细胞质pl20(与AJ复合的支架蛋白）的增加。这样的向上调节引起活性 RhoA的降低，其与屏障-稳定化GTPase (例如Racl、Rap_l和Cdc42)的增加相关。相信在 本实验中观察到的在低剂量达那唑处理后的VE-钙粘蛋白磷酸化的增加导致屏障稳定化 GTPase的活化。此外，达那唑可以阻止由VEGF导致的磷酸化的去稳定化。
[0269] 实施例12 :达那唑和类固醇受体拮抗剂对于视网膜内皮细胞单层的TER的影响
[0270] 进行试验以确定达那唑和类固醇受体拮抗剂对于人视网膜内皮细胞（ACBRI 181， Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内皮电阻（TER)的影响。 为了进行，用5 yg/cm2纤维连接蛋白包覆Greiner组织培养基孔植入物（Greiner BioOne 24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610)。然后，将传代13次的人视网膜内皮细胞在 300 yl EGM-2培养基（Lonza)中，以每植入物120000个细胞的比例接种到孔上部的室中。 下部室的体积为700 y 1 EGM-2培养基（Lonza)。在存在5% 0)2的条件下，将该板在37°C 培养箱中培养48小时以形成紧密的单层。在温育的末期，针对所有的植入物，使用附着在 EV0M 2伏欧表上的STX 2探针（两者均来自于World Precision Instruments)进行TER检 测以确认内皮屏障的完整性。与无细胞的植入物相比，所有的植入物均显示出提高的电阻。
[0271] 然后，缓慢地倾倒出培养基，并替换为具有以及不具有一些添加剂的新鲜的 EGM-2。添加剂为达那唑、羟基氟他胺（雄激素受体拮抗剂）、氟维司群（雌激素受体拮抗 剂）、睾酮、雌二醇和PI3激酶抑制剂LY 294002 (对照）。所有添加剂的储备溶液，除了达那 唑之外，均配制成10mM在DMS0中的溶液。达那唑储备溶液为10mM的乙醇溶液。利用相同 的溶剂制备所有添加剂的工作200 y M稀释液。然后，在EGM-2培养基中配制每种添加剂的 200nM稀释液，以及乙醇和DMS0的等量稀释液（对照），将达那唑和其它添加剂中的每一种 或培养基（对照）组合添加到孔中，且下表中示出了终浓度。然后将该板放置在培养箱中， 针对每个植入物在5分钟、30分钟、60分钟和24小时采用上述的方法进行TER检测。通过 从植入物的读数中减去背景测量值（空白植入物）并再除以植入物的表面积（0.33cm 2)从 而计算TER。结果列在下表14中。
[0272] 从表14中可以看出，与对照（无治疗）相比，达那唑提高了 TER测量值，羟基氟他 胺降低了读数，睾酮稍稍降低了读数，以及氟维司群基本没有影响。达那唑阻止了由羟基氟 他胺引起的降低，而稍微降低睾酮中的结果。如实施例8中的结果，这些结果可以是在这些 细胞中达那唑占据雄激素受体的证据。
[0273] 表 14
[0274]
[0275] 实施例13 :达那唑对于肌动蛋白张力丝形成的影响
[0276] 将传代6次的人肾小球微血管内皮细胞（ACBRI 128, Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute 的独家经销商），Kirkland， WA)以及传代 12 次的人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute 的独家经销商），Kirkland，WA)接种到由 5 yg/cm2纤维 连接蛋白包覆的16-室载玻片中，以在总体积200 y 1 EGM-2培养基（Lonza)中每个孔2000 个细胞的浓度接种。在存在5% 0)2的条件下，将该板在37°C培养箱中培养48小时。然后， 添加用Hanks平衡盐溶液（HBSS ;Lonza)稀释的测试化合物（达那唑，TNF a和S1P)，并得 到以下终浓度：达那挫（1 uM) (Sigma)，TNF a (lng/ml) (Sigma)，以及 S1P(1 yM) (Sigma)。 将该载玻片与测试化合物在具有5% 0)2的37°C培养箱中一起温育15分钟、30分钟、或24 小时。在上述温育后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶液（PBS)中的3.6%甲 醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100 U 1 PBS清洗两次。用在PBS中的0. 1% Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用lOOyl PBS清洗两次，并且将PBS 中的罗丹明标记鬼笔环肽（Invitrogen)的1:40稀释液50 y 1加入到细胞中，对F-肌动蛋 白进行染色，并将该细胞在室温下放置20分钟。所有的孔均用100 yl PBS清洗两次。之 后，向每个孔中加入l〇〇yl PBS并且使用具有罗丹明过滤片（ex530/em590)的倒置显微镜 对细胞进行观察和拍照。
