一种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白在制备治疗或预防ev71感染药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗病毒药物领域，涉及同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白 (homocysteine-induced endoplasmic reticulum protein, HERP)(GenBank accession no. NM_001010989)的新用途，更具体涉及一种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白在制备治疗 或预防肠道病毒71型（EV71)病毒感染药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸（小RNA)病毒科 (Picornaradae)肠道病毒属（Enterovirus)，是一个正链的单链RNA病毒。EV71是引起婴 幼儿手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD)最主要的病原体之一，严重的EV71 感染还能引起一些神经系统疾病，比如脑干脑炎、无菌性脑膜炎和急性弛缓性瘫痪等。自 1969年EV71首次被发现并于1974年首次分离获得，EV71已在世界各地婴幼儿中引起了大 规模的手足口病暴发流行，包括美国、欧洲和亚太地区都出现过EV71疫情的暴发，中国台 湾从1998年开始就出现了 EV71疫情。而其因为中枢神经系统导致的并发症和随之而来的 高死亡率，引起了世界各国的高度警惕和关注。最近几年EV71感染在中国暴发频繁，对人 体健康和公共安全都造成了巨大的威胁。
[0003] 在中国暴发流行的EV71病毒导致的手足口病主要是EV71病毒的C4亚型，并且存 在EV71和柯萨奇病毒（CVA16)的混合感染和周期性暴发。虽然在中国引起暴发的病毒致死 率并不高，但是其高暴发率仍然需要警惕。而且，迄今为止仍然没有针对EV71病毒开发的 安全有效的抗病毒感染药物或者疫苗获准上市。除了天然产品或者化合物以外，针对EV71 病毒的复制特点和生活周期，开发药物主要有以下策略和分子靶标。
[0004] 中和抗体：EV71病毒的单克隆抗体，通过EV71病毒的类病毒颗粒感染小鼠，获得 病毒的单克隆抗体，能特异性地与EV71病毒结合，改变病毒的结构，诱导病毒基因组的释 放，从而阻断病毒对宿主细胞的感染。
[0005] 针对病毒入侵：阻止病毒入侵细胞是抗病毒的一个有效策略。一些药物在感染细 胞之前与EV71病毒颗粒共同孵育，通过结合EV71病毒的衣壳结构，阻止病毒与细胞受体之 间的结合，能明显降低病毒的入侵和子代病毒的产生。这些药物能够结合EV71病毒颗粒， 通过阻止病毒结合配体、阻断入侵、抑制EV71病毒脱壳等，通过结合衣壳蛋白上的特定结 构来进行开发。
[0006] 针对病毒蛋白：EV71病毒的结构蛋白VP1，非结构蛋白2A和3C在病毒的结合和复 制过程中都有重要的作用，因此一些特异性的小分子药物被开发出来，这些药物能特异性 的结合病毒蛋白（如VP1)，或者抑制非结构蛋白的蛋白酶活性（如2A和3C)。
[0007] 针对病毒复制复合体：病毒的复制需要依赖3D聚合酶组成的RdRP复制复合体，因 此，抑制了 3D聚合酶的复制活性，也就达到了抑制病毒基因组复制的目的，从而阻断病毒 的感染进程。
[0008] 针对病毒翻译：由于EV71病毒的基因组RNA没有5'端帽子结构，其复制依赖于 IRES元件，并收到ITAFs的调控，而据报道，FBP2蛋白能够竞争性的结合ITAFs中的PTB， 从而抑制IRES活性，从而实现抑制EV71病毒的复制和翻译的效果。
[0009] 此外，还有其他一些方式可能能够抑制EV71病毒的复制，比如RNA干扰、调节宿主 的免疫系统和运用干扰素治疗等。
[0010] HERP 蛋白又被称作 SUP (Stress-associated Ubiquitin-like Protein)， Mifl(methyl methanesulphonate(MMS)_inducible fragmentl)或 HERPUD1，编码 39I 个 氨基酸。HERP蛋白的表达受到内质网应激反应的调控，内质网应激调控HERP中有多种 顺式元件和调控因子参与，能被同型半胱氨酸引起的未折叠蛋白反应激活，并且由于其 定位在内质网上，因此被称为同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白（homocysteine-induced endoplasmic reticulum protein, HERP)。在衣霉素处理、渗透压休克和紫外线照射下，同 样会促进其表达。
[0011] HERP是一个定位在内质网上的泛素样膜蛋白，HERP蛋白编码391个氨基酸，在其 N末端具有一个泛素化类似的结构域（ubiquitin-like domain, UBL domain)，包含N末端 的1-87位氨基酸，并且具有泛素化功能。HERP的240-391位氨基酸则构成C端，其中包含 跨膜区域，使ffiRP蛋白定位在内质网膜上，其N末端和C末端均在内质网的细胞质面。
[0012] HERP的功能包括参与蛋白质降解、维持Ca2+体内平衡，并与某些疾病相关。几乎 所有的人体组织中都能检测到HERP蛋白的存在。HERP蛋白能被未折置蛋白反应等引起的 内质网应激反应上调，并参与保护细胞应对内质网应激。目前的研究发现HERP是泛素家族 的一员，它的功能之一是运送内质网相关的蛋白质降解（ERAD)底物，将泛素化底物运输到 26S蛋白酶体中降解。
