述的基质胶模型（Matrigel model)中所用的FCS相比，含有生长因子的混合物 (cocktail)。在生长因子方面的不同可能会导致使用这两个模型得到的结果不同。
[0210] 表 5 [02111
[0212] 实施例4 :达那唑对于HUVEC单层的血管通透性的影响
[0213]步骤:
[0214] 进行试验以确定达那唑对于HUVEC单层的通透性的影响。使用内皮生长培养 基-2 (EGM-2)(由Lonza获得），将传代5~10次的HUVEC，批号7016 (由Lonza获得）接 种到位于24孔板的孔中的1微米孔径植入物（Greiner BioOne 24-孔Thincert细胞培养 植入物，#662610或ISC BioExpress，#T-3300-15)上。在存在5%(：02的条件下，将该板 在37°C培养箱中培养48-72小时以获得融合并且形成紧密单层。然后除去上述培养基，并 用新鲜的培养基或含有一定浓度范围的达那唑（Sigma，#D8399)的新鲜的培养基代替。将 肿瘤坏死因子 a (TNFa ;Pierce Biotechnology, #RTNFAI)和白细胞介素-10 (IL-10 ; Sigma，#1-9401)添加到适当的孔中，使得每一种物质的终浓度为10ng/mKTNFa和IL-1 0 引发通透性；它们可以引起通透性高达10倍的增加。最后，以最终的稀释率为1:250,将轭 合至辣根过氧化物酶（HRP) (Pierce Biotechnology，#N100,1. 25mg/ml)的链霉抗生物素蛋 白添加到每个孔中。HRP是具有约44000分子量的大分子。在每个孔的上部室中最终体积 为300 y 1，以及在每个孔的下部室中最终体积为700 y 1。将该板在37°C培养箱，在5% C02 中继续温育24小时。在上述温育后，移出植入物并丢弃。通过对植入物上的细胞的视觉观 察显示所有的单层仍是完整的。
[0215] 为了评估HRP流过液，将15 y 1位于下部的室中的得到的溶液转移到96孔ELISA 板中（每个反应进行三次）。接下来，将100 Ul四甲基联苯胺（TMB)溶液（Pierce)添加到 每个孔中，然后在室温下显色5分钟。通过加入100 y 1的0. 18N酸性溶液终止显色。使用 设定为450應-53〇111]1(45〇111]11]1；[11118 530111]1)的酶标仪测定每个孔的00。与对照比较计算通 透性的抑制比例，并且将三组单独实验的平均值列在表6中。
[0216] 根据表6可以看出，25.0 yM或更高浓度的达那唑实际上增加了血管通透性。 10. 0 yM的浓度对于血管通透性的影响非常小或没有影响。0. 1 yM~5. 0 yM浓度、最佳 为0. 1 yM~0. 5 yM的达那唑降低了血管通透性。该剂量响应曲线非常有意思，因为其在 0. 001 yM(或可能更低）~0.005 yM的浓度时存在抑制的第二峰值。因此达那唑针对血管 通透性显示出非常有意思并且出乎意料的剂量响应曲线。
[0217] 如实施例3所示，需要达那唑的浓度为50 yM~100 yM使得在用达那唑温育18~ 24小时后获得对HUVEC增殖、迀移和管形成的抑制。如实施例4所示，在24小时后，抑制血 管生成的这些最佳浓度可能显著地增加血管通透性（参见表2)。相反地，用于抑制血管通 透性的最佳浓度（〇. 1 yM~0. 5 yM)在24小时会显著影响血管生成。
[0218] 表 6
[0219]
[022UJ头jMWJ 0 :込力P旺刈丁皿'臣旭迈'|土tfj京^H|nj
[0221] 将传代 9 次的人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland, WA)传代至 EGM-2 培养基（Lonza，Walkersville，MD)中直到获得 80%的融合。然后使用胰蛋白酶-EDTA使细胞从传代瓶中释放，并且对在得到的悬浮液中 的细胞进行计数以确定生存力和细胞数量。在本实验中细胞悬浮液的存活力高于90%。
[0222] 然后将细胞在300 y 1 EGM-2完全培养基中（由Lonza获得）接种到位于24孔板的 孔中的植入物（1微米孔径）（Greiner BioOne 24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610) 上。然后将700 y 1 EGM-2置于下部的室中，在存在5%0)2的条件下，将该板在37°C培养箱 中培养48小时以获得融合的单层。针对所有的植入物，使用附着在EV0M 2伏欧表上的STX 100电极（两者均来自于World Precision Instruments)进行跨内皮电阻（TER)检测以确 认半通透屏障的建立。为了进行测量，每个探针放置在每个孔中，其中一个电极位于上部的 室中一个电极位于下部的室中。
