，K.Parker，A.M.Prince，N.Strick，B.Brotman和P.Sproul，“Antibodies to a Synthetic Peptide from the Pre-S(120-145)Region of the Hepat it is B Virus Enoelope are Virus-Neutralizing”，Vaccine，4，35-37，(1986))。较合适的肽类还有分别得自HBV外壳蛋白的前S和S序列的前S(21-47)和S(135-155)。
几个乙型肝炎病毒(HBV)分离的基因组的克隆和序列化阐明了该病毒DNA的遗传结构(P.Tiollais，P.Charnay，G.N.Vyas，Science，213，406，(1981))。
乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫学标记物包括表面抗原(HBs Ag)(它包括S蛋白如前S蛋白)、核心抗原(H Bc Ag)、“e”抗原以及它们相应的抗体。抗H Bs Ag的S蛋白和前S蛋白的抗体具有抗感染的保护作用。
HBV和直径大约为22毫微米的亚病毒颗粒的几个抗原亚型(乙型肝炎表面抗原;H Bs Ag)已被鉴定出来。(G.Le Borvier，A.Williams，Am.J.Med.Sci，270，165(1975))。所有这些亚型(例如ayw、adyw、adw2、adw和adr)具有共同的(基团特异性)外壳抗原决定基和免疫应答，这种免疫应答表现足够的抗由任何一种该病毒亚型引起的感染的保护作用(W.Szmuness，C.E.Stevens，E.J.Harley，E.A.Zang、H.J.Alter P.E.Taylor，A.Dcvem、G.T.S.Chem、A.Kellner.等，N.Engl.J.Med.，307，1481，(1982))。
HBV基因组由两条DNA链组成，分别称为长(L)链和短(S)链。L链转录本有四个开放阅读骨架区，分别称作(S+Pre-S)、C、P和X。
开放阅读骨架区(S+Pre-S)对应于HBV DNA的外壳(env)基因，编码在HBV外壳和与病毒相关的颗粒中发现的蛋白质族。
HBV DNA的env基团具有潜在活性的翻译产物的图解表示如下前S区 S区 4001 12 120 174 175 400前S(1) 前S(12) 前S(120) 前S(174) S(1) S(226)175 400单独的S区S(226)400前S(120) S(226)400前S(12) S(226)400前S(1) S(226)上面图解中的数字是指氨基酸(AA)的数目。Metl处的翻译起始点仅是用于adw和adr亚型。而其它亚型的第一个氨基酸对应于前S12位置。
在下文中，对应于前S区(env 1-174)的氨基酸序列用词头“Pre-S”表示，对应于S区(env 175-400)的氨基酸序列用“S”表示，与“单独的S区”表示法中的1至226氨基酸相比，env基因产物表示法中的S区横跨175至400氨基酸。
在上面的图解中，前S区是由前S1-174位置的氨基酸序列确定。S区是由S1位置的序列(开放阅读骨架的175氨基酸且邻近前S174)至S266位置的序列(开放阅读架的400氨基酸)确定。S基因产物(S蛋白)是由这266氨基酸序列组成。
前S1区包括前S1至前S119，前S2区包括前S120至前S174。
天然产生的乙型肝炎病毒的外壳蛋白包括(1)HBV的env基因的全长翻译产物。即，对于adw和adr，前S(1-174)+S(175-400)＝400氨基酸;对于ayw、adyw和adw，前S(12-174)+S(1-226)＝389氨基酸(env12-400);
(2)前S(120-174)+S(175-400)＝281个氨基酸(env 120-400)＝前S区的末端55个氨基酸+组成整个S区的226个氨基酸(对应的蛋白质其大小约为33和36KD(P33和P36)，且彼此糖基化的程度不同);
(3)S(1-226)＝226个氨基酸，即整个S区(env 175-400);代表了HBV外壳(P22和P26)的非糖基化和糖基化形式的约22和26KD的主要成分(“S-蛋白”)。
除前面提到过的前S(21-47)、前S(120-145)和S(135-155)外、本发明较好的肽包括(1)前S(12-32)，其中对于adw2亚型，该序列是MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDP(见图4);
