生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为疫苗载体或免疫调节剂的应用_3

文档序号:9267248阅读:来源:国知局
mmol/L DTT,lmmol/L PMSF,0. lmmol/L EDTA)重悬浮; (3) 将上述重悬浮液以质量比1:3的比例加到步骤(I)中制备的Dextran T-500 / PEG 3350水双相混合物中,上下轻轻颠倒30~40次混合均匀; (4) 混合液在1,500rpm,10min,4°C条件下离心,取上相液和下相液继续进入两相系统, 分离三次后合并上相分离液,稀释5倍后,在100, 000Xg,60min,4°C条件下离心,收集沉 淀,即为所需的细胞区室,且富含类囊体。
[0050] 实施例5细胞区室的分离、纯化 采用密度梯度离心法分离、纯化得到所需的细胞区室。具体过程如下: (1) 选取IOg生长健壮,最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片,洗净后去除中脉,按 质量:体积的比例加入6倍体积的提取缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,0. 3mmol/L山梨 醇,2mmol/L EDTA, lmmol/L MgCl2, lmmol/L MnCl2,1% BSA, lmmol/L DTT),冰浴研磨; (2) 配置 Percoll 分层液(50mmol/L HEPES-K0H,0.3mmol/L 山梨醇,2mmol/L EDTA, lmmol/L MgCl2,lmmol/L MnCl2,l% BSA,3%PEG 6000, l%Ficoll),在 30, OOOXg,20min,4°C 条件下预先离心; (3) 将研磨液四层纱布过滤,在3, 000 X g,15min,4°C条件下离心,收集沉淀,沉淀用 2ml提取缓冲液悬浮,并置于步骤(2)离心过的Percoll分层液上,在15, 000 X g,20min,4°C 条件下离心,吸取下层,即为所需的细胞区室,且富含叶绿体。
[0051] 实施例6生物膜的制备 采用自组装技术制备所需的生物膜。具体过程如下: (1) 将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在足量的氯仿溶剂 中; (2) 将上述生物膜氯仿溶液加入到圆底烧瓶内,减压蒸发使得生物膜在烧瓶表面上铺 展,蒸发至恒重后加入PBS缓冲溶液并缓慢摇动2h ; (3) 将上述溶液在6, 000rpm,20min,4°C条件下离心,收集沉淀,并用重悬缓冲液 (20mmol/L Tris,0. lmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2, lmmol/L DTT)重悬沉淀; (4) 将重悬液在150,000Xg,60min,4°C条件下超速离心,弃上清,收集沉淀,即为通过 自组装技术得到的生物膜,且具有闭合特性。
[0052] 实施例7膜内包裹 采用逆向蒸发法在生物膜内进行DNA包裹,具体如下: (1) 将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜和十八胺以10:1 (体 积比)的比例混合,溶解在4倍体积的氯仿中,然后在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发(37 °C, 200rpm),除去氯仿; (2) 将含有乙肝病毒DNA的质粒溶解在20mmol/L的PBS中; (3)加入乙醚溶解步骤(1)中的生物膜,并与上述含有质粒的PBS等体积混合,置于 50°C水浴孵育20min,即为所需的包裹了乙肝病毒DNA质粒的转基因载体。
[0053] 实施例8膜内包裹 采用超声乳化法在生物膜内进行化妆品的成分包裹,具体如下: (1) 在4°C条件下,将维生素 C溶解在lmol/L的PBS缓冲溶液中,形成饱和溶液; (2) 将上述维生素 C饱和溶液和实施例5中得到的细胞区室混合,冰浴环境中用超声波 破碎仪超声乳化,超声探头的振幅为40%,工作30sec,间隔30sec,循环20次; (3) 将乳化液在100,000Xg,20min,4°C条件下离心,弃上清,收集沉淀,即为所需的包 裹了维生素 C的化妆品载体。
[0054] 实施例9表面吸附 采用静电吸附法在生物膜表面吸附病毒制备疫苗,具体如下: (1) 将实施例6中通过自组装技术得到的生物膜运用酸碱电位滴定法测算出等电点为 6. 8 ; (2) 将上述生物膜复溶于pH为5. 8的PBS缓冲液中,水浴超声IOmin ; (3) 将已知的,等电点为4. 8的猪瘟病毒和上述复溶在PBS的生物膜等浓度充分混合, 混匀后置于_30°C冷冻过夜,然后-60°C冷冻干燥过夜,即为所需的猪瘟疫苗。
[0055] 实施例10表面交联 采用交联法在生物膜表面交联细胞制备人工器官,具体如下: (1) 将实施例6中通过自组装技术得到的生物膜经戊二醛溶液交联,制备生物膜模板; (2) 将人半月板纤维软骨细胞置于培养箱(5% C02 , 37°C )进行培养,取第二代细胞用 F-12培养液(含10%小牛血清)制成细胞悬液; (3) 将经紫外线照射灭菌的生物膜干燥模板放入6孔培养板,加入上述细胞悬液并浸 没之,于37°C下置于恒温培养箱内振荡2h后,将培养板取出置于CO 2培养箱(5% CO2,37°C ), 培养2天,即为所需的人工半月板。