[0223] 然后，按照下述步骤重复地处理细胞两次。缓慢的从植入物中倾倒出EGM-2培养 基，并替换为頂DM培养基，所述MDM培养基除了 VEGF和氢化可的松之外含有0. 5%胎牛血 清和EGM-2添加物（均来自Lonza)。在一些孔中，MDM培养基含有以10倍系列稀释的一 系列达那唑（Sigma, #D8399)。在向每个孔的上部室中加入30 y 1含有4%荧光标记的人血 清白蛋白的溶液之前，在5% 0)2下，将该板在37°C培养箱中温育4小时。在37°C培养箱中 在5% C02存在下，再温育该板18小时。
[0224] 在上述温育之后，移出植入物并丢弃，并将200 y 1培养基从下部的室转移到96孔 黑色荧光-板（Falcon)中，重复三份。然后在340nm的激发波长和470nm的发射波长检测 每个孔的焚光。然后计算每个植入物的平均焚光单位（Mean fluorescence unit) (FU)，对 两次重复读数取平均。结果列在表3中。
[0225]表 7 [0226]
[0227] 可以看出，达那唑的最低浓度（0. 01 yM)提供最大的抑制（约10% )。在下部室 中没有细胞的对照孔显示超过4000FU，这说明视网膜内皮单层是选择性通透的。
[0228] 实施例6 :达那唑对于三种不同内皮细胞单层的TER的影响
[0229] 进行试验以确定达那唑对人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)的跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TER)的影响。为了进行，将150000个传代14次的人视网膜内皮细胞在300 y 1 EGM-2完全培养基（由Lonza获得）中接种到位于24孔板的孔中的植入物（1微米孔径） (Greiner BioOne 24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610)上，。然后，在存在5%C02 的条件下，将该板在37°C培养箱中培养24小时。在温育之后，缓慢的从植入物中倾倒出培 养基，并替换为新鲜的EGM-2或含有终浓度为1 y M达那唑的新鲜的EGM-2。将该板重新放 回到培养箱中并再培养144小时。试验也以同样的方式利用传代8次的人脑内皮细胞和传 代8次的人脐静脉内皮细胞进行。
[0230] 使用与STX 100电极连接的EV0M2伏欧表（两者均来自于World Precision Instruments)对每个植入物进行初始TER检测。在24、48、72和144小时也进行检测。结 果列出在下表8、9和10中。所有的数据均以植入物的TER测量值/cm 2减去空白植入物的 TER的形式示出。
[0231] 表 8
[0232] 人视网膜内皮细胞
[0240] 可以看出，在视网膜和脐静脉内皮细胞单层中，达那唑提高了 TER测量值（离子通 透性降低）。除了在较早的时间点之外，达那唑对于脑内皮细胞单层的TER没有太多影响。 TER是跨细胞单层的电阻的测量值。其是屏障完整性的指标与离子通透性相关联。
[0241] 实施例7 :达那唑对于Akt磷酸化的影响
[0242] 进行试验以确定达那唑对于人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的 Akt 磷酸化的影响。细胞在 25cm2瓶中的 含2%胎牛血清（Lonza)的EGM-2培养基（Lonza，Walkersville，MD)中生长至接近融合。 然后使用胰蛋白酶/EDTA使细胞从传代瓶中释放。对得到的悬浮液中的细胞进行计数，并 且在EGM-2培养基中以1 X 104细胞/孔的浓度接种到96孔板上。在存在5% C0 2的条件 下，将该板在37°C温育24小时。然后，添加200 y 1 EGM-2培养基（对照）或不同浓度的 达那唑，然后再温育该板2小时。在上述温育之后，立即用4%甲醛固定细胞、冷冻、按照制 造商的说明书，使用 Akt Cellular Activation of Signaling ELISA 试剂盒（AKT S473 的 CASE?试剂盒；SABiosciences，Frederick，MD)确定Akt磷酸化的程度。在平行试验中使用 利用比色法检测的传统的ELISA方式，AKT S473的CASE?试剂盒定量活化的（磷酸化的） Akt蛋白相对于总Akt蛋白的量。Akt磷酸化位点为丝氨酸473,并且可以被用于两个平行试 验之一的抗体中的一种识别，从而提供对于活化的Akt蛋白的检测。在另一个平行试验中 使用的另一个抗体识别Akt以提供对于总Akt蛋白的检测。使用辣根过氧化物酶标记的二 次抗体对两种一次抗体进行检测。加入制造商提供的展开溶液(^Developing Solution) 10 分钟，然后加入制造商提供的终止溶液（Stop Solution)，产生可以用比色分析法检测的结 果。