(2)前S(120-145)，其中对于adw2，该序列是MQWNSTAFHQTLQDPRVGLYLPAGG(见图4);
(3)前S(32-53)，其中对于adw2亚型，该序列是PAFGANSNNPDWDFNPVKDDWP(见图4);
(4)前S(117-134)，其中对于adw2亚型，该序列是PQAMQWNSTAFHQTLQDP(见图4);
(5)前S(94-117)，其中对于adw2亚型，该序列是PASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHP(见图4);
(6)前A(153-171)，其中对于adw2亚型，该序列是PAPNIASHISSISARTGDP(见图4);
(7)前S(1-21)，其中对于adw2亚型，该序列是MGG WSSKPRKGMGTNLSVPNP(见图4);
(8)前S(57-73)，其中对于adw2亚型，该序列是QVGVGAFGPRLTPPHGG(见图4);
(9)前S(1-11)，(a)对于adw2，其中该序列是MGGWSSKPRKG(见图4);
(b)对于adr，其中该序列是MGGWSSKPRQG(见图4)。
只要能够诱发辨别HBV前S蛋白或乙型肝炎表面抗原的抗体，由本发明的前S和S基团编码的序列的类似物都可以使用，包括氨基酸缺失、氨基酸取代例如被其它的氨基酸取代或被等配物(经修饰的与蛋白质氨基酸具有密切的结构和立体相似性的氨基酸)取代、氨基酸加入和等配物加入。
从天然来源获得一段肽，是将含有所需氨基酸序列的蛋白质进行选择性蛋白水解，如化学试剂或酶裂解蛋白质。肽的人工合成是用化学方法合成所需氨基酸链。
最好能够确保该肽基与乙型肝炎病毒的前S或S基因编码区中的至少六个连续氨基酸相对应，且具有被乙型肝炎病毒的抗体所识别的立体构型。为此，作为氨基酸链的一部分的一个或多个附加氨基酸可以在两边之中任一边或两边与已知的氨基酸链结合。这些附加氨基酸可以作为增强氨基酸链稳定性的辅助氨基酸，以便它能够很容易地被乙型肝炎病毒抗体所识别。附加氨基酸可以是与天然蛋白质具有同样序列的氨基酸，也可以是其它的氨基酸。
本发明的一种类型就是，具有最小六个氨基酸链长的肽可以在其任一边与附加氨基酸结合，例如，在其任一边接上三个氨基酸，以形成一种较长的氨基酸链。该氨基酸链可以含有与乙型肝炎病毒表面抗原的前S区的至少六个连续氨基酸相对应的一个以上的氨基酸序列。
单个氨基酸序列的长度可能依赖于产生该序列的方法。如果该序列是通过化学手段将单个氨基酸连接起来的话，那么该序列的长度大致不会超过50个氨基酸，最好不超过40个氨基酸。如果合成肽是通过DNA途径获得，链的长度可以较长，例如100或100个以上的氨基酸。但是，它通常比天然前S蛋白质短。在最佳条件下则比天然前S蛋白质更短些，这样，在一个肽具有S区和前S区成分的实施方案中，它的对应于S区的肽部分要比天然S蛋白质短，例如，小于100个氨基酸，更可取的是小于40个氨基酸，而通常少于30个氨基酸。在这些情况下，对应于前S区的肽部分可能具有与整个前S区相对应的长度，但是通常要比整个前S区短。
如果氨基酸序列是长链的一部分，例如有一个以上的氨基酸序列时，该链可以含有各种组成部分的残基，如多聚氨基酸或多糖的片段。
除了含有与乙型肝炎病毒的前S区中的至少6个连续氨基酸相当的一个或多个相同的或不同的氨基酸序列外，例如，含有相当于乙型肝炎病毒的前S区内不同表位(抗原决定簇)一个以上的氨基酸序列，本发明的免疫原还包括含有不同抗原或过敏原的表位氨基酸链，以使得它能被用于针对乙型肝炎病毒和一种或多种其它疾病的疫苗中，如麻疹、流感、天花、脊髓灰质炎，白喉。这些附加的氨基酸序列可能有不同的氨基酸链长度。
本发明获得了一个免疫原，它缺乏天然可产生的乙型肝炎病毒外壳蛋白而得以鉴定，即，本发明的免疫原由一个或一个以上肽序列所组成，这种肽相当于乙型肝炎病毒外壳蛋白质的一个限定的部分。本发明的免疫原也不含有在该病毒粒子中发现的其它蛋白质。
