况下取血，测外周血淋巴细胞和中性细胞。分离血清，用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测血清中白介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α )和前列腺素2 (PGE2)的含量。大鼠踝关节固定于10%福尔马林内，经1096EDTA脱钙后常规石蜡包埋，制片，HE染色，由病理专业人员阅片，观察关节滑膜组织、关节骨、软骨组织损伤程度进行评分比较。
[0034]实验结果
延胡索总生物碱对大鼠足肿胀程度和关节炎指数的影响
以致炎前大鼠足体积与给药后大鼠足体积的差值(AmL)来衡量大鼠足肿胀的程度。如表I所示，与正常组对比，模型组大鼠致炎测足部显著肿胀(P < 0.05)。与模型组相比较，延胡索总生物碱高低剂量组均显著抑制大鼠关节肿胀(P < 0.05)。
[0035]1.延胡索总生物碱、紫堇单酚碱对大鼠致炎侧足体积变化的影响组别致炎侧足体积变化(Λ mL)
第7天第14天第21天第28天
正常组 ，0.16±0.03，0.15±0.01， 0.14±0.04，0.15±0.01
模型组 ，2.52±0.17， 2.25±0.23， 2.31±0.24，2.12±0.35
阳性药组，1.23±0.08， 1.13±0.15， 0.98±0.07， 0.86±0.15 延胡索总生物碱，1.36±0.13*， 1.23±0.50*， 0.52±0.08*，0.47±0.12* 紫堇单酚碱，0.83±0.06*， 0.62±0.03*， 0.56±0.03*， 0.27±0.12*
黄连素紫堇单酚碱，0.23±0.01*，0.37±0.04*，0.38±0.03*，0.21±0.13*
*为与模型组比较具有显著性差异(P < 0.05)
大鼠关节炎指数采用通用的5分标准，即O分为无改变，I分为踝骨部有肿胀，2分为踝骨部和跗骨部均有肿胀，3分为肿胀延伸至跖骨部，4分为整个后足肿胀明显。每只受试大鼠的关节炎评分最高分为8分，即两只后足评分的加和。如表2所示，与模型组比较，延胡索总生物碱的高低剂量组均显著降低大鼠关节炎指数(P < 0.05)。
[0036]2.延胡索总生物碱、紫堇单酚碱对大鼠关节炎指数的影响组别关节炎指数
第7天， 第14天， 第21天， 第28天模型组，5.23±0.75， 6.89±0.56， 5.56±0.21， 4.32±0.60 阳性药组，4.12±0.32，2.78±0.69， 2.14±0.23， 1.52±0.53 延胡索总生物碱，4.07±0.16*，4.32±0.14*，3.12±0.35*，2.22±0.34*
紫堇单酚碱，3.21±0.15*，2.56±0.27*， 2.65±0.28*，1.86±0.26*
黄连素紫堇单酚碱，2.16±0.13*，1.98±0.16*，1.85±0.16*，1.73±0.29*
黄连素，5.04±0.35， 6.75±0.12， 5.26±0.25， 4.17±0.42 *为与模型组比较具有显著性差异(P < 0.05)
延胡索总生物碱、紫堇单酚碱对大鼠外周血淋巴细胞和中性细胞的影响如表3所示，与正常组比较，模型组大鼠外周血淋巴细胞显著降低(P < 0.05)，中性细胞显著升高(P < 0.05)。延胡索总生物碱高低剂量组与模型组比较，外周血淋巴细胞均显著升高，中性细胞均显著降低。
[0037]表3.延胡索总生物碱对大鼠外周血淋巴细胞和中性细胞的影响组别，淋巴细胞计数(106)， 中性细胞计数(106)
正常组，156.21±5.52，45.75±2.52
模型组，79.22±2.45，102.87±6.02
阳性药组，115.52±6.38，68.13土 L 96
延胡索总生物碱，123.63±7.26*，36.17±1.25*
紫堇单酚碱，136.6±2.24*，41.15±1.58*
黄连素紫堇单酚碱， 147.2± 1.37*，43.27±1.86*
黄连素，76.48±1.98，99.36±6.52
*为与模型组比较具有显著性差异(P < 0.05)
(1)延胡索总生物碱、紫堇单酚碱对大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2含量的影响模型组大鼠血清中IL-6、TNF-a和PGE2的含量与正常组比较显著性提高(P < 0.05)。
延胡索总生物碱提取物、紫堇单酚碱大鼠血清中IL-6、TNF-a和PGE2的水平与模型组对比，均显著性降低(P < 0.05)。。
[0038]表4.延胡索总生物碱对大鼠血清IL-6、TNF_a和PGE2含量的影响组别，IL-6 (pg/mL),TNF-a (pg/mL) , PGE2 (pg/mL)
正常组， 35.78±1.23 ，51.24±1.89 ， 31.48±2.56
模型组， 78.14±3.26 ，121.3±5.31 ， 98.45±4.23