[0243] 下表11中列出结果。可以看出，所有浓度的达那唑均引起Akt磷酸化（活化）的 增加。
[0244] 表 11
[0245]
[0246] 相信这些结果提供了对于实施例4中得到的血管通透性剂量响应曲线的可能的 解释。如实施例4所示的，低剂量的达那唑降低通透性，而高剂量则增加通透性。相信在 S473的一定水平的Akt磷酸化会降低通透性（本实验中的0. 5-5. 0 yM浓度），而在S473 的Akt的高度磷酸化会引起通透性的增加（本实验中的10-50 yM浓度）。
[0247] 实施例8 :达那唑和类固醇受体拮抗剂对于视网膜内皮细胞单层的TER的影响
[0248] 进行试验以确定达那唑和类固醇受体拮抗剂对于人视网膜内皮细胞
[0249] (ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内 皮电阻（TER)的影响。为了进行，用5 yg/cm2纤维连接蛋白（Sigma)包覆Greiner组织培 养基孑乙植人物（Greiner tissue culture well insert) (Greiner BioOne 24-孔Thincert 细胞培养植入物，#662610)。然后，将传代12次的人视网膜内皮细胞在300 y 1 EGM-2培 养基（Lonza)中以每植入物120000个细胞的比例接种到孔上部的室中。下部室的体积为 700 y 1 EGM-2培养基（Lonza)。在存在5% 0)2的条件下，将该板在37°C培养箱中培养48 小时以形成紧密的单层。在温育的末期，针对所有的植入物，使用附着在EV0M 2伏欧表上的 STX 2探针（两者均来自于World Precision Instruments)进行TER检测以确认内皮屏障 的完整性。与无细胞的植入物相比，所有的植入物均显示出提高的电阻。
[0250] 然后，缓慢地倾倒出培养基，并替换为具有以及不具有一些添加剂的新鲜的 EGM-2。添加剂为达那唑、羟基氟他胺（雄激素受体拮抗剂）、氟维司群（雌激素受体拮抗 剂）和PI3激酶抑制剂LY 294002 (对照）。所有添加剂的储备溶液，除了达那唑之外，均配 制成10mM在DMS0中的溶液。达那唑储备溶液为10mM的乙醇溶液。在相同的溶剂中制备 所有添加剂的工作200 y M稀释液。然后，在EGM-2培养基中配制每种添加剂的200nM稀释 液，以及乙醇和DMS0的等量稀释液（对照），将达那唑和其它添加剂中的每一种或培养基 (对照）组合添加到孔中，且下表中示出了终浓度。然后将该板放回到培养箱中，针对每个 植入物在30分钟、60分钟、120分钟和24小时采用上述的方法进行TER检测。通过从植入 物的读数中减去背景测量值并再除以植入物的表面积（0.33cm2)从而计算TER。结果列在 下表12中。
[0251] 表 12
[0252]
[0253] 从表12中可以看出，与对照（无治疗）相比，达那唑和氟维司群提高了 TER测量 值（降低了通透性），而羟基氟他胺降低了读数（提高了通透性）。达那唑阻止了由羟基氟 他胺引起的降低。上述结果可以是在这些细胞中达那唑占据雄激素受体的证据。在相同的 时间点，达那唑和氟维司群显示出累加的效果。
[0254] 实施例9 :达那唑对于肌动蛋白张力丝形成的影响
[0255] 细胞旁途径的IEJ包括AJ和TJ。肌动蛋白细胞骨架与每个连接（junction)结合 并且通过肌动蛋白重构控制连接的完整性。肌动蛋白丝重组到张力丝中在连接上施加机械 力，将它们撕开，导致形态上的细胞收缩和变化。肌动蛋白的聚合过程是非常动态的，从而 使得肌动蛋白结构快速重组并且由静止表型（quiescent phenotype)转换，静止表型的特 征在于具有厚的皮质的肌动蛋白环和不具有张力丝，而活化的细胞表型具有细或非皮质的 肌动蛋白（nocortical actin)以及具有大量张力丝。看起来肌动蛋白细胞骨架还可能通 过调节细胞膜穴样凹陷的移动涉及到转胞吞作用中。
[0256] 将人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)接种到 Falcon Optilux 试验板（BD Biosciences)上，以在总体 积200 y 1 EGM-2培养基（Lonza)中每个孔1000个细胞的浓度接种。在存在5% C02的条件 下，将该板在37°C培养箱中培养48小时。然后，去除培养基并替换为补充有0. 1 %胎牛血清 的200 y 1 MDM培养基（均来自Lonza)，并且在这些生长因子和血清饥饿条件下培养该细 胞1小时以抑制肌动蛋白聚合。然后添加达那唑（0. 1 或10 yM终浓度）或PI3激酶抑 制剂LY294002 (10 y M终浓度）（阳性对照）。