乳后用高效液相色谱法对 苯乙基间苯二酚的进行含量测定，用PBS稀释至浓度为0. 5% ; (4) 选取一处IOcmXlOcm的皮肤，涂抹上述步骤（3)获得的包裹了苯乙基间苯二酚的 化妆品载体lml，每天涂抹，早晚各一次； (5) 如图2所示，结果表明，用生物膜包裹的苯乙基间苯二酚能长效美白。
[0075] 实施例30化妆品载体有益效果(提高功能性成分的透皮率） (1) 将大鼠用2. 5%戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉后，用电动剃刀小心剃去背部毛发，取下 已去毛的皮肤，剔除皮下脂肪和肌肉，制备好的离体鼠皮用打孔器制成直径22mm的皮肤样 本，置于Frnaz扩散池，表皮面向供给池，接受池体积为14. 5mL，有效渗透面积0. 785cm2,接 受液为0. 9%Nacl溶液； (2) 将生物膜通过静电表面吸附法吸附胶原蛋白加入到供给池中，相同含量的胶原蛋 白作为对照； (3) 实验过程中保持37°C恒温，接收池中有磁力搅拌器搅拌，搅拌速度200r/min，分别 在l、2、3、5、7、9h从接收池吸取200ul样本，同时立即补充相同体积的新鲜接受液； (4) 用荧光光度计测量样本荧光值，代入回归方程计算药物不同时段的透皮浓度； (5) 如图3所示，结果表明，用生物膜作为载体包裹胶原蛋白，能明显提高其透皮吸收 率。
[0076] 实施例31化妆品载体有益效果(提尚功能性成分的有效性） (1) 将B16黑色素细胞接种于6孔板，用DMEM完全培养基(含血清）在37°C，5% 0)2条 件下培养24h，弃上清； (2) 将实施例8中获得的包裹了维生素 C的载体加入到无血清的DMEM培养基中，并轻 轻混合均匀，普通维生素 C作为对照； (3) 将上述含有维生素 C载体的无血清DMEM培养液均匀的涂于B16黑色素细胞上，在 细胞培养箱中（37°C，5% CO2)培养3d后，弃上清，PBS洗涤，每孔加胰腺消化细胞5min，分 别对每组细胞计数； (4) 细胞悬液在20, OOOXg，15min，4°C条件下离心，弃上清，沉淀加 lmol/L NaOH溶液， 80°C加热30min，用分光光度计检测475nm下的吸光度； (5)通过公式：黑色素合成抑制率=【1-(药物孔吸光度值/药物孔细胞数)/(对照孔 吸光度值/对照孔细胞数)】X 100%，计算出实施例8中获得的包裹了维生素 C的载体黑色 素合成抑制率为38. 5%。（图4) 实施例32疫苗载体及佐剂有益效果(安全性） 为确定生物膜作为疫苗的载体或者免疫佐剂是否存在能引起过敏反应的物质，确保生 物膜疫苗接种的安全性，本发明进行了动物过敏试验。
[0077] (1)将实施例1，实施例2,实施例3,实施例4,实施例5中获得的生物膜分别接种 豚鼠，每组2只，每只豚鼠皮下接种lmL，间隔一周，皮下接种第二次，使豚鼠致敏，三周后 以相同样品每只静脉注射500ul ; (2)结果判定：静脉注射后，豚鼠全都没有出现烦躁不安、休克、或者死亡的现象，说明 注射物质对豚鼠并无过敏反应。
[0078] 实施例33疫苗的应用(预防病毒疫苗，皮下剂型） (1) 选取一批42d，健康、大小均匀的三元杂小猪头，随机分成A，B两组，每组20头； (2) 将实施例9中获得的包裹了猪瘟病毒的载体免疫A组，用市面上常规猪瘟疫苗免疫 B组作为对照，两组试验猪在相同的饲养管理条件下饲养，42d后逐头静脉采血3ml，分离血 清； (3) 血清进行猪瘟抗体ELISA的检测(如下表)，免疫率为95%。
[0079] 实施例34疫苗的应用（基因疫苗，肌肉注射剂型） (1) 选取比格犬10只，平均体重3kg (2. 5~3. 5kg)，雌雄不限，随机分为A，B两组，每组 3只； (2) 将包裹了犬瘟热病毒DNA质粒的生物膜肌肉注射A组，每只注射500ul质粒DNA 浓度为lug/ul的生物膜疫苗，B组注射相同DNA浓度的犬瘟热病毒DNA质粒作为对照，每 隔两周注射一次疫苗； (3) 第三次免疫两周后用双抗处理过的犬瘟热发病犬脑组织匀浆1:10的稀释液，对所 有实验犬进行2ml每只的攻毒实验，其中Iml滴鼻，Iml为肌肉注射； (4) 攻毒后每天测其直肠温度，详细记录实验犬的发病和死亡情况，观察动物的临床症 状变化； (5) 攻毒后B组2只实验犬出现死亡情况，剩下1只出现轻微神经症状，最高体温达 41°C，然后慢慢转归正常。生物膜注射组体温也出现不同程度的升高，最高达39. 4°C，但没 有出现神经症状以及死亡； (6) 结果表明，生物膜作为基因疫苗的载体和免疫佐剂有很强的免疫效果。
[0080] 实施例35疫苗的应用（肿瘤疫苗，口服剂型） (1) 取健康小鼠10只，雌雄不限，体重18-22g，随机分为A，B两组，每组5只； (2) 免疫及接种前，小鼠禁食水12小时以上，接种前30min先经口喂饲150ul 0.0 lmol/ L NaHCO^液以中和胃酸，将包裹了幽门杆菌重组蛋白的生物膜载体疫苗经口喂饲A组，每 只饲喂IOOul幽门杆菌重组蛋白浓度为IOul的生物膜疫苗，B组饲喂IOOul PBS，其中含 幽门杆菌重组蛋白IOul作为对照； (3) 实验组及对照组在第0、7、14、21天各免疫一次，免疫1小时后恢复食水，距末次免 疫2周后(第35天）各组均用IO8 CFU/次的幽门杆菌攻击，隔日一次，共三次，距末次攻击 4周后处死小鼠； (4) 处死小鼠后立即剖腹取胃、取脾脏，沿大弯侧剪开，以无菌生理盐水冲洗胃内容物， 沿纵轴取胃组织，涂片后置96孔板行快速尿素酶试验； (5) 尿素酶试验显示，生物膜疫苗组和对照组比较，能有效的保护实验鼠不受幽门杆菌 的感染，由于幽门杆菌的感染是胃癌、胃粘膜组织淋巴瘤等疾病的重要致病因素，因此，使 用生物膜作为幽门杆菌重组蛋白的疫苗载体和佐剂能有效的预防胃癌等疾病。