[0013] 在内质网应激反应中，HERP蛋白还能帮助细胞维持Ca2+体内平衡。在神经细胞中， JERP能受到内质网应激调控，当内质网应激反应引起细胞凋亡时，JERP能稳定内质网中的 Ca2+水平、保护线粒体功能和抑制caspase3的活性，降低内质网压力，从而提高细胞的生 存能力，避免发生细胞凋亡。
[0014] 在帕金斯病人黑质和路易小体中，HERP的表达量明显升高，提示其在神经退化及 神经炎症中的作用，在帕金斯症中HERP能依赖泛素-蛋白酶体降解途径维持Ca 2+平衡和防 止细胞凋亡。而在二型酒精中毒患者中，受到酒精毒性影响，JERP的mRNA水平在神经保护 细胞中也明显上升。系统性红斑狼疮中的相关研究表明，JERP也有抗脱氧核糖核酸反应的 能力。但是，目前还没有HERP与病毒性疾病及相关病毒之间关系的文献报导，也没有HERP 对现在较为流行且致病力较强的肠道病毒71型（EV71)的预防与治疗作用的报道。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是在于提供了一种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白（HERP)在制备 治疗或预防肠道病毒71型（EV71)药物中的应用。从细胞和分子层面对同型半胱氨酸诱导 的内质网蛋白（HERP)抗EV71病毒作用进行了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基 础。本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0016] -种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白在制备治疗或预防EV71感染药物中的应 用，其步骤是：
[0017] A、利用pCMV_Tag_Flag2B载体（哺乳动物表达载体，Agilent Technologies)构 建pCMV-HERP质粒。
[0018] B、在对EV71病毒敏感的人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞（rhabdomyosarcoma，RD细 胞，中国典型培养物保藏中心（武汉大学）（CCTCC)获得）中过表达了构建的pCMV-HERP表 达质粒，24小时后用一定量的EV71病毒感染。EV71病毒的VPl结构蛋白和3C非结构蛋白 作为EV71病毒复制的检测标志物，并针对VPl蛋白基因设计了荧光定量检测引物。
[0019] C、时间梯度实验，转染空载pCMV-Tag-Flag2B载体和pCMV-HERP质粒24小时后分 别感染EV71病毒4小时、8小时、12小时和24小时后收样提取总RNA并检测VPl的mRNA 水平，同时检测病毒蛋白水平。
[0020] 上述结果表明：过表达HERP蛋白能够明显抑制EV71病毒VPl的mRNA水平，并且 随着HERP质粒浓度的提高呈现梯度降低的剂量依赖效应。免疫印迹实验也显示了 VPl和 3C蛋白的表达水平也随着HERP蛋白表达量的提高而降低。
[0021] 未感染病毒的对照组没有明显区别，而感染了病毒并过表达HERP蛋白的实验组 与空载相比，在不同的时间点均不同程度的抑制了病毒的复制。随后检测了 VPl和3C蛋白， 并得到了与mRNA水平类似的结果
[0022] 本发明发现了同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白新的药用价值，为抗肠道病毒71 型、治疗和/或预防EV71感染提供了新的有效药物。
[0023] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0024] 本发明从细胞和分子层面对同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白（HERP)抗EV71病毒 作用进行了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基础。表明该药物具有开发成抗EV71 病毒的有效药物而应用于临床的前景。
【附图说明】
[0025] 图1为一种HERP蛋白抑制EV71病毒VPl的mRNA水平（* :p〈0. 5,差异显著；: p〈0. 05,差异极显著）不意图。
[0026] 随着pCMV-HERP表达载体转染浓度的升高，EV71的mRNA水平呈现剂量依赖性的 抑制效果。
[0027] 图2为一种HERP蛋白抑制EV71病毒VPl和3C蛋白表达示意图。
[0028] 随着pCMV-HERP表达载体转染浓度的升高，EV71的VPl蛋白和3C蛋白水平呈现 剂量依赖性的抑制效果。
[0029] 图3为一种不同时间梯度的HERP蛋白抑制EV71病毒的mRNA水平（ns.:无显著 性差异；*:P〈〇.5,差异显著；** :p〈0. 05,差异极显著）不意图。
[0030] 在不同的病毒感染时间下，随着pCMV-HERP的过表达，EV71的mRNA水平呈现明显 的抑制效果。
[0031] 图4为一种不同时间梯度的HERP蛋白抑制EV71病毒的蛋白表达（h p. i.:感染 后时间）示意图。
[0032] 在不同的病毒感染时间下，随着pCMV-HERP的过表达，EV71的VPl蛋白和3C蛋白 水平呈现明显的抑制效果。