用于治疗糖尿病的组合物和方法

用于治疗糖尿病的组合物和方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是于2012年6月19日提交的美国申请序列号13/527,350的部分继续申 请；其是于2010年4月12日提交的美国申请序列号12/305, 869的部分继续申请；其是于 2008年2月25日提交的国际申请号PCT/US2008/054911的§ 371国家阶段申请，其要求于 2007年2月23日提交的美国临时申请号60/891，369的优先权权益，所有这些均通过引用 以其整体并入本文。
[0003] 关于联邦资助的研究或开发的声明
[0004] 本发明是在国立卫生研究院心肺血液研究所（Heart,Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health)授予的基金号HL59412和NIH 5F32HL095282-03 的美国政府支持下完成的。美国政府对本发明享有某些权力。
技术领域
[0005] 本发明一般性地涉及分子生物学、基因疗法和医学领域。在一个实施方案中，本发 明提供了用于神经肌肉疾病和溶酶体贮积病的基于基因疗法的治疗。
【背景技术】
[0006] 庞皮病（Pompe disease)是酸性α -葡糖苷酶（GAA)缺陷导致的溶酶体和糖原C： 积病二者。GAA通常在溶酶体中作用，在溶酶体中，其通过切割α-1，4和α-1，6糖苷键降 解过量的糖原。GAA活性不足时，所有细胞中将积累大量糖原。虽然在庞皮病中溶酶体糖 原为全身性积累，但是常规上将骨骼肌和心肌功能障碍视为这种疾病中肌肉无力的主要基 础。

【发明内容】

[0007] 本发明提供了用于向多种组织、器官和细胞（包括骨骼肌、心脏和CNS)递送治疗 性基因以用来恢复神经肌肉接点（neuromuscular junction)完整性和/或治疗神经肌肉 疾病以及糖原贮积病的rAAV载体。有利地，本发明的rAAV载体提供了目的治疗性基因在 对象中的长期、持续表达。
[0008] 在某些实施方案中，本发明提供了用于神经肌肉疾病的治疗，所述神经肌肉疾 病包括，但不限于：庞皮病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、Ia型糖原贮 积病、肢带型肌营养不良（limb Girdle muscular dystrophy)、Barth 综合征（Barth syndrome)和重症肌无力。
[0009] 在一个实施方案中，本文描述了用于治疗溶酶体贮积病（例如，糖原贮积病，如庞 皮病）的组合物和方法。
[0010] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域普通技术人 员的通常理解相同的含义。
[0011] 在一个实施方案中，本文描述的方法包括向具有酸性α-葡糖苷酶缺陷的哺乳动 物对象施用包含至少一种rAAV病毒体的组合物，所述rAAV病毒体包含编码酸性α -葡糖 苷酶的多核苷酸，所述多核苷酸设置在第一 AAV反向末端重复和第二AAV反向末端重复之 间，其中所述组合物的施用导致所述哺乳动物对象中运动神经元功能的提高。所述哺乳动 物对象可患有庞皮病。所述组合物经静脉内、鞘内或肌内施用。在一个实施方案中，所述至 少一种rAAV病毒体可包含血清型1、8、9和/或rhlO衣壳蛋白。所述组合物可施用至哺乳 动物对象的隔膜（diaphragm)并通过逆行运输（retrograde transport)输送到至少一个 运动神经元，或者可以直接施用至中枢神经系统。
[0012] 本文描述的另一种方法包括向患有庞皮病的哺乳动物对象施用包含编码酸性 α -葡糖苷酶之至少一种病毒载体的组合物，其中所述组合物的施用导致所述哺乳动物对 象中运动神经元功能的提高并治疗庞皮病。所述至少一种病毒载体可以是rAAV载体。所 述组合物可经鞘内、静脉内、肌内或肠胃外途径施用。在一个实施方案中，所述rAAV载体可 在包含血清型1、8、9和/或rhlO衣壳蛋白的rAAV病毒体内。
[0013] 所述组合物可施用至哺乳动物对象的隔膜然后通过逆行运输输送到至少一个运 动神经元，或者可以施用至中枢神经系统。