阳性药组，48.79±1.75 ， 87.56±4.89 ， 56.21 ±3.75 延胡索总生物碱，45.12±2.46* ， 78.12±3.92* ， 52.12±1.52*
紫堇单酚碱， 42.35±1.26* ， 63.16±1.26* ， 45.12±1.57*
黄连素紫堇单酚碱，41.45± 1.31* ， 57.25±1.89* ， 40.26±1.16*
黄连素，79.26±3.78 ，123.1±5.59 ，97.21±4.56
*为与模型组比较具有显著性差异(P < 0.05)
(2)延胡索总生物碱、紫堇单酚碱对大鼠关节病理变化的影响
大鼠踝关节固定于10%福尔马林内，经1096EDTA脱钙后常规石蜡包埋，制片，HE染色，由病理专业人员阅片，观察关节滑膜组织、关节骨、软骨组织损伤程度进行评分比较。根据各部位病变轻重程度，依次定量为O至4分。I分(轻度)，2分(中度)，3分(重度)，4分(极重度)，0分(基本正常)。累加所有分数，得出每组平均分数。
[0039]结果显示，正常组大鼠的滑膜表面覆有1-4层滑膜细胞，无明显变性、坏死，无增生。关节面骨和软骨组织无变性、坏死。周围皮肤未见炎症反应。
[0040]模型组大鼠的滑膜细胞中度变性，滑膜组织中度充血，内有炎细胞浸润，炎细胞类型主要为单核巨噬细胞和中性粒细胞。真皮及皮下组织内有大量炎细胞浸润，炎细胞类型主要为单核巨噬细胞、淋巴细胞及少量中性粒细胞。
[0041]与模型组比较，延胡索总生物碱、紫堇单酚碱均显著减轻关节炎病变。
[0042]表5.延胡索总生物碱、紫堇单酚碱对大鼠关节病理变化的影响组别，动物只数，病理变化评分
正常组，10，0.00±0.00
模型组，10，6.00±0.36
阳性药组，10，1.89±0.42
延胡索总生物碱，10，1.42±0.18*
紫堇单酚碱，10，1.19±0.12*
黄连素紫堇单酚碱，10， 1.02±0.18*
黄连素，10， 6.03±0.41
为与模型组比较具有显著性差异(P < 0.05)
实施例9薄层色谱法:
吸附剂:硅胶G薄层预制板(青岛)；
展开剂:乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水(10: 3: 1.5:1: 1)，
实施例2样品I μ L点板，
展开温度室温，展开前预饱和15min,展距1cm,
取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
[0043]6.9 cm仅出现唯一的斑点。
[0044]实施例10高效液相色谱法:
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；岛津液相仪流动相为乙腈-1%甲酸水溶液(20: 80体积比)，等度洗脱；
流速1.0mL/min ;柱温30°C ;检测波长280nm。
[0045]在上述条件下，分别吸取去实施例2样品(流动相溶液)10 μ L，注入高效液相色谱仪进行分析，
该图谱中I个色谱峰，出峰时间18.36分钟，峰面积456936.35AU。
【主权项】
1.一种延胡索的制药用途，特征在于延胡索在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用。
2.一种延胡索总生物碱的制药用途，特征在于延胡索总生物碱在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述的紫堇单酚碱来源于延胡索总生物碱。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于:取延胡索生药，加入盐酸溶液加热提取，合并提取液，过滤，减压浓缩，调节PH值至碱性，继而用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，回收溶剂至干，精制，得紫堇单酚碱。
5.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于:是由有效量的紫堇单酚碱为活性成分，加上药学的辅料或辅助性成分制备成常用的药物制剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于:所述的制剂为口服制剂。
7.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于:是由有效量的紫堇单酚碱、黄连素为活性成分，加上药学的辅料或辅助性成分制备成常用的药物制剂。
【专利摘要】本发明提供了延胡索的新用途，即在制备抗类风湿性关节炎的药物中的用途。
【IPC分类】A61K31-4375, A61P19-02, A61P29-00, A61K36-66
【公开号】CN104547052
【申请号】CN201510035007
【发明人】王小华
【申请人】王小华
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月25日