肽的化学合成在下列出版物中已有描述，即S.B.H.Kent，Biomedical Polymers，eds.，E.P.Goldberg和A.Nakajima，(Academic Press，New York)，213-242，(1980);A.R.Mitchell，S.B.H.Kent，M.Engelhard和R.B.Merrifield;J.Org.Chem.，43，2845-2852，(1978);J.P.Tam，T.-W.Wong，M.Riemen，F.-S.Tjoeng和R.B.Merrifield，Tet.Letters，4033-4036，(1979);S.Mojsov.A.R.Mitchell和R.B.Merrifield，J.Org.Chem.，45，555-560，(1980);J.P.Tam.R.D.Dimarchi和R.B.Merrifield，Tet.Letters，2851-2854，(1981);S.B.H.Kent.M.Riemen、M.Ledoux和R.B.Merripield，Proceedings of the IV Inter national Symposium on Methods of Protein Sequence Analysis，(Brookhavan Press，Brookhauen，NY)，1981。
化学合成在所谓的“梅里菲尔德固相法”中，L-氨基酸适当序列是从羧基端到氨基端合成的。开始是通过与树脂的氯甲基、二苯甲基胺或其它活性基团的化学连接，将氨基酸的适当羧基端接到聚乙烯(或其它适当物质)树脂上，然后用下述步骤将氨基酸一个个地加上去。肽-树脂是(a)用二氯甲烷洗涤(b)在室温下，与溶于二氯甲烷中的5%(v/v)二异丙基乙胺(或其它受阻碱)混合10分钟而将其中和;
(c)用二氯甲烷洗涤(d)通过与1/2克分子碳化二亚胺如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺)结合的方法，用相当于六倍正在增长的肽链克分子浓度的氨基酸于0℃活化10分钟，以形成氨基酸的对称酐。所用的氨基酸应是N-α叔丁氧羰基衍生物的形式提供，且带有侧链，而这些侧链是苄基酯(如天冬氨酸或谷氨酰胺)、二苄醚(如丝氨酸、苏氨酸、半肽氨酸或酪氨酸)、苄氧基羰基或在肽合成中常用的其它保护基团保护的。
(e)将活化的氨基酸与肽-树脂于室温反应二小时，结果使新氨基酸加到正在增长的肽链末端上。
(f)用二氯甲烷洗涤肽-树脂;
(g)通过与溶于二氯甲烷中的30至65%(最好是50%)(v/v)三氟乙酸在室温下反应10至30分钟，从最后加上去的氨基酸上去掉N-α-(叔丁氧羰基)基团;
(h)用二氯甲烷洗涤肽-树脂;
(i)重复步骤(a)至(h)，至所需要的肽序列建成。
然后与含有10%(v/v)苯甲醚或其它合适的(芳族的)清除剂的无水氢氟酸反应，以除去树脂上的肽，同时也除去有保护基团的侧链。用凝胶过滤、离子交换、高压液相层析或其它适当方法将肽提纯。
在某些情况下，化学合成可在没有固相树脂的条件下进行，即合成反应完全在溶液中进行。反应过程相似，工艺已为大家所熟知，且终产物也基本相同。
从天然来源分离如能获得足够的整个蛋白质抗原，那么就可采用下面任何一种方法切出带有所需要的氨基酸序列的该分子的特定部分(a)用蛋白水解酶，特别是它们的底物特异性正好能在最靠近所需氨基酸序列的位点断裂开的那些酶进行消化，(b)用化学方法使蛋白质断裂。氨基酸之间的特别键可与特殊试剂反应而裂开。这种例子包括;含有甲硫氨酸的键可用溴化氰打断;天冬酰胺酰-甘氨酸键可用羟胺打断;
(c)蛋白水解和化学断裂相结合。
从天然来源，或用化学方法制备，或同时采用这两种方法克隆DNA分子的一小部分也是可能的，此部分能编码由细菌或其它细胞产生的多肽中所需要的氨基酸序列。
模拟H Bs Ag(S区)的抗原决定簇的肽包括如下S(135-155)(A.R.Neurath、S.B.B.Kent和N.Strick所写的“Specificity of Antibodies Elicited by a Synthetic Peptide Having a Sequenee in Common With a Fragment of a Virus Protein，the Hepat it is B Surface Antigen”一文，见《Proc.Natl Acad.Sci.USA》，79卷，7871-7875页，1982年12月;
肽2含有5个附加的氨基酸残基Ser-Thr-Gly-Pro-Ser-X，117 121