[0081] 实施例36疫苗载体及佐剂有益效果(强效体液免疫性） 同实施例33 实施例37疫苗载体及佐剂有益效果(强效细胞免疫性） (1) 将实施例35中获得的小鼠脾脏进行脾淋巴细胞INF-γ和IL-4 mRNA的表达进行 比较； (2) 结果显示，使用生物膜作为幽门杆菌重组蛋白的疫苗载体和佐剂，小鼠脾淋巴细胞 出现以Thl细胞（INF-γ)为主的增生，INF-γ水平较对照组比较有显著性差异。
[0082] 实施例38人造器官的应用 (1) 选取2月龄比格犬10只，平均体重2. 5kg (2~3kg)，雌雄不限，随机分为A，B两组， 每组5只； (2) 将比格犬右膝从外侧切开膝关节囊，不切断侧副韧带，在外侧半月板上作一三角形 缺损(底边在周缘、尖端向内至半月板体部宽度的一半)，再于缺血区作一纵行缺损； (3) A组将实施例10中获得的人工半月板植入缺损，B组将市面上获得的以胶原为支 架的人工半月板植入缺损作为对照，两组都以5-0可吸收线缝合固定，完毕后缝合切口，术 后笼养； (4) 术后于12周处死动物，取膝关节标本观察：A组可见缺损处愈合良好，缺损区有白 色的新生组织生长，其质地、色泽与周围正常的半月板组织相似其无明显的分界，B组可见 植入物周边质地、色泽与正常半月板相近，缺损区可见白色纤维瘢痕样组织，相对应的股骨 及胫骨关节面略显粗糙。
【主权项】
1. 生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为疫苗载体或免疫调节剂的应用； 所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室为天然来源和/或自组装技术得到， 生物来源为动物、植物或微生物，所得到的生物膜是完整的或者是片段的，形态上为呈脂质 双分子层结构，其组成成分主要是脂质和蛋白质，另有少量糖类通过共价键结合在脂质或 蛋白质上。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构 或细胞区室，粒径从IOnm到几十微米。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构 或细胞区室的形状包括球状、囊泡状、杆状、螺旋状的单层或者多层、多室的多种形态结构。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的生物膜包括质膜、核膜、线粒体膜、 内质网膜、溶酶体膜、高尔基体膜、叶绿体膜和液泡和过氧化酶体膜一种或多种。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的细胞区室是指一般的细胞器；作为 优选，所述的细胞区室为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、溶酶体、内质网、细胞核、高尔基体 及囊泡和微管的一种或多种。6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用包括疫苗或免疫调节剂活性 成分的膜内包裹、膜内包裹、表面吸附、表面交联、膜间嵌镶和膜内包裹加靶向。7. -种疫苗或免疫调节剂组合物，其特征在于：该组合物包括疫苗或免疫调节剂活性 成分和生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，生物膜、具有生物膜性的闭合结构或 细胞区室，使用量为1~99%。8. 根据权利要求7所述的疫苗或免疫调节剂组合物，其特征在于：使用量为10~80%。9. 根据权利要求7或8所述的疫苗或免疫调节剂组合物，其特征在于：疫苗或免疫调 节剂活性成分包括蛋白、核酸、合成肽、细胞因子、细菌、病毒中的一种或多种。10. 根据权利要求7或8所述的化妆品组合物，其特征在于：疫苗或免疫调节剂活性成 分包括感染性疾病的预防性疫苗、感染性疾病的治疗性疫苗、肿瘤的预防性疫苗、肿瘤的治 疗性疫苗、自身免疫病疫苗中的一种。
【专利摘要】本发明涉及到生物膜、具有生物膜性的闭合结构和细胞区室作为疫苗载体或免疫调节剂的应用，该生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室为天然来源和/或自组装得到，生物来源为动物、植物或微生物，所得到的生物膜是完整的或者是片段的，形态上为呈脂质双分子层结构，其组成成分主要是脂质和蛋白质，另有少量糖类通过共价键结合在脂质或蛋白质上。本发明生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为疫苗载体及免疫调节剂，具有以下优势：安全性高、多功能性、复合型性、高效体液免疫性、强效细胞免疫性、缓释性。
【IPC分类】A61K38/00, A61K39/00, A61P37/02, A61P31/00, A61K47/46
【公开号】CN104984359
【申请号】CN201510283138
【发明人】高颖, 姚震祥, 王旻子, 魏建良
【申请人】杭州优玛达生物科技有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年5月28日