[0014] 虽然可使用与本文描述的那些类似或相当的组合物和方法来实践或测试本发明， 但是下文描述了合适的组合物和方法。本文提到的所有出版物、专利申请和专利均通过引 用以其整体并入。在冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。以下讨论的一些特定 实施方案仅用于说明，而不旨在进行限制。
[0015] 附图简述
[0016] 在所附权利要求中具体指明了本发明。通过参考以下结合附图的描述，本发明的 上述以及其他优点将更容易理解，其中：
[0017] 图1A、图IB和图IC是染色的心脏组织的扫描照片，并且图ID是示出静脉内 递送rAAV2/9导致心脏高水平转导的图。通过之前描述的颞静脉递送途径，向1天大的 C57BL6/129SvJ新生小鼠 （η = 5)注射携带有CMV-IacZ构建体之I X IO1Vg的rAAV假型 AAV2/UAAV2/8和AAV2/9。在注射后4周时，进行β-半乳糖苷酶检测测定以量化IacZ表 达水平。图1Α、图IB和图IC示出了来自用AAV2/1(图lA)、AAV2/8(图1Β)和AAV2/9(图 1C)注射之心脏的X-Gal染色的冷冻切片。图ID示出了心脏中的β-半乳糖苷酶水平（η =5)。
[0018] 图 2Α 和图 2Β 是示出了在递送 rAAV2/8-CMV-lacZ 或 rAAV2/9-CMV-lacZ 构建体之 后的多个标本中检测的β_半乳糖苷酶水平的表达分布分析的图。图2A示出了与心肌相 比整个肌肉组织中的生物学分布。Ht表示心脏；Di，隔膜；Qu，四头肌；So,比目鱼肌；EDJi 长伸肌；TA，胫骨前肌（tibialis anterior)。图2B示出了非骨骼肌中表达的生物学分布。 Br表示脑；Lu,肺；Sm,小肠；Ki，肾；Spl，脾。
[0019] 图3A、图3B和图3C是示出了在rAAV2/9介导的CMV-IacZ递送后之时间进程测定 的图。图3A :在使用rAAV2/9递送转基因之后，施用后4周时骨骼肌中的表达水平达到平 台，而心脏中在实验的8周持续时间内持续提1?。图3B不出，在实验持续期间，心脏组织中 每个细胞的载体基因组也持续增加，但是骨骼肌中并非如此。图3C示出在实验期间，心脏 组织中的RNA转录本也增加（每个时间点η = 4)。
[0020] 图4Α是示出了来自在出生1天时注射IXlO11Vg rAAV2/9-CMV-lacZ之小鼠的心 脏和骨骼肌（施用后4周时）的β-半乳糖苷酶表达水平分析的图。图4B是示出了来自 在3个月大时通过颈静脉注射I X 10nVgrAAV2/9-CMV-lacZ之小鼠 （η = 3)的心脏和骨骼 肌（施用后4周）的β-半乳糖苷酶表达水平分析的图。图5Α是示出了来自在出生时静 脉内注射 rAAV2/l-CMV_hGaa 或 rAAV2/9_CMV_hGaa 之恒河猴（rhesus macaque)的心脏组 织标本中的GAA活性的图。Y轴表示每个递送的载体基因组的总GAA活性减去来自未注射 的对照的背景活性。图5B是证明来自在出生时静脉内注射rAAV2/9-CMV-hGaa之恒河猴的 心脏和骨骼肌组织之间的载体基因组生物学分布谱的图。所有数据是载体施用后6个月时 的数据。
[0021] 图6A、图6B和图6C是示出了 6个月（图6A)、12个月（图6B)和> 21个月（图 6C)的对照和GAA+小鼠在基线和高二氧化碳（hypercapnia)下10分钟期间的分钟通气量 (minute ventilation) (mL/分钟）之结果的图。平均值土SEM ; * = GAA+与对照有差异， f =雄性与雌性有差异。
[0022] 图7A是示出了对照、GAA^和肌肉特异性GAA小鼠在基线下的分钟通气量以及对 高二氧化碳之平均响应的结果的图。肌肉特异性GAA小鼠被维持在GAA^背景下，但是仅 在骨骼肌中表达GAA。图7B是示出了 12个月大的对照、GAA^和肌肉特异性GAA小鼠隔膜 之隔膜收缩功能的结果的图。
[0023] 图8是示出了平均吸气流量（inspiratory flow)的图，提供了对神经驱动呼吸 的估计。6个月、12个月和21个月的对照和GAA^小鼠中的基线平均吸气流量。平均值 土SEM ; * =与对照不同；没有年龄或性别差异。
[0024] 图9A是这样的图，而且图9B是这样的组织染色，其示出了对于6个月、12个月和 > 21个月大的对照和GAA^小鼠的脊髓节段C 3-C5的糖原定量的结果（图9A)。膈运动神 经元群（phrenic motor pool)在颈部脊柱节段(：3-(：5中。用高碘酸希夫染色的组织学糖原 检测（图9B)。通过向隔膜施加逆行神经元示踪剂FIuoro-GokT.宋鉴定膈运动神经元 (箭头）。
