相转变 温度LCST为吸收度A升高至总升高值一半所对应的温度T，结果见图8,图中结果显示该微 凝胶在葡萄糖浓度为100 mg/dl、200 mg/dl溶液中的体积相转变温度分别为36. 4 ―和38. 3 oC O
[0038] (7)载药微凝胶胰岛素释放行为研究：称取二份等质量(每份10 mg)的载药微凝 胶，用37°C下恒温30 min的含葡萄糖浓度分别为100 mg/dL、200 mg/ dL的溶液5 ml分 散，装入透析袋(截留分子量为8000?12000)中，浸入到37 °C下恒温30 min的含葡萄糖 浓度分别为100 mg/dL、200 mg/ dL的45 mL溶液中，将摇床温度设定为37 °C，分别在15， 30,45,60,90,120,180, 240, 300 min的时间点用紫外分光光度计于波长为226. 5处测定吸 光度A (用对应浓度的葡萄糖水溶液为空白对照)，比较在含葡萄糖浓度分别为100mg/dL、 200mg/dL的溶液中胰岛素的释放行为。结果见图9,从图中可以看出，在葡萄糖浓度为100 mg/dl (正常血糖值)溶液中的紫外吸收度A明显比在葡萄糖浓度为200 mg/dl (糖尿病患者 高血糖值）溶液中低，说明在正常血糖浓度情况下胰岛素的释放量低下，而在高血糖浓度下 胰岛素的释放量明显提高。这是由于该载药微凝胶在正常血糖浓度（100 mg/dl)中的LCST 为36.4 °C (低于体温，在体温37 °C时凝胶表面收缩形成薄而致密层，阻止胰岛素释放）， 而当葡萄糖浓度升至高血糖浓度（200 mg/dl)时，其LCST升至38. 3 °C (高于体温，在体 温37 °C时致密层消失，致使胰岛素快速释放）。该凝胶体系实现了生理温度（37.0 °C)下 围绕葡萄糖浓度变化呈现"开-关"胰岛素自律释放模式。
【主权项】
1. 一种葡萄糖敏感自律式胰岛素释放微凝胶载体，其特征在于：所述的葡萄糖敏感微 凝胶由3-丙烯酰氨基苯硼酸、N-异丙基丙烯酰胺、含乙烯基功能性基团的RGD小分子多肽 三种单体经自由基聚合得到。
2. 根据权利要求1所述的葡萄糖敏感自律式胰岛素释放微凝胶载体，其特征在于： 3_丙烯酰氨基苯硼酸5?15mol%、含乙烯基功能基团的亲水性RGD多肽5?15mol%、，异 丙基丙烯酰胺60?85mol%。
3. -种葡萄糖敏感自律式胰岛素释放微凝胶载体的制备方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 葡萄糖敏感微凝胶的制备：称取单体3-丙烯酰氨基苯硼酸5?15 mol%、含乙烯 基功能基团的亲水性RGD多肽5?15 mol%、，异丙基丙烯酰胺60?85 mol%及交联剂 % 亚甲基双丙烯酰胺1?6 mol%，并量取100 mL蒸馏水，加入到装有冷凝装置、氮气导 管、恒压滴液漏斗和磁力搅拌子的三口烧瓶中，开启搅拌，通入氮气30 min，加热至60?80 °C，通过恒压滴液漏斗加入引发剂过硫酸胺1?5 mol%，转速为1000 r/min，氮气环境下反 应24 h制备微凝胶，将微凝胶装入透析袋，浸入到蒸馏水中透析，每24 h更换蒸馏水，共3 次，将透析后的微凝胶高速（12000 r/min)离心10 min，弃去上层清液，经冷冻干燥后得到 葡萄糖敏感微凝胶，所述透析袋的截留分子量为8000?14000 ; (2) 载药胰岛素微凝胶的制备：称取步骤（1)制得的微凝胶40 mg，加入到浓度为20 mg/mL的胰岛素溶液中，置冰箱4 °C中平衡48 h后，12000 r/min高速离心10 min，弃去上 层清液，沉淀物用4 °C的稀盐酸清洗，去掉吸附在微凝胶表面上的胰岛素，微凝胶经冷冻干 燥后得到载药微凝胶。