在加入这些化合物后，立刻加入TNF a (50ng/ ml终浓度）。在5% 0)2中、于37°C培养箱中温育30分钟后，吸出培养基，在室温下，用在 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS)中的3. 6%甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100 y 1 PBS清洗两次。用在PBS中的0. 1% Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔 均用100 yl PBS清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽（Invitrogen)的1:40稀 释液50 y 1加入到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞在室温下放置20分钟。然 后，所有的孔均用100 yl PBS清洗两次。之后，向每个孔中加入100 yl PBS并且使用具有 罗丹明过滤片（ex530/em590)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。
[0257] 结果显示达那唑影响张力丝形成的能力。当用达那唑处理后，取决于剂量，细胞 显示出不同的染色图案。在较低的达那唑剂量（0. 1 yM)时，观察到遍及细胞质的散开的 染色，其可能表示稳定过程或休止的表型（resting phenotype)。在较高的达那挫剂量 (10. 0 yM)时，检测到具有多个焦点的张力丝。这些发现与上述较低的达那唑剂量抑制通透 性而较高的达那唑剂量提高通透性的结果（参见上述实施例）相关。TNF a刺激细胞使得 在浓烈染色的焦点张力丝较强的生长。达那唑和LY294002减少了细胞的数量，该细胞显示 利用TNF a形成张力丝。
[0258] 实施例10 :达那唑对肌动蛋白张力丝形成的影响
[0259] 将人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Applied Cell Biology Research 1]181：；[1：1^6，1(；[^1&11(1，歡）接种到由11^/0112纤维连接蛋白包覆的卩&1(30110口1：；[11?试验板 (BD Biosciences)上，以在总体积200 yl EGM-2培养基（Lonza)中每个孔3000个细胞的 浓度接种。在存在5% 0)2的条件下，将该板在37°C培养箱中培养48小时。然后，去除培 养基并替换为补充有2. 0%胎牛血清的200 y 1 Ultraculture培养基（均来自Lonza)，并 且在这些生长因子和血清饥饿条件下培养该细胞过夜以抑制肌动蛋白聚合。然后除去培养 基，并替换为补充有2.0%胎牛血清并含有达那唑（0.1以11、111|1或1011|0或？13激酶抑制 剂LY294002 (10 y M)(阳性对照）的新鲜的Ultraculture培养基。将这些化合物在5% C02 中、于37°C培养箱中温育30分钟后，添加血管内皮生长因子（VEGF)(终浓度25ng/ml)。在 5 % C02中、于37 °C培养箱中再温育30分钟后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶 液（PBS)中的3. 6%甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100 yl PBS清洗两次。 用在PBS中的0. 1% Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用100y 1 PBS 清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽（Invitrogen)的1:40稀释液50 y 1加入 到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞在室温下放置20分钟。然后，所有的孔均 用100yl PBS清洗两次。为了计算细胞核的染色，向每个孔中加入3yM DAPI(4,6-二脒 基-2-苯基吲哚，重复两次（Invitrogen))溶液100 y 1。在5分钟之后，用100 y 1 PBS清 洗细胞两次。然后向每个孔中添加l00yl PBS并且使用具有罗丹明过滤片（ex530/em590) 和DAPI过滤片（ex350/em460)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。