[0277] 结果显示达那唑影响张力丝在人肾小球微血管内皮细胞中形成的能力。当用达那 唑单独处理时，在15分钟细胞展示出核周围染色，在3小时，许多细胞中出现遍及具有褶 皱边缘的细胞散开的染色，并且在24小时，其具有与未处理的对照类似的染色。单独利用 TNFa，在所有时间观察到张力丝，显示张力丝的细胞数量和纤维的厚度随时间增加。在所 有时刻，达那唑降低张力丝的形成并且降低纤维的厚度，在3小时，开始观察到皮质肌动蛋 白环和有裙皱的边缘。单独用S1P处理细胞，显示出肌动蛋白皮质环（cortical ring)，其 在15分钟开始形成并且在3小时时最强。在24小时，细胞重新返回到与未处理的对照相 似的形态。达那唑似乎增强了皮质环。此外，观察到了散开的染色，尤其是在15分钟和24 小时。
[0278] 利用达那唑单独处理视网膜内皮细胞，在15分钟，细胞显示出核周围染色，在3小 时，许多细胞中出现遍及具有褶皱边缘的细胞散开的染色，并且在24小时，其具有与未处 理的对照类似的染色。单独利用TNFa，在所有时间观察到张力丝，显示张力丝的细胞数量 和纤维的厚度从15分钟增加至3小时，并在24小时温育后开始降低。在所有时刻，达那唑 降低张力丝的形成和/或降低纤维的厚度。在15分钟和24小时，观察到散开的染色，在3 小时可以看到皮质肌动蛋白环。单独用S1P处理细胞，显示出肌动蛋白皮质环，其在15分 钟开始形成并且在3小时时最强。在24小时，细胞重新返回到与未处理的对照相似的形 态。在3小时，达那唑似乎增强了皮质环。此外，观察到了散开的染色，尤其是在15分钟和 24小时。
[0279] S1P(1_磷酸鞘氨醇）在血管内皮的形成和保持上起着非常重要的作用。S1P是构 成的信号输入（constitutive signaling input)，其通过对于肌动蛋白细胞骨架的作用促 进血管内皮的组构和屏障功能。尤其是，S1P涉及皮质肌动蛋白纤维的形成以及粘附连接 的组构。S1P的缺失会导致血管渗漏和水肿，以及S1P可以逆转内皮功能障碍和修复屏障功 能。
[0280] 在本实验中，达那唑显示在视网膜和肾小球内皮细胞两者中增强S1P保护效果的 能力。达那唑还可以逆转在这两种内皮细胞类型中由TNFa引起的张力丝的形成。在单独 用达那唑处理的细胞中观察到散开的核周围染色。
[0281] 实施例14 :达那唑对ECIS的影响
[0282] 进行试验以确定达那唑对人肾小球微血管内皮细胞（ACBRI 128, Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute 的独家经销商），Kirkland，WA) 或人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商），Kirkland，WA)的跨内皮电阻（TER)的影响。使用 具有8孔多电极板（8W10E)的细胞电阻抗测试传感器（ECIS)系统（ECISZ 0，由Applied Biophysics获得）测定电阻。如下利用在HBSS中的5 y g/cm2纤维连接蛋白包覆板的每个 孔，向每个孔中加入100 U 1的纤维连接蛋白，并且在存在5% 0)2的条件下，将该板在37°C 培养箱中培养30分钟。除去纤维连接蛋白溶液，向每个孔中加入400 yl EGM-2培养基 (Lonza)。将该板与ECISZ0系统连接并且使其电稳定。吸出每个孔的EGM-2培养基并替 换为200 y 1含100000个细胞的EGM-2培养基。将该板再次与ECISZ 0系统连接，并且在 5% 0)2中，于37°C培养箱中温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为400 y 1 新鲜的EGM-2培养基。将该板再次与ECISZ 0系统连接，并且在5% 0)2中，于37°C培养箱 中温育6小时。制备测试化合物在HBSS中的浓溶液，并且放置在培养箱中使其平衡。然后 按照下述最终浓度将测试化合物加入到合适的孔中：达那唑（1 UM) (Sigma)和S1P(1 yM) (Sigma)。监测ECIS (阻抗）90小时。
[0283] 在视网膜内皮细胞中，在进行处理之后的约1. 5-2. 0小时，与未处理的细胞相比， 单独的1. 0 y M达那唑显示ECIS增加，并且持续5小时。在进行处理之后的第一个15分钟 内，与未处理细胞相比，单独的S1P显示ECIS增加，并且持续约3小时。与S1P单独和未处 理的细胞相比，达那唑和S1P组合增加了 ECIS，该增加的ECIS持续约90小时。因此，达那 唑显示具有提高S1P早期效果的能力，以及当S1P存在时在整个实验中保持更高阻抗的能 力。