4. 如权利要求3所述的一种葡萄糖敏感自律式胰岛素释放微凝胶载体的制备方法，其 特征在于：步骤（1)中的含乙烯基功能基团的亲水性RGD多肽按如下步骤制备： (1) 称取2-氯三苯甲基氯树脂，装入多孔过滤漏斗多肽合成装置中，用溶剂二甲基甲 酰胺（DMF)洗涤2?3次，然后加入DMF浸泡树脂30 min，最后排出溶剂DMF ; (2) 称取氨基及侧基上羧基分别被9-芴甲氧羰基和叔丁基保护的天冬氨酸于试管中， 用DMF将其溶解，然后将该溶液转入步骤（1)中合成装置中，再加入催化剂N，N-二异丙基 乙胺，室温下让氨基及侧基上羧基分别被9-芴甲氧羰基和叔丁基保护的天冬氨酸与树脂 相互作用约30 min，使氨基及侧基上羧基分别被9-芴甲氧羰基和叔丁基保护的天冬氨酸 充分固定在树脂上； (3) 用DMF洗涤步骤（2)的树脂4?5次，并用茚三酮检验缩合反应是否完全； (4) 加入20%哌啶-二甲基甲酰胺溶液到步骤（3)的树脂中，充分反应脱去天冬氨酸 上的芴甲氧羰基保护基； (5) 用DMF洗涤步骤（4)的树脂4?5次； (6) 称取氨基被9-芴甲氧羰基保护的甘氨酸于试管中，用DMF溶解，加入缩合剂1-羟 基苯并三唑、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐及催化剂N，N-二异丙基乙基 胺，并将该溶液转入到步骤（5)树脂中，让甘氨酸的C端羧基与天冬氨酸的N端氨基充分缩 合； (7) 用DMF洗涤步骤（6)所得的树脂4?5次，并用茚三酮检验缩合反应是否完全；（8) 加入20%哌啶-二甲基甲酰胺溶液到步骤（7)树脂中，充分反应脱去甘氨酸上的芴甲氧羰 基保护基； (9) 用DMF洗涤步骤（8)的树脂4?5次； (10) 称取氨基及侧基上胍基分别被9-芴甲氧羰基和2, 2, 4, 6, 7-五甲基-2H-苯 并呋喃-5-磺酰基保护的精氨酸于试管中，加入缩合剂1-羟基苯并三唑、苯并三氮 唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐及催化剂N，N-二异丙基乙基胺，并将该溶液转入到步 骤（9)的树脂中，让精氨酸的C端羧基与甘氨酸的N端氨基充分缩合； (11) 用DMF洗涤步骤（10)所得树脂4?5次，并用茚三酮检验缩合反应是否完全； (12) 加入20%哌啶-二甲基甲酰胺溶液到步骤（11)的树脂中，充分反应脱去精氨酸 上的芴甲氧羰基保护基； (13) 用DMF洗涤步骤（12)的树脂4?5次； (14) 称取丙烯酸于试管中，加入缩合剂1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四 甲基脲六氟磷酸盐及催化剂N，N-二异丙基乙基胺，并将该溶液转入到步骤（13)树脂中，让 丙烯酸的羧基与精氨酸的N端氨基充分缩合； (15) 用DMF洗涤步骤（14)所得的树脂4?5次； (16) 用甲醇和二氯甲烷分别洗涤步骤（15)所得的树脂2?3次，将其干燥； (17) 加入脱保护剂三氟乙酸、三异丙基硅烷和蒸馏水(体积比95:2. 5:2. 5)到步骤 (16)制备的树脂中，脱去叔丁基得到含乙烯基功能基团的RGD小分子多肽。
【专利摘要】本发明提供一种葡萄糖敏感自律式胰岛素释放微凝胶载体及制备方法，本发明所述的葡萄糖敏感自律式胰岛素释放载体由3-丙烯酰氨基苯硼酸、含乙烯基功能基团的亲水性RGD多肽、N-异丙基丙烯酰胺三种单体经自由基聚合获得葡萄糖敏感纳米凝胶，所述葡萄糖敏感纳米凝胶再与胰岛素组合得到载药微凝胶。本发明提供的葡萄糖敏感自律式胰岛素释放微凝胶载体能够实现体温下依葡萄糖浓度变化而自动“开-关”释放胰岛素。
【IPC分类】A61P3-10, A61K47-34, A61K38-28, A61K9-00, A61K47-42
【公开号】CN104586752
【申请号】CN201510035082
【发明人】刘红, 杜鹏, 陈勇, 王宗春
【申请人】湖北大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月23日