[0260] 结果显示达那唑影响张力丝形成的能力。当用达那唑处理后，取决于应用的剂量， 细胞显示出不同的张力丝形成方式。在较低的达那唑剂量（〇. 1 yM)时，观察到遍及细胞质 的散开的F-肌动蛋白染色。在1. 0 y M达那唑，持续散开的染色，但是可以观察到张力丝和 包围大多数细胞周边的焦点。在最高的达那唑剂量（1〇.〇 UM)时，不存在任何散开的染色， 可以观察到张力丝的形成和焦点。使用较低剂量的达那唑所观察到的染色显示为核周围的 染色方式，表明类似于利用紫杉醇（紫杉醇化合物，已知用来稳定和聚合微管）观察到的微 管的稳定化。利用VEGF，形成较强的张力丝。达那唑以依赖于剂量的方式改变VEGF模式： (i)最低的〇. 1 UM达那唑剂量使得张力丝不太清晰并且出现一些分散的染色；（ii) 1. 0 yM 剂量显示厚度较薄的张力丝，但在接触表面上可以观察到焦点；以及（iii)最高10.0 UM达 那唑剂量显示具有焦点的较强的张力丝形成。LY294002阻止了利用VEGF观察到的较强的 张力丝形成并且显示出散开的染色。
[0261] 实施例11 :达那唑对血管内皮钙粘蛋白（VE-钙粘蛋白）磷酸化的影响
[0262] 在具有5% 0)2的37°C培养箱中，在使用EGM-2培养基（Lonza)的纤维连接蛋 白包覆的（lyg/cm 2)10cm2组织培养基板上使传代12次的人视网膜内皮细胞（ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)生长至融合。但达到完全 融合时，用补充有0. 5%胎牛血清和L-谷氨酰胺（均来自Lonza)的Ultraculture培养基替 换上述培养基，在这些生长因子和血清饥饿条件下培养上述细胞24小时。然后，除去培养 基，并替换为补充有0.5%胎牛血清和L-谷氨酰胺并含有达那唑（0. lyM、lyM或10 yM) 或乙醇（媒介对照）的新鲜的Ultraculture培养基。在5% 0)2中、于37°C培养箱中温育 15分钟后，添加血管内皮生长因子（VEGF)(终浓度为50ng/ml)，并在5%⑶冲、于37°C培 养箱中再温育该板15分钟。
[0263] 立刻处理该板以按照如下裂解细胞。将PBS和裂解缓冲液（PBS含有1 % Triton X-100,其中补充有磷酸酶抑制剂溶液1和2 (Sigma)，蛋白酶抑制剂（Sigma)和原钒酸钠，终 浓度2mM)冷却至4°C。用5ml冰冷PBS清洗细胞两次，然后用500 y 1冰冷裂解缓冲液累 裂解细胞。将得到的蛋白质提取物转移到1. 7ml微量离心管中，通过在4°C、10000rpm条件 下离心10分钟除去细胞残渣。然后，将450 y 1澄清的溶液转移到含有包覆有10 y 1 C19 抗-VEf1?粘蛋白多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology)(按照制造商的说明书进行包 覆）的Protein Dynabeads(Invitrogen)的管中。然后将提取物和珠在轨道摇床上在4°C 温育过夜以从提取物中捕获VE钙粘蛋白。然后用冰冷的裂解缓冲液冲洗珠四次。为了从 珠上释放蛋白质，于75°C在含有20%还原染料（Invitrogen)的SDS上样染料中加热珠10 分钟。
[0264] 在4-20 %聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen)中，在120V分离释放的蛋白质1 小时。为了确定凝胶中总蛋白质的磷酸化，按照制造商的说明书，依次进行Pro-Q diamond(Invitrogen)和SYPRO ruby(Invitrogen)蛋白质染色。对凝胶进行拍照并使用 Kodak影像工作站进行密度测定。结果如下表13所示。
[0265]表13
[0266] VE-钙粘蛋白
[0267] 无达那峻 0.1 [iM达那口坐VEGF 0.1jo_M达那峻， __(乙醇对照)____之后VEGF 相对强度-ProQ结果(磷酸 1.00 L51 L89 U8 化的蛋白质)_____ 相对强度-SYPRO 结果(总~~0)0 089 (X84 083 蛋白质)_____ 比例 0.215 0,365 0,481 0,358 磷酸化的蛋白质：总蛋白质_| (增加为1.70倍）| (增加为2.24倍）| (增加为1.66倍）
[0268]可以看出，达那唑引起VE-钙粘蛋白磷酸化的增加。VEGF引起VE-钙粘蛋白磷酸 化更高程度的增加（高度磷酸化），这一点被达那唑逆转。VE-钙粘蛋白是AJ的成分，取决 于其残基（residue)，VE-钙粘蛋白的磷酸化能够具有很多效果。通常来说，VE-钙粘蛋白的 酪氨酸磷酸化导致AJ分解并且增加通透性。而丝氨酸665磷酸化与降低的屏障功能相关， 引起VE-妈粘蛋白快速的但可逆的内化。似乎存在反馈回路，其中内化的（internalized) VE-钙粘蛋白驱动