[0025] 图IOA是示出了对照和GAA+小鼠在运动时间平均值的30秒峰振幅之结果的图。 PaCO2值类似。图IOB是示出来自机械通气的对照和具有类似PaCO 2值的GAA+小鼠的原始 膈神经纤维分布图（neurogram)(上图）和运动时间平均值（下图）之结果的神经纤维分 布图。两个图中的比率尺、放大器增益、过滤器设置和记录配置相同。
[0026] 图11是示出静脉内注射rAAV2/l导致受影响的隔膜组织中糖原清除的图。注 射后1年，将来自静脉内施用rAAV2/l-CMV-GAA的Gaa v_小鼠和未处理的年龄匹配的对照 Gaa^小鼠的隔膜组织固定并用高碘酸-希夫（PAS)通过标准方法染色（Richard Allen, Kalamazoo,MI)。使用Zeiss光学显微镜、Olympus相机和MagnaFire?.数字记录系统拍 照。放大率为X 400。
[0027] 图 12A、图 12B、图 12C 和图 12D 是一系列图，不出递送（systemic delivery) rAAV2/l-CMV-hGAA在处理后6个月时能够改善响应于高二氧化碳的通气。使用气压全身 体积描记术对经处理的Gaa+(η = 6)和年龄匹配的未处理Gaa+以及C57BL6/129SvJ (η = 10)的通气进行评估。* = P彡0. 05。
[0028] 图13A、图13B、图13C和图13D是一系列图，示出全身递送rAAV2/l-CMV-hGAA在 处理后12个月时改善了响应于高二氧化碳的通气。使用气压全身体积描记术对经处理的 Gaa+Oi = 12)和年龄匹配的未处理Gaa+以及C57BL6/129SvJ(n = 10)的通气进行评估。 女=p < 0. 05。
[0029] 图14A、图14B、图14C和图14D是一系列图，示出在AAV2/1处理小鼠中通气功能 显著改善。通气功能通过醒的、无束缚的全身气压体积描记术评估。图示出了 10分钟时段 内响应于高二氧化碳的分钟通气量。
[0030] 图15A、图15B、图15C和图1?是一系列图，示出在AAV2/1处理小鼠中通气功能 显著改善。图示出了在10分钟的时段内响应于高二氧化碳的峰吸气流量。
[0031] 图 16是Fuller膈脉冲串振幅-混合（Fuller Phrenic Burst Amplitude-Hybrid) 的示意图。以伏特测量的膈脉冲串振幅描述了随每次吸气的膈神经的量级。GAA动物中的 较低电压指示缺陷的膈运动神经元功能。该图示出了在向隔膜递送AAV-GAA后膈输出的恢 复。
[0032] 图17A、图17B、图17C、图17D、图17E、图17F和图17G是说明颈脊髓（C3-C 5)糖原 含量的膈运动神经元的图（图17A)和一系列照片（图17B-图17G)。对6、12和> 21个 月大的对照和Gaa+小鼠中脊髓的生物化学糖原定量（μ g糖原/mg湿重）（图17A)。* =Gaa+与对照差异，p <0· 01，卞=6个月与>21个月差异，P <〇· 01。相对于对照 (图17B)，在Gaa+小鼠颈脊髓（图17E)中，多运动神经元群表现出对糖原的阳性染色。用 Fluoro-Gold?标记对照（图17C)和Gaa+(图17F)小鼠中的膈运动神经元。Gaa+标 记的膈运动神经元表现出相对于对照膈运动神经元（图17D)对糖原更强的染色（图17G)。
[0033] 图18A和图18B是一对图，示出了分钟通气量的年龄依赖性下降。评估6、12、> 21个月的对照和GAA缺陷小鼠的Ve/VC0 2 (A)和分钟通气量（B)。与对照相比，GAA KO小鼠 的WVCO2和分钟通气量为正常值的1/2。
[0034] 图19A、图19B和图19C说明了响应于高二氧化碳的分钟通气量。6个月（图19A)、 12个月（图19B)和> 21个月（图19C)大的对照和Gaa+小鼠的60分钟基线（21% 02， 余下为N2)和10分钟响应于高二氧化碳（7% CO2，余下为O2)的分钟通气量。* =对照与 Gaa+有差异，p <0· 01。