G.R.Dreesma.Y.Sanchez.I.Ionescu-Matiu、J.T.Sparrow、H.R.Six、D.L.Peterson、F.B.Hollinger和J.L.Melnick所写的“Antibody to Hepat it is B Surface Antigen Afer A Single Inoculation of Uncoupled Synthet ic H Bs Ag Peptides”一文，见《Nature》295卷，158-160页，1982年;和(2)下列肽位置 序列48-81 Cys-Leu-Gly-Gln-Asn-Ser-Gln-Ser-Pro-Thr-Ser-Asn-His-Ser-Pro-Thr-Ser-Cys-Pro-Pro-Thr-Cys-Pro-Gly-Tyr-Arg-Trp-Met-Cys-Leu-Arg-Arg-Phe-Ile2-16 Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu-Gln-Cys22-35 Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp-Ser-Trp-Cys38-52 Ser-Leu-Asn-Phe-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Val-Cys-Leu-Gly-Gln-Asn47-52 Val-Cys-Leu-Gly-Gln-Asn95-109 Leu-Val-Leu-Leu-Asp-Tyr-Gln-Gly-Met-Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu104-109 Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu
本发明复合体可用于结合各种病毒、细菌、过敏原和人与动物寄生虫蛋白质的合成肽类似物(诱导出保护性抗体)，除了能结合乙型肝炎病毒抗原的合成肽类似物以外，特别是还能与新合成的乙型肝炎表面抗原的肽类似物结合，此新合成肽类似物含有与HBV前S基因编码的区域中氨基酸序列相当的氨基酸序列。
因此，本发明的复合体也能用于结合下列病毒的合成肽类似物HTLV III/LAV，流感血凝素(A/memphis/102/72株，A/Eng1878/69株，A/NT/60/68/29 C株，A/QU/7/70株，Ao/PR 8/34，Al/CAM/46，A2/Singapore/1/57;B型流感病毒，如B/Lee 40)，真性鸡瘟病毒血凝素，牛痘苗病毒，脊髓灰质炎病毒，风疹病毒，巨细胞病毒，天花病毒，单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型，黄热病病毒，传染性脱脚病病毒，牛痘病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，马鼻-肺炎(马流产)病毒，牛恶性卡它炎病毒，猫鼻气管炎病毒，犬疱诊病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒(与传染性单核细胞增多症和伯基特淋巴瘤有关)，马立克病病毒，棉羊肺腺瘤病毒，巨细胞病毒，腺病毒组，人乳头状瘤病毒，猫粒细胞缺乏病毒，水貂肠炎病毒，非洲马病病毒(9个血清型)，兰舌病毒(12个血清型)，传染性鲑鱼胰腺坏死病毒，禽肉瘤病毒(各种株)，禽造白细胞组织增生病毒(内脏的，成红细胞的和成髓细胞的)，Osteopetrosis病毒，新城疫病毒，副流感病毒1，副流感病毒2，副硫感病毒3，副流感病毒4，腮腺炎病毒，火鸡病毒，CANADA/58，犬温热病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒如乙型流感病毒(如B/Lee/40);狂犬病毒，东部马脑脊髓炎病毒;委内瑞拉马脑脊髓炎病毒;西部马脑脊髓炎病毒;黄热病毒，登革1型病毒(＝6型)，登革2型病毒(＝5型);登革3型病毒，登革4型病毒;日本马脑脊髓炎病毒，科萨努尔森林病毒;跳跃病病毒;墨累山谷脑炎病毒，鄂木斯克出血热黄病毒(Ⅰ型和Ⅱ型);圣路易斯马脑脊髓炎病毒;人鼻病毒，口蹄疫病毒;1型脊髓灰质炎病毒;肠道病毒脊髓灰质炎2，肠道病毒脊髓灰质炎3;禽传染性支气管炎病毒;猪可传染的胃肠炎病毒;淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒;拉沙病毒;马休波病毒;伯钦特病毒;塔卡里伯病毒;乳头状瘤病毒;辛德毕斯病毒等等。
本发明的复合体也可用于与细菌(如引起麻风病、结核病、梅毒和淋病的细菌)的合成肽类似物结合。
本发明的复合体还可用于与下列寄生物的合成肽类似物结合携带疟疾(恶性疟，卵园症)，血吸虫、锥虫、利什曼原虫、南美洲锥虫病、阿米巴病、钩虫等等。