[0284] 肾小球内皮细胞显示出不同的模式。单独的达那唑对于ECIS没有作用直到处理 之后约30小时。与未处理的细胞相比，从约30小时~约90小时，单独的达那唑增加ECIS， 并且在约60-90小时出现最大增加。单独的SIP也对于ECIS没有作用直到处理之后约30 小时。与未处理的细胞相比，从约30小时~约60小时，单独的S1P增加ECIS。达那唑和 S1P的组合对于ECIS没有作用直到处理之后约30小时。与未处理的细胞、S1P单独和达那 唑单独相比，上述组合增加了 ECIS。具体来说，与未处理的细胞相比，该组合从约30~约 70小时增加ECIS，与S1P单独相比，该组合从约30~约75小时增加ECIS，与达那唑单独相 比，该组合从约30~约50小时增加ECIS。
[0285] 实施例15 :达那唑对ECIS的影响
[0286] 进行试验以确定达那唑对人肾小球微血管内皮细胞（ACBRI 128, Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute 的独家经销商），Kirkland，WA) 的跨内皮电阻（TER)的影响。使用具有8孔多电极板（8W10E)的细胞电阻抗测试传感器 (ECIS)系统（ECISZ 0，由Applied Biophysics获得）测定电阻。如下利用在HBSS中的 5 y g/cm2纤维连接蛋白包覆板的每个孔，向每个孔中加入50 y 1的纤维连接蛋白，并且在存 在5% 0)2的条件下，将该板在37°C培养箱中培养30分钟。除去纤维连接蛋白溶液，向每 个孔中加入200 yl EGM-2培养基（Lonza)。将该板与ECISZ0系统连接并且使其电稳定。 吸出每个孔的EGM-2培养基并替换为200 y 1含40000个传代6次的细胞的EGM-2培养基。 将该板再次与ECISZ0系统连接，并且在5%0)2中，于37°C培养箱中温育24小时。吸出每 个孔的EGM-2培养基并且替换为200 yl新鲜的EGM-2培养基。将该板再次与ECISZ0系 统连接，并且在5% 0)2中，于37°C培养箱中再温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并 且替换为200 yl没有地塞米松的新鲜EGM-2培养基。将该板再次与ECISZ0系统连接，并 且在5% 0)2中，于37°C培养箱中温育过夜。最终，吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为 200 y 1没有地塞米松的新鲜EGM-2培养基。将该板再次与ECISZ 0系统连接，并且在5% 〇)2中，于37°C培养箱中温育2小时。制备测试化合物在HBSS中的浓溶液，并且放置在培 养箱中使其平衡。然后按照下述最终浓度将测试化合物加入到合适的孔中：达那唑（1UM) (Sigma)和地塞米松（1 yM) (Sigma)。监测ECIS (阻抗）90小时。
[0287] 在约3小时，与未处理的细胞相比，单独的达那唑增加了 ECIS并持续约90小时。 该增加在约12~约15小时最大。与地塞米松相比，达那唑显示相似的形式，但是ECIS (TER) 的增加没有地塞米松显著。
[0288] 实施例16 :达那唑对于RhoA的影响
[0289] 内皮细胞细胞骨架的重构对于内皮的许多功能是重要的。小GTP-结合蛋白的Rho 家族被认为是F-肌动蛋白细胞骨架动力学（cytoskeletal dynamics)的关键调节剂。Rho 家族包括三个亚型：RhoA、RhoB和RhoC。RhoA活性的活化导致在内皮细胞中张力丝明显形 成。利用凝血酶刺激内皮细胞增加Rho GTP以及肌球蛋白磷酸化，其与增加的细胞收缩性 一致。RhoA的抑制阻断该响应，以及屏障功能的丧失，其显示Rho在血管通透性的关键作 用。
[0290] 使用从 Cytoskeleton，Denver, Colorado 购买的可商购的 Rho 活化试验（GLISA)， 按照制造商的说明书进行该实验。简单来说，在纤维连接蛋白-包覆的（lyg/cm2)6-孔组 织培养基板上，使用EGM-2培养基（Lonza)，在具有5 % C02的37 °C培养箱中，培养了传代8 次或 12次的人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute， Kirkland，WA) 24小时（每个孔30000个细胞，具有3ml的总体积）。然后，吸出培养基并替 换为补充有〇. 1 %胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素和ITSS (胰岛素，转铁 蛋白硒钠（transferrin sodium selenium))(所有均来自 Lonza)的Ultraculture培养基， 以得到血清饥饿细胞并且减少RhoA的背景值。在具有5% 0)2的37°C培养箱中培养该细胞 24小时。在加入到细胞中之前，将在HBSS中稀释的测试化合物放置在培养箱中使其平衡。 然后，将150 y 1每种测试化合物加入到合适的培养孔中，然后在培养箱中再温育该板15分 钟。然后，将凝血酶加入到适当的孔中。1分钟之后，用1.5ml磷酸盐缓冲盐溶液清洗细胞 1次，并且然后用100 U 1补充有蛋白酶抑制剂的GLISA裂解缓冲液裂解细胞。刮下提取物， 并转移到微量离心管中，并转移到冰上以保存RhoA的活性形式。通过在4°C、lOOOOrpm条 件下离心2分钟除去细胞残渣得到澄清的所有提取物。然后将上清液转移的新的管子中， 并且放回到冰上。取出每个提取物的等量样品用于GLISA试验和蛋白质测定。所有的蛋白 质浓度均在10%以内，以及以所获得的浓度（相当于每孔15 y g总蛋白质）使用该提取物。 GLISA试验通过使用试剂盒中提供的试剂来进行。