[0056] 实施例11膜间嵌镶 采用高压均质法在生物膜双分子层间镶嵌药物,具体如下: (1) 将实施例4中得到的细胞区室和维甲酸于65°C熔融,用高剪切分散乳化机高剪切 制得初乳; (2) 将初乳混入65 °C溶有吐温-80的蒸馏水后,高压均质15次循环,均质压力为 80MPa,自然冷却至室温,即为所需的包裹了维甲酸的药物载体。
[0057] 实施例12膜内包裹加靶向 采用PH梯度法在生物膜内进行药物包裹,并利用生物膜上的蛋白链接靶向因子,具体 如下: (1) 将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在0. 3mol/L柠檬酸 (pH=4)的水溶液中,然后减压旋转使得生物膜在容器壁上形成薄膜; (2) 用lmol/L的碳酸钠溶液调节上述得到的生物膜,并使混悬液的pH至7. 8,使得生 物膜内外形成质子梯度,可作为载体主动载药; (3) 在60°C条件下,将阿霉素溶解在lmol/L的HEPES缓冲溶液(pH=7. 8)中,形成阿霉 素的饱和溶液; (4) 将生物膜混悬液和阿霉素饱和溶液混合,在60°C条件下水浴孵化20min,将混合液 在80, OOOX g,60min,4°C条件下离心,弃上清,收集沉淀,即为所需的包裹了阿霉素的药物 载体; (5) 用亲和素标记靶向因子iRGD,并将上述载有阿霉素的生物膜载体修饰上生物素,通 过生物素-亲和素系统,将iRGD连接到载有阿霉素的生物膜载体上,即为所需的包裹了阿 霉素的药物载体,并具有靶向性。
[0058] 实施例13药物载体有益效果(提高药物/化妆品稳定性) (1) 将实施例8中获得的包裹了维生素 C的载体用5%Triton X-100在37°C轻轻摇晃 过夜破乳,并用体积比100倍的甲醇稀释; (2) 用高效液相色谱法对维生素 C进行含量测定,测算出载体中维生素 C含量为 8. 72% ; (3) 按8. 72%的维生素 C含量将维生素 C和载体简单混合作为对照和包裹了维生素 C 的载体分别保存在密封的无色玻璃瓶中,进行稳定性测试:光照射9d (强度30001x),每隔 两天取样测定两组维生素 C的含量变化; (4) 结果表明,被生物膜包裹的维生素 C稳定性明显高于混合物。
[0059] 实施例14药物载体有益效果(提高药物/化妆品溶解性) 采用超声乳化法在生物膜内进行药物包裹,具体如下: (1) 在4°C条件下,将紫杉醇溶解在乙醇中,形成饱和溶液; (2) 将上述紫杉醇饱和溶液和实施例5中得到的细胞区室混合,冰浴环境中用超声波 破碎仪超声乳化,超声探头的振幅为40%,工作30sec,间隔30sec,循环20次; (3) 将乳化液在100,000Xg,20min,4°C条件下离心,弃上清,收集沉淀,即为所需的包 裹了紫杉醇的药物载体; (4) 将上述获得的包裹了紫杉醇的药物载体用PBS重悬至lml,并用5%Triton X-100 在37°C轻轻摇晃过夜破乳,并用体积比100倍的甲醇稀释; (5) 用高效液相色谱法对紫杉醇进行含量测定,测算出Iml溶液中载体中紫杉醇含量 为 9. 1% ; (6) 将过量的紫杉醇原料投入到PBS缓冲溶液中,37°C轻轻摇晃,每隔一段时间取样测 定紫杉醇的含量变化,至浓度不再变化,采用高效液相色谱法,以外标对照法计算紫杉醇的 含量为6. Oug/mL ; (7) 结果表明,被生物膜包裹的紫杉醇的溶解度提高了 1500倍。
[0060] 实施例15药物载体有益效果(提高药物疗效) 采用逆向蒸发法在生物膜内进行药物包裹,具体如下: (1) 将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在4倍体积的氯仿 中,然后在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发(37°C,200rpm),除去氯仿; (2) 将利福平溶解在PBS中,加入乙醚溶解步骤(1)中的生物膜,并与上述利福平等体 积混合,置于50°C水浴孵育20min,即为所需的包裹了利福平的药物载体; (3) 将上述获得的包裹了利福平的药物载体用5%Triton X-IOO在37°C轻轻摇晃过夜 破乳,并用体积比100倍的甲醇稀释,用高效液相色谱法对利福平进行含量测定,测算出载 体中利福平含量为10. 2% ; (4) 取健康小白鼠20只,雌雄不限,体重25-35g,从尾静脉注入1. 75 X IO8菌落形成单 位(CFU)/mL的比7心结核杆菌混悬液0.1 mL使其感染,注射后14天,将小鼠随机分为A,B 两组,每组10只; (5) A组将上述获得的包裹了利福平的药物载体每三天静脉注射一次,每次10ul,B组 注射相同的利福平药物剂量作为对照; (6) 注射满三周后将小鼠处死,取脾脏匀浆培养于适当浓度的罗氏培养基斜面上,六周 后计算菌落数并算出CFU ; (7) 结果表明,被生物膜包裹的利福平较普通利福平治疗效果提高了一倍。
[0061] 实施例16药物载体有益效果(提高药物疗效,不同剂型) (1) 取健康新西兰白兔20只,雌雄不限,体重I. 5~2. 0kg,随机分为A,B两组,每组10 只; (2) 以3%的戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉后,于颞上象限剪开球结膜,行气体压迫玻 璃体术,即在角膜缘后3mm处以30号针头向玻璃体腔中央注入C 3F8气体0. lml,使气体膨 胀时将玻璃体压向周边,3d后,以同样方法麻醉后,在原进针口处以5-0丝线做一褥式预置 缝线,显微玻璃体视网膜刀刺穿巩膜,放出气体,注入L929细胞悬液,建立PV
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