能够快速而极为准确地测定生物大分子的分子量， 从而能够快速的鉴定分析物质。图1谱中存在m/z 977. 69[M+H]+，m/z 999. 99[M+Na]+，上 述两峰作为物质分子量的判定标准，证明其分子量为996. 69,与有关资料中描述的相一致。 说明，此二次富集物含有环E这种物质。此外，通过总离子流（图2)中出现的其他的谱峰， 根据其MS图谱，推测总离子中的其他谱峰是亚麻籽油中环肽类系列物质或是一些多肽的 碎片。
[0027] 将本实施例得到的粗提物及纯化物通过肿瘤细胞增殖实验验证。
[0028] 1、细胞株及培养条件
[0029] 本次针对亚麻籽油中提取物的体外癌症细胞系为肝癌细胞IfepG2、体外卵巢癌细 胞H08910pm、S180肿瘤细胞、Lewis肺肉瘤细胞等四种常规癌细胞种类。用含有10%胎牛 血清、lOOU/m青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液，于37°C、5% CO2饱和湿度的培养箱中 传代培养，取对数生长期细胞进行实验。
[0030] 2、体外癌细胞增殖实验
[0031] MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞 线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan) 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免 疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规 模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经 济性强。
[0032] 取对数期生长的细胞，以每孔5 X IO3接种于96孔培养板，培养板分组，每组设3个 复孔。
[0033] 第1组仅加入细胞培养液，作为空白对照组；
[0034] 第2组加入细胞培养液和细胞悬液，放置于37°C、5% CO2条件下培养24小时，作 为不加样品药物的细胞对照组；
[0035] 第3组加入细胞培养液和细胞悬液，放置于37°C、5 % CO2条件下培养24小时后，加 入不同浓度的样品作用液，作为药物组；药物组终浓度分别为25 μ g/mL、50 μ g/mL、75 μ g/ mL、100 μ g/mL〇
[0036] 各组继续培养48h后，每孔加入5mg/mL的MTT 20 μ L，作用4h后，1500rpm离心 8min，去上清，每孔加入DMSO 150 μ L，震荡10分钟，使甲瓒彻底溶解，492nm测光吸收，计算 不同浓度和作用时间的样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。
[0037]
【主权项】
1. 一种从亚麻籽油中获得抗肿瘤活性成分物质的提取纯化方法，包括以下步骤： (1) 萃取：将乙醇溶液与亚麻籽油置于混合仪中混合，调节pH，搅拌，静置待分层界面 形成后，旋转浓缩，形成浸膏； (2) 亚临界水提取：将步骤（1)的浸膏放置于提取罐中，加入亚临界水，将得到的提取 液旋转浓缩，真空冷冻干燥得到粗提物； (3) 高速逆流色谱纯化：称取步骤（2)得到的粗提物，利用高速逆流色谱纯化溶剂系 统，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置lh，分相平 衡后分出上相和下相；以溶剂系统的下相为固定相，上相为流动相，调整转速，泵入流动相， 减压回收试剂，得到纯化提取物。
2. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（1)中所述的乙醇溶液和亚 麻籽油的体积比为（1~5) : 1，所述乙醇溶液的体积浓度为90~100%。
3. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（1)中调节pH为4. 5~6， 揽拌0? 5~lh。
4. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（2)中所述浸膏和亚临界水 的重量比为1:(10~50)。
5. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（2)中所述冷冻温度 为-20 ~-40。。。
6. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（2)中所述的旋转浓缩是指 在52~68°C条件下旋出提取液3/5~4/5的液体。
7. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（2)中所述的提取罐中提取 温度为50~120°C，提取压力为3~5MPa，提取时间为10~40min，加压1~3次。
8. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（3)中所述正己烷、乙酸乙 酯、甲醇和水的体积比为（1~3) : (2~4) : (3~5) : (1~3)。
9. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤（3)中所述的转速为600~ 800rpm，泵入流动相的流速为2~4ml/min。
10. 权利要求1-9任一权利要求所述提取纯化方法在亚麻籽油加工领域的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种从亚麻籽油中获得抗肿瘤活性成分物质的提取纯化方法，步骤如下：(1)将乙醇溶液与亚麻籽油置于混合仪中混合，调节pH，搅拌，静置待分层界面形成后，旋转浓缩，形成浸膏；(2)将步骤(1)的浸膏放置于提取罐中，加入亚临界水，将得到的提取液旋转浓缩，真空冷冻干燥得到粗提物；(3)称取步骤(2)得到的粗提物，利用高速逆流色谱纯化溶剂系统，得到纯化提取物。本发明在提取纯化过程中，采用了可用于食品生产的溶剂，符合国家相关的法规规定，避免大量的有机溶剂使用造成的残留风险。将上述方法得到的提取物通过肿瘤细胞增殖实验验证，均具有抑制肿瘤细胞生长的细胞学功效，可用于辅助抑制肿瘤保健食品方面的应用。
【IPC分类】A61P35-00, A61K36-55, A61K131-00
【公开号】CN104815001
【申请号】CN201510178126
【发明人】杨长军, 于建伟, 王桐, 石丽花, 衣洁菡
【申请人】烟台新时代健康产业有限公司
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月15日