[0291] 下表15列出了传代12次的视网膜内皮细胞的结果。如所预料的，由凝血酶诱导 的活性RhoA水平非常高。所有的测试化合物均抑制了 Rho A的凝血酶-诱导活化。
[0292] 下表16列出了传代8次的视网膜内皮细胞的结果。如所预料的，由凝血酶诱导的 活性RhoA水平非常高。所有的测试化合物均抑制了 Rho A的凝血酶-诱导活化。
[0293] 表 15
[0294]
[0295] * 由 Sigma 获得
[0296] 表 16
[0297]
[0298] 实施例17 :血管通透性过高的动物模型
[0299] 每天新西兰白兔口服接受0.215mg/kg达那唑两次，共7天。然后向所述兔子玻璃 体内注射血管内皮生长因子A(VEGF-A) -次，以在视网膜中产生血管渗漏。然后，24小时之 后，注射荧光素钠，使用Flu〇r〇tr 〇n(0CumetriCS)测量眼部的荧光（5次测量取平均）。一 只对照（安慰剂）兔子在视网膜中具有250荧光单位，说明其中血管渗漏。单独达那唑处 理的兔子具有16荧光单位，显示达那唑使得血管渗漏降低了 94%。
[0300] 本发明的前述说明书是为了说明和描述的目的。此外，该说明书不旨在限制本发 明为所公开的形式。因此，符合上述教导以及相关领域的技术或知识的变更和修改是在本 发明的范围内的。上文所描述的实施方案还旨在解释已知用于实施本发明的最佳模式并使 得本领域其他技术人员利用本发明在这样或其他的实施方案中，或根据本发明具体应用或 用途的需要做各种修改。应将所附权利要求解释为包括现有技术允许的替代实施方案的范 围。
【主权项】
1. 抑制有此需要的动物的血管通透性过高的方法，其包括： a. 确定该动物的体脂含量；和 b. 根据该动物的体脂含量向该动物给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。2. 权利要求1的方法，其中所述确定步骤包括计算该动物的体质指数（BMI)。3. 权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物是口服给药的。4. 权利要求2的方法，其中所述达那唑化合物以约0. 5mg/BMI单位/天至约1.0 mg/BMI 单位/天的量给药。5. 权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物每日给药两次。6. 权利要求2的方法，其中当该动物的BMI小于26时，则所述达那唑化合物的量为约 2mg/天至约15mg/天。7. 权利要求6的方法，其中当该动物的BMI小于26时，则所述达那唑化合物的量为约 5mg/ 天。8. 权利要求2的方法，其中当该动物的BMI为26至35时，则所述达那唑化合物的量为 约2mg/天至约15mg/天。9. 权利要求8的方法，其中当该动物的BMI为约26至35时，则所述达那唑化合物的量 为约IOmg/天。10. 权利要求2的方法，其中当该动物的BMI大于35时，则所述达那唑化合物的量为约 5mg/天至约45mg/天。11. 权利要求10的方法，其中当该动物的BMI大于35时，则所述达那唑化合物的量为 约15mg/天。12. 权利要求1的方法，其中由于该动物存在由血管通透性过高介导的疾病或病症，因 此其需要所述达那唑化合物。13. 权利要求12的方法，其中达那唑化合物的给药可在诊断出该疾病或病症后立即开 始。14. 权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为糖尿病。15. 权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为动脉粥样硬化。16. 权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为高血压。17. 权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、老 年性黄斑退化症、脑部水肿、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状动脉微血管病变、脑微血管病变、 Eals病、损伤引起的水肿、与高血压有关的水肿、肾小球血管渗漏、失血性休克、欧文加斯综 合征、缺血、黄斑水肿、肾炎、肾病、肾病性水肿、肾病综合征、神经病、水肿导致的器官衰竭、 先兆子痫、肺水肿、肺动脉高压、肾衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉闭塞、视网膜 炎、视网膜病变、无症状性脑梗死、系统性炎症反应综合征、移植肾肾小球病、葡萄膜炎、血 管渗漏综合征、玻璃体出血或VonHipple Lindau病。