[0035] 图20A和图20B是一对图，并且图20C是示出了肌肉特异性hGaa小鼠的一系列迹 线（tracing)。B6/129 (n = 3)、Gaa+(n = 3)和肌肉特异性hGaa小鼠 （η = 6)的力频率测 量（"force frequency measurement"）（图 2〇Α)。卞=与对照和肌肉特异性 hGaa 小鼠有差异。B6/129、Gaa^和肌肉特异性hGaa小鼠 （η = 8/组）的基线分钟通气量以及 对高二氧化碳的平均响应（图20Β)。*=与对照有差异，If =所有组彼此有差异。所有 值在P <0· 01时被认为是显著的。图20C中提供了平静呼吸（基线）和呼吸攻击（高二 氧化碳）期间来自未麻醉小鼠的代表性气流迹线。所有图中的比例相同。气流刻度为mL/ 秒。
[0036] 图21A是这样的图，并且图21B是这样的一系列迹线，其示出了膈吸气脉冲串振幅 (burst amplitude)。具有类似动脉PaCO2值的对照、Gaa+和肌肉特异性hGaa小鼠的30秒 平均膈吸气脉冲串振幅（在图中示出）。*=与对照差异，P <〇.〇1。示出了代表性对照、 Gaa+和MTP小鼠的原始膈振幅（上迹线）和校正、整合的迹线（下迹线）（每个图中的比 例尺相同）。
[0037] 图22是琼脂糖凝胶的照片，其示出在载体递送后分离自隔膜的基因组DNA包含对 照基因。
[0038] 图23是凝胶的照片，其示出分离自膈细胞核的基因组DNA。
[0039] 图24是示出在用AAV-CMV-GAA(2. 52X IOltl颗粒）注射后4周通气改善的图。
[0040] 图25示出了在直接向Gaav_动物中肌内注射AAV2/9-GAA的基因组拷贝后，胫骨前 肌（TA)和腰脊髓（lumbar spinal cord)中载体基因组的拷贝。简言之，Gaa+动物在胚骨 前肌肌肉中接受AAV2/9-DES-GAA或AAV2/9-CMV-GAA载体的单次注射。注射后28天，评估 胫骨前肌和腰脊髓中的载体基因组拷贝。两种构建体均证明骨骼肌有效转导并逆行运输治 疗性转基因。图26示出了在胫骨前肌中单次注射AAV2/9-hGAA之后庞皮病动物中的载体 基因组拷贝和GAA酶活性。示出了注射后1个月时胫骨前肌（A)和（B)腰脊髓中的Vg拷 贝。PCR数据表明脊髓中AAV载体的充分逆行转导。（C)注射部位（TA)的GAA活性水平， 导致Gaa-/-小鼠中的酶促水平显著提高。
[0041] 图27示出了在胫骨前肌中单次注射AAV2/9-DES-hGAA之后神经肌肉接点（NMJ) 的染色。NMJ的免疫染色表明rAAV2/9介导的hGAA递送导致庞皮病的病理逆转，以及经处 理Gaa+动物中的NMJ恢复。
[0042] 图28示出了在小鼠 C3-C5区直接脊柱内注射AAV报道构建体之后，膈运动神经 元群的转导。（A)固定的完整脑和脊髓制备物中注射部位的AAV报道构建体的阳性检测 (* )。（B)AAV-GFP的截面表面荧光检测证明了膈运动群的转导。
[0043] 图29示出了在小鼠 C3-C5区直接脊柱内注射AAV-GAA之后，膈运动神经元群中 GAA蛋白表达的免疫组织化学检测。在（A)低放大率和（B)更高放大率下示出了膈运动神 经元群中AAV-GAA的检测。深褐色染色对于GAA蛋白检测呈阳性。
[0044] 图30示出了小鼠中胸内注射红外染料。图像指示了整个隔膜表面染料的阳性检 测。
[0045] 图31示出了胸内注射AAV载体之后，高二氧化碳条件下的隔膜和膈运动神经元活 性。与AAV2/9-CMV-GAA和AAV2/9-DES-GAA处理的动物相比，未处理的Gaa+动物表现出 弱的钝性EMG(隔膜）和脉冲串振幅（膈神经）。
[0046] 图32示出颈和胸脊髓中AAV报道基因的检测。抗GFP免疫组织化学染色检测了 阳性膈（左）和肋（右）运动神经元染色，证明胸内施用AAV2/9导致逆行转导。
[0047] 图33示出向Gaa+动物胸内施用rAAV2/9-CMV-GAA或rAAV2/9-DES-GAA载体之 后，隔膜EMG(A)、AAV基因组载体的拷贝（B)和改善的膈神经信号传播（C)。
[0048] 图34示出了静脉内施用AAV2/9-CMV-GAA或AAV2/9-DES-GAA载体之后，Gaa+动 物中病理症状的校正。（A)示出了注射后三个月时的射血分数（ejection fraction)。 AAV-DES处理的动物表现出射血分数的显著提高。平均值和sem(η = 6)。（B)示出了在注 射后一个月和三个月时，所有的处理均导致体重显著增加。（C)示出了处理后一个月和三 个月时的PR间隔。（D)示出了静脉内注射后心脏功能的改善。（E)示出了静脉内施