一种血小板抑制剂及其在制备抗血小板疾病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体涉及一种血小板抑制剂及其在制备抗血小板疾病 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来心脑血管疾病对人类健康已造成严重威胁，据WHO统计全球每年平均 1700万人死于心、脑血管疾病，约占全球总死亡人数的1/3。我国心脑血管疾病亦呈增长趋 势，据估计每年新发脑卒中者200万人、心肌梗死者50万人；每年死于心脑血管病者达250 万人，其中心血管病与脑血管病各占一半。心脑血管疾病以血栓栓塞最为多见，血管内膜损 伤、血流减慢、血液凝固性升高均会引起血栓形成，血小板的活化、聚集在血栓的形成过程 中发挥着重要作用，因而为了针对由血小板活化、聚集引发的血小板疾病，开发安全有效的 抗血小板药物已成为当务之急。
[0003] 目前临床上使用的抗血小板药物主要有环氧化酶-1抑制剂（阿司匹林）、ADP P2Y12受体抑制剂（氯吡格雷）、磷酸二酯酶PDE抑制剂(西洛他唑)、糖蛋白GP II b / III a受 体拮抗剂（阿昔单抗）4大类。由于阿司匹林、氯吡格雷、西洛他唑等只能分别抑制由TXA2、 ADP或cAMP介导的血小板激活，因此部分患者仍不能避免血栓性事件的发生；GP II b / Ilia 受体拮抗剂虽然能阻断血小板聚集的最终通路，但同时也阻碍了生理性止血的过程而可能 导致出血并发症。因此，寻找新的靶标并开发新的抗血小板药物具有重要的临床意义和广 阔的应用前景。
[0004] 目前发现一些小分子化合物可以抑制血小板活化，比如AG490能抑制胶原诱导的 血小板的聚集和Ca2+的动员，并抑制血小板中PLC Y 2, PKC，AKT等的磷酸化；WHI-P131能阻 止凝血酶诱导的血小板伪足形成、颗粒释放和血小板聚集的功能。
[0005] 虽然现有技术合成的的小分子化合物作为血小板抑制剂可以抑制血小板的活性， 但是理想的血小板抑制剂除了能够抑制血小板的生成、活化和聚集，阻断血栓的形成外，对 生理条件下血小板的功能没有影响。因此需要研宄一种新的血小板抑制剂，能够对血小板 活性、聚集有明显抑制作用，从而开发出新的有效的抗血小板药物。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明目的是提供一种化合物作为血小板抑制剂的应用，所述化合物具有 能够抑制血小板活化、聚集，抑制血栓形成，同时毒性较低，对生理条件下血小板的功能没 有影响，可以开发成为新型抗血小板疾病药物。
[0007] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：式I的化合物在制备血小板抑 制剂中的应用 式I。
[0008] 本发明公开的作为血小板小分子抑制剂的化合物的化学名称为 2- [2- (3-氯-4-氟苯）亚联氨基]-3- (4-氯苯基）-3-氧丙腈，称为KIF。
[0009] 本发明同时保护上述化合物KIF在制备抗血小板疾病药物中的应用。主要用于血 小板栓塞性疾病，包括动脉血小板栓塞性疾病或静脉血小板栓塞性疾病；比如冠状动脉硬 化性疾病、心肌梗死、肺梗死或者脑梗死。
[0010] 本发明还公开了一种血小板抑制剂，由有效量的化合书
和药学上可接受的辅料组成。
[0011] 上述技术方案中，药学上可接受的辅料选自维生素C、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果 糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁、蔗糖。
[0012] 本发明所述化合物KIF可以单独或与一种以上可接受的载体辅料组合剂制成制 剂给药。例如，溶剂、稀释剂等。可以口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等； 也可以注射型给药，如冻干粉针剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟 知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05%~90%重量活性 成分，更常见约15%~60%之间的活性成分。本发明化合物剂量可以使0. 005~5000 mg/ kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
[0013] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点： 本发明公开了化合物KIF的新用途，该化合物KIF对血小板毒性低，对生理条件下血小 板的功能没有影响，并能够有效抑制多种致聚剂诱导的血小板活化和聚集，显著抑制血栓 形成，从而有望将其开发成新的抗血小板疾病药物。
【附图说明】
[0014] 图1为KIF浓度梯度孵育的血小板用致聚剂刺激后所得的聚集曲线图； 图2为用AlamarBlue assay分析法测定KIF不同浓度对血小板毒性的柱状图； 图3为用Annexin V-FITC法检测KIF浓度梯度处理的血小板凋亡的流式图； 图4为KIF影响凝血酶诱导血小板活化情况的流式图； 图5为KIF对的血小板铺展的影响图； 图6为PRP经凝血酶刺激后血小板凝块回缩情况图； 图7为KIF对小鼠尾静脉出血时间影响的统计图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明作进一步描述： 实施例一 KIF抑制血小板聚集 洗涤人血小板（3*108/ml)用浓度梯度的KIF 37°C孵育（1.25、2. 5和5yM)或二 甲基亚砜（DMS0) 10分钟，然后用致聚剂胶原（Collagen) 2 μg/ml和凝血酶（Thrombin) 0. 02u/ml刺激，用血小板聚集仪记录聚集曲线。附图1为KIF浓度梯度孵育的血小板用致 聚剂刺激后所得的聚集曲线，表明KIF可以抑制多种致聚剂引起的血小板聚集。
