vated) MIF，在这里作为阴性对 照，图2中左边第一列柱状图表示没有添加MIF时，RAW264. 7巨噬细胞的趋化迀移程度； 第二列表示添加了热灭活的MIF时巨噬细胞的趋化迀移程度；第三列表示添加MIF之后引 起巨噬细胞明显的趋化迀移；第四列表示添加阳性对照化合物IS0-1之后可以显著抑制 MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移；第五列表示添加化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基）硫 脲基）_4_甲氧基苯甲酸时，同样可以明显抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移。〈 0. 05,（#) /?〈 0. 01表示与单独用MIF处理时做的比较。
[0025] 实施例3:细胞敏感性实验。
[0026] 实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定 490nm处的光密度0D值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对培养细胞的杀伤效果。
[0027] 实验步骤：细胞活性通过MTT实验进行测定，BV-2小神经胶质细胞、THP-1细 胞或者RAW264. 7巨噬细胞接种于一式三份的密度为5X 104的细胞/板中，将细胞在 glycocalyixns和LPS中处理24小时，MTT添加到每个板中并且在37°C下培养4小时，在 培养基废弃之后，将DMS0添加到溶解的甲瓒染料中，在540nm下测试光学密度，所有的实验 结果采用M±S. D.表示，所有数据采用SPSS程序(版本14. 0)进行单向方差分析和Student Newman Keul' s分析，p < 0. 01认为具有统计显著性。
[0028] 实验结果：图3中左边第一列表示没有添加任何其他物质时，细胞的活性；第二列 表示添加脂多糖LPS后细胞的活性；第三列表示同时添加LPS和DEX之后细胞的活性，DEX (Dexamethasone)是上市的抗炎药地塞米松，在这里作为对照；第四列表示添加完LPS、DEX 和MIF之后细胞的活性；第五列表示添加完LPS、DEX、MIF和IS0-1之后细胞的活性；第六 列表示添加完LPS、DEX、MIF和化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基）硫脲基）-4-甲氧基苯甲 酸之后细胞的活性。总的来说，化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基）硫脲基）-4_甲氧基苯 甲酸对BV-2小神经胶质细胞、THP-1细胞和RAW264. 7巨噬细胞均没有明显毒性。
[0029] 实施例4 :化合物对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影响实验。
[0030] 实验原理：MIF分子与抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性， 也不影响MIF的生物学活性。此种MIF标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生 特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在MIF作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变 成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反 应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
[0031] 实验步骤：将96孔板用鼠抗大鼠TNF-a抗体包被，并使用250 y 1含有1%牛血清 蛋白、5%蔗糖及0. 05%似队的PBS阻断抗体的非特异性结合位点，在4°C孵育16小时。然 后用洗涤液洗涤平板3次，加入大鼠TNF-a标准血清及测试血清样本，孵育2小时后进行 检测。检测抗体为生物素标记的大鼠TNF-a抗体。通过次级反应物链霉亲和素-辣根过 氧化物酶，与四甲基联苯胺反应显色。
[0032] 实验结果：图4a和4b中第一列表示，没有添加其他物质时NO和TNF-a的含量； 第二列表示添加脂多糖LPS之后可以显著诱导NO和TNF-a的释放；第三列表示添加抗炎 药地塞米松（DEX)之后可以抑制LPS诱导的炎性因子NO和TNF-a的释放；第四列表示添 加MIF之后又可以促进炎性因子NO和TNF- a的释放；第五列表示添加MIF的典型抑制剂 IS0-1之后可以在一定程度上抑制炎性因子NO和TNF-a的释放；第六列表示添加化合物 3-(3-(苯并呋喃-2-羰基）硫脲基）-4_甲氧基苯甲酸可以有效抑制LPS和MIF引起的炎 性因子NO和TNF- a的释放，而且相比DEX和IS0-1具有更好的抑制效果。
[0033] 实施例5 :化合物对MIF刺激的RAW264. 7巨噬细胞中ERK活化的影响实验。
[0034] 实验原理：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)，"探针"是抗体，"显色"用标记的二 抗。经过分离的蛋白质样品转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价 键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的 蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体进行免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体进 行反应，经过底物显色或放射自显影来检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
[0035] 实验步骤：将BV-2小胶质细胞以2. OX 105密度接种于6孔板中，在37°C培养24 小时后用于实验。加药处理16小时后弃去培养基，用4°C的PBS清洗2次，再向每孔中加入 lmL PBS，将细胞吹下收集到离心管中，离心5分钟，弃去上清。加入细胞裂解液，震荡混匀 反应10分钟，再离心15分钟，收集上清液到离心管中。采用BCA法测定每个样品中蛋白质 的含量，并通过western blot方法对蛋白质进行定性定量分析。
[0036] 实验结果：采用western blot方法检测了 RAW264. 7细胞胞浆中ERK1/2的蛋白 质表达变化，以a -球管蛋白作为内参，发现该化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化(如图5所 示)。
【主权项】
1. 3-(3-(苯并呋喃-2-羰基）硫脲基）-4-甲氧基苯甲酸或其可药用盐在制备用于治 疗与MIF相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述3-(3-(苯并呋喃-2-羰基）硫脲 基）-4-甲氧基苯甲酸的结构式如下：2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述可药用盐为3-(3-(苯并呋喃-2-羰 基）硫脲基）-4_甲氧基苯甲酸与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、磷酸和硫酸。4. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述有机酸选自醋酸、马来酸、枸橼酸、苯 磺酸、甲基苯磺酸、富马酸和酒石酸。5. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与MIF相关的炎症性疾病选自类风湿 性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。6. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的 药物为MIF抑制剂。
【专利摘要】本发明公开了3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸的新用途。具体而言，本发明中的3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸具备MIF抑制剂的功能，可以显著抑制LPS诱导的炎性因子（TNF-α和NO）的释放，抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移，还可以抑制ERK1/2的磷酸化，可以用于制备与MIF相关的抗炎药物。
【IPC分类】C07D307/85, A61K31/343, A61P7/00, A61P19/02, A61P9/10, A61P31/04, A61P29/00
【公开号】CN104958289
【申请号】CN201510375280
【发明人】侯廷军, 镇学初, 许磊, 张瑜, 郑龙太
【申请人】苏州大学张家港工业技术研究院
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月30日