本发明的免疫原可用作疫苗的活性成分，且可与生理上可接受的稀释剂(介质)如磷酸缓冲盐一起使用。一般而言，在一个生理上可接受的介质中合成肽的浓度一次剂量约为1毫克以下，10微克以上。但无需使用佐剂。
该疫苗可皮下注射、皮肉注射或肌肉注射给予。但哪种途径更好则取决于特定的疫苗，肌肉注射一般较好。注射次数也因疫苗而异。一般来说，注射一个月，初次免疫后6～12个月加强免疫一次。加强注射要根据初次免疫后血中抗体的水平而定，某些病例可能无需加强免疫。
本发明的疫苗可用于改善免疫应答，以及克服对于某些已知乙型肝炎病毒疫苗(如，不含有相当于前S区中氨基酸序列的肽的疫苗)的无反应性。
现在根据下面非限定例子叙述本发明。
实例将8毫克十八烷硫醇(Fluka，Hauppauge，New York)和20毫克2-巯基乙醇(ME)在20℃溶解于2毫升二甲基亚砜(DMSO)中。30分钟后，加入8毫克Spikoside(Isotec AB，Lulea，Sweden)，然后将该混合物加到40毫升的“SEPHADEX G-10”柱上(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)，该柱预先已用0.8%的乙酸钠(PH6.7)洗涤，继之用2毫升含有2毫克/毫升Spikoside的同样缓冲液洗涤。样品上柱后，用同样缓冲液但含有2微克/毫升Spikoside洗脱。收集和混合相当于外水体积的乳白色部分，并与2毫克合成肽前S(120-145)混合，此合成肽前S来自HBV外壳蛋白adw2亚型的前S2序列(A.R.Neurath等，《Science》，224卷，392-395(1984)上述;R.R.Neurath和S.B.H.Kent，“Antigenic Structure of Hunman Hepat it is Viruses in Immunochemistry of VirusesThe Basis for Serodiagnos is and Vaccines”，325-366页，由M.H.V.Van Regenmortel & A.R.Neurath，AmsterdamElsevier编辑，(1985))，而且在C-末端有甘-甘-半胱氨酸间隔物。该肽用ME(100微克/毫升)还原并冻干。然后在一小时内，于30℃加入5×40μl铁氰化钠(6m M)，但pH要维持在6.7。该混合液用pH7.2 0.14M Na C10.01 M磷酸(PBS)透析。用2，000转/分离心从适量的PBS中分离出免疫刺激复合体。他们于4℃沉淀，20℃悬浮。用酶联免疫分析(EL ISA)，系列稀积的合成肽iscoms与连接到β-半乳糖苷酶上的前S(120-145)所进行的竞争性试验表明，(A.R.Neurath S.B.H.Kent和N.Striclk，Specificity of Antibodies Elicited by a Syjnthetic Peptide Having a Sequence in Common With a Fraqment of a Virus Protein，the Hepat it is B Surface Antigen，”《Proceeding，of the National Academy of Science，U.S.A.》79卷，7871-7875页，(1982))该肽已完成附着到免疫刺激复合体上。用同样方法已分别制备出含有获自HBV外壳蛋白前S1和S序列的前S(21-47)和S(135-155)类似物的复合体(Neurath等，1982，见上述;A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，P.Taylor和C.E.Stevens，Hepat it is B Virus Contains Pre-S.Gene-EncodedDomains，“《Nature》，315卷，154-156页，(1985);Neurath和Kent，(1985)，文章如前述。不同之处是对于后一种肽，用0.1M磷酸盐(pH8)进行分子排阻层析，没有使用铁氰化钠，以及该肽与免疫刺激复合体的结合延长至16小时。EL ISA竞争试验表明两种肽与复合体的结合都是完全的。
将三种不同的复合体重新溶于DMSO中，且混合一起(总体积为4毫升)。加入4毫克Spikoside，然后将混合液加到已用含有2微克/毫升Spikoside的PBS洗涤的“SEPH ADEX G10”柱(40毫升)上。收集相当于该柱外水体积的部分，将含有吸附了全部三个不同肽的免疫刺激复合体的部分(图1)相混合，并于免疫四只兔子。每次免疫的剂量相当于三种不同肽外壳每一种均为125微克，间隔2周。