[0016] 实施例二KIF药物安全性研宄 血小板重悬液（2. 5*108/mL )用KIF (5、10、20 yM)，37°C孵育，10分钟，然后各组均用 AlamarBlue试剂10 y 1 (1:10) 37°C孵育4h，酶标仪570nm、585nm波长下监测荧光强度来 观察血小板是否存活。附图2为用AlamarBlue assay分析法测定KIF不同浓度对血小板 毒性的柱状图，观察到KIF基本对血小板没有毒性。
[0017] 血小板悬浮液（2X107/mL ) 100y 1，用 KIF 5、10、20yM 37°C孵育 10 分钟，加 入结合缓冲液（Binding Buffer) 100 y l，Annexin V-FITC 1 y 1处理，室温暗室放置15分 钟，立即进行流式细胞术定量检测Annexin V阳性的细胞所占的比例。附图3为KIF浓度 梯度处理的血小板，用Annexin V-FITC法检测血小板凋亡的流式图。观察到KIF在5和 10 y M时基本没有导致血小板凋亡，在20 y M时使血小板少量凋亡。各个象限内的数值为血 小板的相对百分数。
[0018] 实施例三KIF抑制血小板的"内-外"信号通路 血小板（2. 0X107/mL ) 200 yl用KIF 5yM 37 °C预处理10分钟，然后用凝血酶 (Thrombin) 0? 05u 处理，同时加入 PE-CD62P、FITC-Fibrinogen 抗体 1 y 1，暗室室温静置 30分钟，再加入PBS 200 yl重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。附图4为KIF影响凝血酶 (Thrombin)诱导血小板活化情况的流式图，观察到用KIF孵育的血小板活化率低，表明KIF 明显抑制血小板"内-外"信号通路。
[0019] 实施例四KIF抑制血小板"外-内"信号通路 将纤维蛋白原（Fibrinogen)溶于0. 1M的NaHC03 (PH 8. 3)溶液，终浓度10 y g/ml， 200 yl/孔浸泡12mm圆玻璃片于24孔板内，4°C过夜，然后用PBS洗涤；血小板重悬液 (2. 5*106/ml) 200 y 1/孔，用KIF 37°C孵育30分钟，接着将血小板重悬液铺展在玻璃板上 37°C 60分钟，之后用PBS洗5次，粘附的血小板用4%的多聚甲醛固定30分钟，再用PBS洗 一次，最后用 TRITC 标签的 Phalloidin(终浓度 0? 1 y g/ml)加入 100% TritonX-100 (终 浓度0. l%)，Phalloidin 200 y 1/孔，室温避光孵育2h，将圆玻璃片取出倒放到载玻片上 用荧光显微镜观察血小板的铺展情况。附图5为KIF对的血小板铺展的影响。观察到KIF 1. 25 y M可以抑制50%血小板铺展，5 y M是时可以抑制80%血小板的铺展。表明KIF 5 y M 可以明显抑制血小板"外-内"信号通路的活化。
[0020] 实施例五KIF抑制血栓凝块的回缩 取250 yl富血小板血浆PRP(2. 0*108/ml)加入到比色杯中，用KIF 5yl 37°C孵育10 分钟，加入致聚剂凝血酶（Thrombin) 0. 8u 37°C，用影像技术观察10、15、20、30分钟血小 板凝块回缩情况。附图6为用和不用KIF孵育的PRP经凝血酶（Thrombin)刺激后血小板 凝块回缩情况图，结果显示KIF 5 yM可以明显抑制血小板凝块的回缩反应。表明KIF可在 血小板血栓形成的后期影响稳固血栓的形成，从而避免血小板栓塞性疾病的发生。
[0021] KIF或二甲基亚砜（DMS0)腹腔注入小鼠体内，45分钟后用4%水合氯醛 150-200 y 1麻醉小鼠，并放到温暖的环境中（37°C )，尾巴突出，剪去末梢的5 mm，立即放到 12 ml 37°C生理盐水中10分钟，记录止血时间。附图7为KIF对小鼠尾静脉出血时间影 响的统计图，观察到KIF并没有明显增加小鼠尾静脉出血时间。表明KIF对生理性止血功 能没有明显影响，较其他抗血小板药物风险小，有良好的临床应用前景。
[0022] 综上，可以说明KIF小分子可以抑制血小板活性与集聚性能，更有效的抑制血栓 的形成，同时对血小板正常生理活性没有影响，出血风险小；从而可以制备成抗血小板疾 病，比如冠状动脉硬化性疾病、心肌梗死、肺梗死或者脑梗死的药物，有良好的临床应用前 景。
【主权项】
1. 式I的化合物在制备血小板抑制剂中的应用；式I。2. 式I的化合物在制备抗血小板疾病的药物中的应用式I。3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述血小板疾病为血小板栓塞性疾病。4. 根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述血小板疾病为动脉血小板栓塞性疾病 或静脉血小板栓塞性疾病。5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述血小板疾病为冠状动脉硬化性疾病、心 肌梗死、肺梗死或者脑梗死。学上可接受的辅料组成。7. 根据权利要求6所述血小板抑制剂，其特征在于：所述药学上可接受的辅料选自维 生素C、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁、蔗糖。8. 根据权利要求6所述血小板抑制剂，其特征在于：血小板抑制剂为注射制剂或口服 制剂。9. 根据权利要求8所述血小板抑制剂，其特征在于：所述注射制剂为冻干粉针剂。10. 根据权利要求8所述血小板抑制剂，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂或 颗粒剂。
【专利摘要】本发明属于药物技术领域，具体涉及一种血小板抑制剂及其在制备抗血小板疾病药物中的应用；本发公开的KIF可以抑制多种致聚剂诱导的血小板的活化、聚集，更有效地抑制血栓的形成，并且不影响生理性止血过程，出血风险小，从而表现出对血栓性心脑血管疾病的预防和治疗作用。
【IPC分类】A61P9/10, A61P7/02, A61K31/275
【公开号】CN104958288
【申请号】CN201510360965
【发明人】曹碧茵, 郝亚南, 孔岩, 徐耑, 毛新良
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月26日