18. 权利要求17的方法，其中所述疾病或病症为黄斑水肿。19. 权利要求17的方法，其中所述疾病或病症为神经病。20. 权利要求17的方法，其中所述疾病或病症为视网膜病变。21. 权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为糖尿病的血管并发症。22. 权利要求21的方法，其中所述血管并发症为水肿、内皮下间隙的低密度脂蛋白的 蓄积、加速的动脉粥样硬化、脑血管壁加速老化、心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、 糖尿病心肌病、糖尿病母亲的胎儿的肺发育滞后、一个或多个肺部生理参数的变化、感染易 感性增加、肠系膜中的血管增生、糖尿病性神经病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性肾病、糖尿 病性视网膜病以及皮肤发红、变色、干燥和溃疡。23. 权利要求22的方法，其中所述血管并发症为水肿。24. 权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病心肌病。25. 权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性神经病。26. 权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性黄斑水肿。27. 权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性视网膜病。28. 权利要求27的方法，其中所述糖尿病性视网膜病为非增殖性糖尿病性视网膜病。29. 权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性肾病。30. 权利要求1的方法，其中由于该动物具有一个或多个由血管通透性过高介导的疾 病或病症的早期迹象或倾向于发展成由血管通透性过高介导的疾病或病症，则该动物需要 达那唑化合物。31. 权利要求30的方法，其中所述疾病或病症为糖尿病、高血压或动脉粥样硬化。32. 权利要求1的方法，其中所述血管通透性过高是发现位于或包围脑、膈、十二指肠、 脂肪、心脏、肾脏、大血管、肺部、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤或睾丸的连续性内皮的 血管通透性过高。33. 权利要求32的方法，其中所述连续性内皮被发现位于或包围脑、心脏、肺部、神经 或视网膜。34. 权利要求1的方法，其中所述血管通透性过高是发现位于或包围肾脏、胰腺、肾上 腺、内分泌腺或肠的开窗内皮的血管通透性过高。35. 权利要求34的方法，其中所述开窗内皮发现存在于肾中。36. 权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物是达那唑。37. 权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物是延时释放制剂。38. 权利要求37的方法，其中所述延时释放制剂包含选自脂质体和多糖的成分。39. 权利要求1的方法，其中所述动物是人。40. 抑制有此需要的动物血管通透性过高的方法，其包括向该动物给药血管通透性过 高抑制量的达那唑化合物，其中所述量对应于该动物的体脂含量。41. 调节动物内皮细胞的细胞骨架的方法，其包括 a. 确定该动物的体重；和 b. 根据该动物的体重，向该动物给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。42. 权利要求41的方法，其中所述确定步骤包括计算该动物的体质指数（BMI)。43. 权利要求41的方法，其中所述细胞骨架的调整包括抑制肌动蛋白张力丝的形成。44. 权利要求41的方法，其中所述细胞骨架的调整包括引起、增加或延长皮质肌动蛋 白环的形成。45. 权利要求41的方法，其中所述细胞骨架的调整包括抑制RhoA。46. 权利要求41的方法，其中所述动物为人。
【专利摘要】本发明提供在有需要的动物中抑制血管通透性过高的方法。该方法包括向所述动物给药血管-通透性过高-抑制量的达那唑化合物。该方法包括根据动物的体脂含量向所述动物给药有效量的达那唑化合物。本发明还提供调节动物中内皮细胞的细胞骨架的方法。
【IPC分类】A61K31/58
【公开号】CN104968350
【申请号】CN201380072209
【发明人】D.巴奥
【申请人】安皮奥制药股份有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2013年12月19日
【公告号】CA2895340A1, EP2934546A1, US20140227347, WO2014100352A1