图1是含有相当于HBV外壳蛋白的前S1、前S2和S区的合成肽的免疫刺激复合体(已用抗-前S(21-47)凝集的)显微照片(用250倍的相差物镜照像;线长＝30微米)。免疫刺激复合体的直径约为1至3微米。
兔子对所有结合到免疫刺激复合体中的合成肽类似物均产生了应答，因此后来与以完整乙型肝炎表面抗原形式存在的HBV外壳蛋白发生了反应(H Bs Ag);含有前S1、前S2和S区蛋白序列(Neuvath等，《Nature》，315卷，154-156页(1985)，文章如前述)与胃蛋白酶处理的H Bs Ag也有反应(含有专性的S蛋白，Neurath等，《Nature》，315卷，154-156，(1985)，文章如前述)。如电子显微镜所规定到的抗血清将HBV颗粒凝集起来(资料未列出)。两个最好的应答者所获得的结果见图2。
图2代表免疫刺激复合体初次免疫后10周的抗体应答结果。此合成物含有来自HBV外壳蛋白亚型adw2(Neurath和Kent，(1985)，文章同上)前S1、前S2和S蛋白序列。于抗体用放射免疫分析法测定。
以125I-标记抗-兔IgG作为第二抗体。用于包被固相的抗原在插页中已指明。从相当于抗-复合物血清的放射计数中减去相当于免疫前血清的放射性计数。图2没有显示抗肽S(135-155)的抗体的应答，因为它们与对S蛋白的应答的关联很少(Neurath等，(1982)，文章如上述;Neurath等，《The Journal of General Virology》，65卷，1009-1014页，(1984))。
识别H Bs Ag的抗体水平随免疫次数而增加(图3)，提示记忆细胞的产生。
图3表示一只兔子经图2所描述方案免疫后抗HBV外壳蛋白抗体应答的动力学。用H Bs Ag包被小球，用于检测抗体，经Western斑点法和血清学分析(Neurath 等，《Nature》，315卷，154-156页，(1985)，文章如前述)证明其含有所有外壳蛋白质。终点稀释代表最高的稀释，此时相当于抗血清的计数除以相当于相同稀释的免疫前血清的计数的比值(放射免疫分析比值单位)大于或等于2.1。抗S-蛋白抗体用非稀释血清籍AUSAB试验(Alfott实验室，North Chicago，Illinois)进行测定。因此，图3中左边和右边的纵距的标度是不可比较的。
请注意本说明书和权利要求
可以图解方式提出，但不限如此，不离开本发明的精神和范围的情况下可以作各种修正和更改。
权利要求
1.一个复合免疫原，它由一个核心结构和共价地连接到核心结构上的一个或一个以上独特合成肽的几个拷贝组成，该核心结构由一个皂苷衍生物和一个具有一个或一个以上活性部分的7至24个碳原子的有机化合物或疏水肽组成，该活性基团选自-COOH、-CHO、-NH2和-SH基。
2.如权利要求
1所述的复合免疫原，其中的有机化合物是一个脂族化合物。
3.如权利要求
2所述的复合免疫原，其中的脂族化合物是十八烷硫醇。
4.如权利要求
1所述的复合免疫原，其中皂苷衍生物是Quil A。
5.如权利要求
1所述的复合免疫原，其中合成肽是乙型肝炎病毒外壳蛋白 合成肽类似物。
6.如权利要求
1所述的复合免疫原，其中所说的合成肽包括(1)至少一种乙型肝炎病毒外壳蛋白的前S1区的肽类似物，(2)至少一种乙型肝炎病毒外壳蛋白的前S2区的肽类似物，(3)至少一种乙型肝炎病毒外壳蛋白S区的肽类似物。
7.如权利要求
6所述的复合免疫原，其中合成肽类似物(2)是前S(120-145)。
8.如权利要求
6所述的复合免疫原，其中合成肽类似物(1)是前S(21-47)。
9.如权利要求
6所述的复合免疫原，其中合成肽类似物(3)是S(135-155)。
专利摘要
本发明涉及一种复合免疫原，它由一核心结构和共价地连接到核心结构上的一个或一个以上独特合成肽的多个拷贝所组成，该核心结构由一种皂苷衍生物和一种具有12至24个碳原子的有机化合物或带有选自-COOH、-CHO、-NH
文档编号C07K1/113GK87103084SQ87103084
公开日1988年2月3日 申请日期1987年4月27日
发明者亚历山大·罗伯特·纽拉斯, 斯蒂芬B·H·肯特, 内森·斯蒂利克 申请人:纽约血库公司, 加利福尼亚技术学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan