任何缓冲剂，或者根据需 要与推进剂（propellant)混合。软膏剂、糊剂、乳膏和凝胶除了含有活性成分之外，可以 含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、赌、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅 酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或它们的混合物。粉末剂和喷雾剂除了含有活性成分之外， 可以含有赋形剂例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混 合物。喷雾剂还可任选含有常用的推进剂例如氯氟烃以及可挥发的未取代的烃（例如丁烷 和丙烷）。经皮贴片具有附加的优点，即提供本发明化合物到身体的可控递送。这样的剂型 可以通过将一种或多种的本发明化合物溶解、分散或以其它方式混合到合适的介质中来制 备，所述介质例如弹性体基体材料。吸收促进剂也可以用于增加化合物跨皮肤的流动。这 样的流动的速率可以通过提供速度可控膜或将化合物分散到聚合物基体或凝胶中来控制。 浸渍有药物的固体载体（例如，敷料（dressing))也可以用于局部给药。
[0141] 药物制剂包括适于通过吸入或鼻吸入法或用于鼻部给药的那些药物制剂。对于通 过吸入法给药到上（鼻部）或下呼吸道，通常由吸入器、喷雾器或加压包装（pressurized pack)或递送喷雾剂的其它方便装置来递送本发明的化合物。加压包装可以包括合适的推 进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压 气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供用来递送计量量的阀来确定。
[0142] 或者，对于通过吸入法或鼻吸入法给药，组合物可以采取干燥粉末的形式，例如一 种或多种本发明化合物以及合适的粉末基底的粉末混合物，所述粉末基底例如乳糖或淀 粉。粉末组合物可以以在例如胶囊或药筒，或者在例如明胶或泡罩包装（blister pack)中 的单位剂量形式呈现，在气雾吸入器、吹入器或定量喷雾器的帮助下可以从上述单元中给 药粉末。
[0143] 对于鼻内给药，可以借助于鼻滴剂或液体喷雾剂，例如借助于塑料瓶喷雾器或定 量喷雾器给药本发明化合物。液体喷雾剂通常由加压包装递送。喷雾器的典型例子为 Mistometer(Wintrop)和 Medihaler(Riker)〇
[0144] 可以利用含水或不含水的基底制备鼻滴剂，所述含水或不含水的基底还含有一种 或多种分散剂、增溶剂或助悬剂。可以借助于简单的眼部带盖的点滴瓶或借助于适合用于 滴加地递送液体成分（借助于特殊形状的闭合物）的塑料瓶来递送滴剂。
[0145] 适合用于肠胃外给药的本发明药物组合物包括一种或多种本发明的化合物和一 种或多种药学上可接受的无菌等渗含水或不含水溶液、分散液、悬浮液或乳剂、或可以在 即将使用前重新形成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、 使制剂与待受试者血液等渗的溶质，或助悬剂或增稠剂。此外，可以使用药物包覆的支架 (stent)〇
[0146] 可以用于本发明药物组合物的合适的含水和不含水的载体的例子包括水、乙醇、 多元醇（例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等）、以及它们的适当的混合物、植物油（例如橄榄 油）、以及可注射的有机酯（例如油酸乙酯）。通过使用包覆材料（例如卵磷脂），在分散液 的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。
[0147] 这些组合物还可以含有辅助剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。在组合物中还期望 包含等渗试剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸 收的试剂来实现，所述试剂例如单硬脂酸铝和明胶。
[0148] 在一些情况中，为了延长药物的效果，期望可以使药物从皮下或肌内注射中的吸 收变慢。这可以通过使用晶体或具有较差水溶性的无定形材料的液体悬浮液来实现。药物 吸收的速率取决于其溶解的速率，反之，其溶解的速率可能取决于晶体的大小和晶型。或 者，肠胃外给药药物的延迟吸收可以通过在油媒介物中溶解或悬浮该药物来实现。
[0149] 可注射的缓释形式可以通过在可生物降解的聚合物（例如聚乳酸_聚羟基乙酸） 中形成所述药物的微胶囊型基体来制备。根据药物和聚合物的比例，使用的具体的聚合物 的性质，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚原酸酯和聚酸 酐。缓释注射制剂也可以通过使药物包封到与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。 可以对注射材料进行灭菌，例如利用细菌滤器来过滤。
[0150] 可以将制剂放置在单位剂量或多剂量经密封的容器例如安瓿和药水瓶中，以及可 以在冻干的条件下保存并且仅需要在即将使用前，添加灭菌的液体载体，例如用于注射的 水。临时的注射溶液以及悬浮液可以由上述无菌粉末、颗粒剂和片剂类型来制备。
[0151] 可以单独提供达那唑化合物以治疗涉及血管通透性过高或细胞骨架的功能障碍 的疾病或病症。或者，达那唑化合物可以与一种或多种其它适合用于治疗上述疾病或病症 的治疗或药物结合提供。例如，可以在其它治疗或药物之前，结合其它治疗或药物（包括同 时），或者在其它治疗或药物之后给药该达那唑化合物。在使用另外药物的情况下，该药物 和达那唑化合物可以以单独的药物组合物的形式给药或作为相同的药物组合物的部分给 药。合适的药物例如描述在美国申请号12/820,325中，将其全部内容在此引用作为参考。
[0152] 如一些实施例所表明的，发明人已经确定，当达那唑以口服方式给药至患有糖尿 病性黄斑水肿（DME)的患者时，其会导致中心凹视网膜厚度（central subfield retinal thickness)的降低，其通过光学相干断层扫描（OCT)测量。此外，将人内皮细胞用达那唑进 行处理的体外临床前研宄已经证明了通过血管通透性的相应下降能增强内皮屏障作用。不 同于靶向VEGF的药物的眼内注射，达那唑是口服给药的且具有行之有效的安全性。
[0153] 还使用了人的视网膜、脐带、脑和肾微血管组织来研宄达那唑对血管通透性的影 响。这些发现表明，达那唑对血管通透性存在双相剂量响应（图1)。在transwell系统中 对辣根过氧化物酶（HRP)到单层人内皮细胞的转移进行追踪，显示在100-至500-纳摩尔 浓度，达那唑减少了跨细胞通道。然而，增加该浓度逆转了达那唑的有益效果且导致细胞旁 通透性增加。达那唑的有益效果还出现的非常迅速。在暴露于达那唑提高屏障的浓度的几 分钟内，内皮细胞表现出f_丝状肌动蛋白皮质环的形成且提升了内皮屏障功能，其通过鬼 笔毒环肽染色和跨表皮电阻（TEER)模型证明（图2和3)。此外，在这些浓度下的达那唑抵 消了由于促炎分子（例如TNF-a或凝血酶）的刺激形成的张力纤维（图3)。
[0154] 通过考虑下述非限制性实施例，本发明另外的主题、优点和新特征对于本领域技 术人员来说是显然的。 实施例
[0155] 实施例1:
[0156] 本实施例证明，向患有糖尿病性黄斑水肿（DME)的患者口服给药达那唑是安全 的，没有表现出严重的不良事件。达那唑可以BMI剂量调整的方式降低DME并趋于改善视 敏度。如图1和2所示，达那唑可对内皮细胞具有双相作用。在低剂量时，达那唑降低血管 渗漏，而在高浓度下观察到血管通透性的增加。这个双相作用是由在下述不同BMI的体内 达那唑的有效性支持的。
[0157] 为了评估达那唑对DME的安全性和有效性，在加拿大St. Michael医院进行了 12 周的随机安慰剂对照的双盲研宄。研宄包括患有DME且中央子域（central subfield)视 网膜厚度为300 ym或更厚的患者。共34例患者组成该安全性设定群体。有效性评估人群 (n = 23)由安全性设定中的患者组成，他们在4周的治疗中完成了 80%或更高的研宄药 物。从基线到12周的治疗，中央子域视网膜厚度的变化是主要终点，而次要终点是指，从基 线到12周的治疗，在视网膜体积和糖尿病性视网膜病早期治疗研宄（ETDRS)中最佳矫正视 力（BCVA)的变化。研宄的3个达那挫剂量为10mg(5mg，每日两次）、30mg(15mg，每日两次） 和90mg (45mg，每日两次）。所有的治疗均为口服给药，每日两次。
[0158] 第一个显著的发现是，达那唑对视网膜厚度的影响依赖于基线体质指数（BMI ;P =.01)。在低BMI值时，低达那唑剂量有效地降低视网膜厚度，而在高BMI值时，高剂量更 为有效（图4)。如以前所确定的，视网膜厚度降低大于11%被认为是临床显著的。在12 周中，相比于安慰剂组的29% (7名患者中的2名），几乎所有接受了 15-mg剂量的受试者 (86%，7名患者中的6名）的视网膜厚度均显著减低。相比于安慰剂（P = . 05)，15-mg组 的视网膜体积也有所降低。
[0159] 对于I⑶-9-CM视力减退上的BCVA变化，使用该治疗使得36%的受试者改善了至 少一个方面。安慰剂组的受试者改善比例最小（14%)，而用达那唑治疗的所有受试者中的 47 %改善了至少一个方面。
[0160] 在基线或第12周，在任意组中均未检测到眼高血压，并报道无所研宄药物相关的 严重不良反应。发生了三种治疗相关的不良反应（外周性水肿、银肩病和恶化抑郁症），它 们全部被认为可能与活性化合物有关。
[0161] 相比于安慰剂组7名患者中的2名，接受30mg达那唑的几乎全部患者在12周的 治疗后均看到了 OCT的临床相关变化（6/7)。在治疗组的访问4(第12周）时，根据ETDRS 线（5个字母），存在至少一个BCVA的清晰度的改善趋势。这种趋势可能会在视网膜体积的 变化上更容易观察到，因为视敏度与体积变化的相关程度远比与视网膜厚度变化要高。还 观察到，达那唑的疗效是BMI依赖性的，即，30mg达那唑剂量对视网膜厚度的影响随着基线 BMI增加变得更加显著（即，降低越多的视网膜厚度），而10mg剂量对视网膜厚度的影响随 着基线BMI增加变得更不显著。这与它的亲脂性有关。还观察到，治疗对视网膜厚度变化 的影响依赖于基线视网膜厚度。对于所有随机患者的基线视网膜厚度的中位数为400 ym。 用达那唑治疗基线视网膜厚度>400 ym的患者比治疗基线视网膜厚度< 400 ym的患者表 现出更高的治疗效果。这种相互作用在BCVA中未观察到。
[0162] 实施例2:
[0163] 这个例子证明了向患DME的患者口服给药两种不同剂量的达那唑的有效性和安 全性。
[0164] 进行随机、安慰剂对照、平行、双盲研宄来证明两种剂量（0. 5mg/BMI/天和1. Omg/ BMI/天）的达那唑对患有DME的成人患者的有效性和安全性。450名随机患者代表该样品 大小。有效性可通过与安慰剂（乳糖和硬脂酸镁）比较所提高的视敏度（VA)来确定。此 外，这两种口服BMI相关剂量的达那唑的有效性和耐受性通过与安慰剂（乳糖和硬脂酸镁） 相比腹侧黄斑厚度变化（CMT)和VA响应状态进行监测。
[0165] -旦患者符合研宄入选标准并获得了书面的知情同意书，则计算患者的BMI和腰 /臀比。这两种剂量的口服达那唑（或安慰剂）在患有DME的成人患者中给予12周的时 间，然后进行4周的清除以确定疗效减退。清除过程后，提供患者12周的开放标签扩展研 宄以评估达那唑最佳剂量效果的持续时间。在最初的12周的主要研宄中，一旦有30%的受 试者完成了 4周的治疗，那么可确定达那唑的最佳剂量。收集血浆达那唑水平并始终进行 监控。
[0166] 剂量、给药方式和给药：达那唑以口服剂量给药，lmg/BMI或0. 5mg/BMI，分成2个 每日剂量。达那唑和相应的安慰剂每日给药两次，持续12周，如早晨给药一次，一次两粒胶 囊以及晚上给药一次，一次两粒胶囊，空腹服用，即，饭前1小时或饭后2小时。在主体12 周的研宄过程中，达那唑的总的每日剂量为0. 5mg/BMI/天和lmg/BMI/天。在开放标签扩 展研宄中，可将间断分析所确定的达那唑的最佳剂量（如下所讨论）每日给药两次，持续12 周。
[0167] 口服给药安慰剂（乳糖和硬脂酸镁）并分成两个日剂量。
[0168] 常规糖尿病治疗药物可与达那唑一同给药。该药物可包括患者常用的糖尿病、抗 高血压和抗脂质药。
[0169] 向该患者给药达那唑或安慰剂治疗，持续12周，然后进行4周的清除期，在这之 后，即第16周，评估患者的视力恢复并登记到12周的开放标签扩增研宄。
[0170] 每日剂量（4粒胶囊）与安慰剂的每日剂量相同，0.5mg/BMI组或LOmg/BMI组，如 下表2-4所示（"Cap"是指胶囊）
[0171]表2 lmg达那唑/BMI
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177] 疗效确定：从基线到12周，将糖尿病性视网膜病早期治疗研宄（ETDRS)进行的字 母读数的最佳矫正视力（BCVA)的变化与安慰剂相比较。次要测量包括从基线到12周，通 过光学相干断层扫描（OCT)测定的中央黄斑厚度（CMT)的变化；在第12周，视敏度（VA)由 10的基线或更多字母的BCVA的变化；以及不良反应的频率和严重性，包括临床显著异常的 实验室结果。
[0178] 统计学方法：主要分析是在以下两个比较组中，从基线到第12周的BCVA字母变化 的多重比较：（1)达那唑0. 5mg/BMI与安慰剂相比；（2)达那唑1. Omg/BMI与安慰剂相比。 将协方差分析（ANC0VA)与作为协变量的基线字母读取以及与治疗的主要效果的混合效果 分析作为主要分析进行。使用混合效果，如由一些受试者获得的双眼的数据。多重性将通 过各活性组与安慰剂的Dunnett比较来确定。
[0179] 次要分析检测的是治疗组和安慰剂组在基线到第12周CMT变化的差异。用协变 量调整基线CMT的混合效果模型用于评估CMT变化；Dunnett比较将用来矫正多重误差。
[0180] 在第12周，使用逻辑连接函数的广义估计方程（GEE)模型，其包括基线BCVA字母 作为协变量，用于评估响应状态（定义为10或更多字母的增益）。
[0181] 实施例3 :达那唑对于血管生成的影响（对比）
[0182] A. HUVEC 细胞增殖
[0183]步骤:
[0184] 从Cambrex(Walkersville，MD)获得了初始的人脐静脉内皮细胞（HUVEC)和EGM-2 生长培养基。在组织培养瓶中，将细胞在补充有2%胎牛血清（FCS)的培养基中，于37°C和 5% C02下传代。当由供给人指出60-80%融合时，利用胰蛋白酶进行次代培养。
[0185] 将2次传代的HUVEC的冷藏保存的安瓿解冻并以5000细胞/cm2的浓度放置在96 孔组织培养板中。在乙醇中配制50mM达那唑的储存液，并且将培养基中的FCS提高至5% 以保持达那唑在溶液中。利用含有达那唑终浓度在〇. 1~100 U M范围的培养基处理细胞， 重复三次。进行培养24、48和72小时，并用Promega(Madison，WI)的Celltiter96AQ ue。us One Solution Cell Proliferation Assay (Celltiter 96AQU_S单细胞细胞增殖分析）测 定细胞增殖。简单来说，从每个孔中吸出培养基并且利用200 y 1 Cambrex的Hepes缓冲 盐溶液（HBSS)清洗细胞并升温至37°C。向每个孔中加入100 y 1经稀释的celltiter溶 液（15 y 1原液+85 y 1含EGM-2的0. 1 % FCS)，并且再继续温育4小时。利用酶标仪使用 530nm过滤片并减去空白值后测定光密度，并且以0D土标准偏差的形式显示数据。在每个 孔中的乙醇的终浓度小于0. 2%并且对于细胞增殖或生存力没有影响。
[0186] 作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的差异利用学生 t-检测在Microsoft Excel软件中进行分析。P〈0. 05被认为是统计学上显著的。
[0187] 结果，观察和讨论:
[0188] 在一段时间，在达那唑存在时培养的初始的HUVEC减少了由Promega celltiter 增殖试验获得的〇D，并且具有剂量依赖趋势（图1)。Celltiter试验基于由于脱氢酶引起 的试验溶液形成的甲月替染料的减少，其直接与细胞数量关联。
[0189] 在24小时时，只有在非常高的剂量下，达那唑处理似乎是有效的。在10 yM或更 高浓度的达那唑时观察到试验中0D显著的降低（p值〈0. 05)。在无达那唑的孔中检测到的 0D为0. 414±0. 06,以及利用10 y M达那唑处理使0D降低至0. 288+0. 037,而利用100 y M 达那唑处理使得0D降低至0. 162+0. 017,分别相当于30%和65%的抑制率。
[0190] 在48小时时，甚至在1 yM的水平时也可以观察到显著地抑制。48小时后在培养 物中得到的无达那唑的读数增加至〇. 629±0. 095,以及利用1 yM时降低至0. 378±0. 037， 利用10 yM时降低至0. 241 ±0. 012,以及利用100 yM时降低至0. 19±0. 033 (或抑制率分 别为 40%、61%和 70% )。
[0191] 在72小时后，所有的达那唑处理检测显示在HUVEC增殖上显著的减少。在无 达那唑的孔中得到的0D为1. 113±0. 054,以及在0. 1 yM处理后降低至0. 798±0. 037， 在1 yM处理后降低至0? 484±0. 022,在10 yM降至0? 229+0. 016,以及100 yM降至 0.156±0.018(抑制率分别为28%、57%、80%和86%)。
[0192] 在所有时间点，全部100 yM达那唑剂量得到的检测结果是一致的，显示在该浓度 可以完全阻止细胞增殖。
[0193] 总体上，达那唑显示对内皮细胞增殖的较强的抑制。
[0194] B. HUVEC 管的形成（Tube Formation)
[0195]步骤:
[0196] 为了研宄由HUVEC形成的毛细管样结构，从BD Biosciences (San Jose, CA)购买 的血管生成系统：内皮细胞管形成试验（Endothelial Cell Tube Formation Assay)，并且 根据制造商的说明书使用。简单来说，在5% FCS的存在下，在96孔组织培养板中的再水合 基质胶塞（rehydrated materigel plug)上接种100000HUVEC，以引发管形成。添加达那挫 使得终浓度为1 y M、10 y M或50 y M，并添加50 y M LY294002 (阳性对照）。在18小时后， 利用Kodak DCS Pro SLR/N数码相机（Rochester, NY)对孔拍照，并安装到倒置显微镜上。 包括经乙醇处理的孔以确定该媒介（vehicle)对于细胞分化的任何影响。
[0197] 结果，观察和讨论:
[0198] 为了说明达那唑能否阻止由HUVEC形成管样结构，使用了含有基质胶塞的96孔 板。在生成血管的物质的存在下，并且提供了细胞外基质骨架（extracellular matrix scaffold)下培养内皮细胞，内皮细胞会分化成结构松散的类毛细血管。在达那唑存在下 生长的HUVEC与对照相比，显示为具有较细和较少确定的关联的更为不组织化的结构（参 见图2,其中A =对照，B = 1 yM达那唑，C = 10yM达那唑，D = 50yM达那唑，以及E = 50yM LY294002)。利用50yM达那唑处理导致位于基质胶塞上的分离的HUVEC群落，其具 有非常少的、细的联系或血管内腔空间。达那唑的影响与阳性对照化合物LY294002非常相 似。为了确定所使用的媒介没有影响，利用相当于所用的最高剂量的达那唑的浓度的乙醇 处理孔，并且观察到对于管形成没有影响（数据未示出）。这些数据显示在50 yM，达那唑 是管形成的有效抑制剂。在1 u M或10 y M，达那唑对于管形成没有影响。
[0199] C. HUVEC 侵入（invasion)
[0200]步骤:
[0201] 从 BD Biosciences (San Jose，CA)购买 BioCoat 基质胶侵入室（Matrigel Invasion Chamber)。在37°C利用500 y 1 HBSS对植入物进行再水合2小时，随后在潮湿的 培养箱中使用。利用含有〇. 1 % FCS的温EGM-2清洗经胰蛋白酶作用的HUVEC两次，并且将 其添加到侵入植入物（invasion insert)的上部室内，使得在总体积250 yl中有100000 个细胞。将达那唑和对照化合物添加到上部储存室内使得终浓度为10 UM和100 yM。将补 充有5% FCS的750 y 1 EGM-2添加到底部的室内以引发侵入，并将板温育24小时。利用润 湿的棉刷从上部的室中移出非侵入性细胞（non-invasive cell)，然后用HBSS清洗植入物 两次。然后将植入物浸没在HBSS中制备的10 yM钙黄绿素AM中，并温育4小时。利用在 485nm激发和在595nm发射的酶标仪测定荧光。LY294002以及结构上相似但非活性的化合 物LY303511分别作为该实验的阳性和阴性对照。
[0202]结果:
[0203] 图7示出了结果。作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的 差异利用学生t-检测在Microsoft Excel软件中进行分析。P〈0. 05被认为是统计学上显 著的。
[0204] 使用多孔的、基质胶包覆的植入物确定达那唑是否可以影响内皮细胞的侵入或迀 移（图7)。在用于本研宄的系统中，在将FCS加入到与内皮细胞相反的室内之后，通过荧光 染色检测到细胞的显著增加（从5674FU±77增加至7143±516)。10 yM和100 yM浓度的 达那唑没有影响，但LY294002显示几乎完全弱化了细胞侵入（5814±153)。这些数据显示 FCS中存在的因素引发了由HUVEC生成蛋白酶，该蛋白酶降解了细胞外基质，然后沿趋化梯 度迀移。达那唑对于本模型中的HUVEC的侵入和迀移没有明显地抑制效果。
[0205] D. HUVEC 迀移
[0206]步骤:
[0207] 在划痕迀移试验（scratch migration assay)中进行分析以确定达那挫对于 HUVEC的迀移的影响。将传代8次的HUVEC，批号8750 (由Lonza获得），放置到6孔板（ICS BioExpress)的内皮生长培养基-2(EGM-2)完全培养基（由Lonza获得）中。在存在5% 〇) 2的条件下，将该板在37°C培养箱中培养48-72小时以获得融合的单层。然后用1000 y 1 移液器吸头"刮下"该单层并且用温EGM-2培养基清洗其两次。抽吸最终清洗培养基并且 用新鲜的EGM-2培养基或含有一定范围浓度的达那唑（Sigma，#D8399)的新鲜的EGM-2培 养基来替代。拍摄已受损的单层的照片并且将该板放置在37°C培养箱，在5% C02中继续 温育24小时。对孔再次拍照。利用Adobe Photoshop软件测量每张照片中的间隙，间隙的 测量值通过在间隙中的像素数量来示出。
[0208]结果:
[0209] 下表5中列出了三次单独实验的结果。根据表5可以看出，在该分析中发现50 yM、 75 yM和100 yM的达那唑显著地抑制HUVEC迀移。用于该试验的EGM-2培养基与在上述 C部分描