【具体实施方式】
[0033] 以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本 发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段。
[0034] 实施例1 :
[0035] -种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白质粒载体的制备，其步骤是：
[0036] A、同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白（HERP)基因载体构建：
[0037] 克隆同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白基因：以HEK293T细胞（中国典型培养物保 藏中心（武汉大学）（CCTCC)获得）cDNA作为模板PCR扩增出HERP全长基因序列，先通过 反转录PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整HERP基因片段。引物 如下：
[0038]Pl (正向引物）：5' -GAAITCATGGAGTCCGAGACCGAACCCGA-3'，酶切位点 EcoRI ;
[0039] P2 (反向引物）：5' -GTCGACTCAGITTGCGATGGCTGGGGGG-3'，酶切位点 Sail。
[0040] 通过EcoRI和Sail酶切、T4连接酶将HERP基因克隆连接到pCMV-Tag-Flag2B质 粒载体（哺乳动物表达载体，Agilent Technologies)上，得到pCMV-HERP质粒。
[0041] 实施例2:
[0042] -种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白在抗EV71病毒感染中的应用，其步骤是：
[0043] A、不同浓度的同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白抗EV71病毒的作用：
[0044] IOml细胞培养瓶经24h培养对EV71病毒敏感的人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞 (rhabdomyosarcoma，RD细胞）长满单层时（MEM培养基+10 %胎牛血清培养），倾弃培养 液，加入1ml胰酶消化，加入12ml MEM培养基+10% (体积比）胎牛血清的培养基传至6 孔无菌细胞培养板中，每孔2ml，置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养12h，使细胞生长成 单层，弃上清。加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的质量分别为0.1 、I、1. 5、2、3 y g的 pCMV-HERP 质粒，孵育 24h 后用 EV71 病毒感染，感染复数（multiplicities of infection， M0I)为5,12h后收样检测，分别用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)和免疫印迹（Western Blot)检测EV71病毒的mRNA水平和蛋白水平（其中Realtime PCR以GAPDH作为内部参 照，引物序列为正向5' -AAGGCTGTGGGCAAGG，反向5' -TGGAGGAGTGGGTGTCG ;VP1引物序列为 正向 5' -AAITGAGTTCCATAGGTG，反向 5' -CTGTGCGAAITAAGGACAG ;EV71 VPl 抗体购自 Abnova 公司，3C抗体购自Abgent公司，HERP抗体购自Abcam公司，GAPDH抗体购自三鹰公司），如 图1和图2,过表达HERP蛋白能够明显抑制EV71病毒VPl的mRNA水平，并且随着HERP质 粒浓度的提高呈现梯度降低的剂量依赖效应（图1)。免疫印迹实验也显示了 EV71病毒的 VPl和3C蛋白的表达水平也随着HERP蛋白表达量的提高而降低（图2)。EV71病毒蛋白的 mRNA水平和蛋白质水平梯度下降，说明不同浓度的同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白具有抗 EV71病毒的作用。
[0045] B、处理不同时间的同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白抗EV71病毒的作用：
[0046] IOml细胞培养瓶经24h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）长满单层时 (MEM培养基+10 %胎牛血清培养），倾弃培养液，加入1ml胰酶消化，加入12ml MEM培养基 +10% (体积比）胎牛血清的培养基传至6孔无菌细胞培养板中，每孔2ml，置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养12h，使细胞生长成单层，弃上清。分别加入用无血清的MEM细胞培 养液稀释的质量为2 y g的对照空载质粒和pCMV-HERP质粒，孵育24h后用EV71病毒分别 感染4小时、8小时、12小时和24小时，病毒感染复数为5,收样后分别用Realtime PCR和 Western Blot检测EV71病毒的mRNA水平和蛋白水平，如图3和图4,未感染病毒的对照组 没有明显区别，而感染了病毒并过表达HERP蛋白的实验组与空载相比，在不同的时间点均 不同程度的抑制了病毒的复制（图3)。申请人随后检测了 VPl和3C蛋白表达水平，并得到 了与mRNA水平类似的结果（图4)。这些结果表明不同时间处理后的同型半胱氨酸诱导的 内质网蛋白具有抗EV71病毒的作用。
[0047] 实施例3 -种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白在制备治疗或预防EV71感染药物 中的应用，其步骤是：
[0048]A、同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白对EV71病毒感染的治疗作用
[0049] 经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）长满单层时（MEM培养 基+10 %胎牛血清培养），倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔 l〇〇yL，置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。加入用 无血清的MEM细胞培养液稀释的病毒，感染剂量为MOI = 5,每孔100 y L，孵育Ih后弃去 上清液。将HERP蛋白分别以0. 25、0. 5、1、I. 5 y g/ml浓度转染到细胞中，同时设立细胞对 照孔（不加病毒不加药，只加培养液）和病毒对照孔（不加药，加病毒，加培养液）。置于 37°C、5%C02细胞培养箱中培养24h，加入20 y L/孔CellTiter __ AQueous One Solution Reagent继续孵育4h，终止培养。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值， 记录结果，并根据公式计算细胞存活率：细胞存活率（％) = (HERP处理组OD值一病毒对 照组OD值）八细胞对照组00值一病毒对照组00值）乂100%。结果见表1。
[0050] 表1 HERP对EV71病毒感染的治疗作用
[0051]
[0052] 结果表明，细胞感染EV71病毒后加入同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白，其存活率 明显高于病毒对照组，并且随着JERP蛋白转染浓度的升高，其病毒抑制率也逐渐升高，表 明同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白对EV71病毒具有较好的治疗作用。
[0053] B、同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白对EV71病毒感染的预防作用
[0054] 经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）长满单层时（MEM培养 基+10 %胎牛血清培养），倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔 100 y L，置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。将终浓 度为I y g/ml的HERP质粒分别转染细胞4、8、12和24h，并设立细胞对照孔（不加病毒不加 药，只加培养液）和病毒对照孔（不加药，加病毒感染剂量为MOI = 5,加培养液）。HERP质 粒转染达到上述时间后，弃去上清，加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的病毒，感染剂量 为MOI = 5,置于 37°C、5% (：02细胞培养箱培养 24h，加入 20 y L/ 孔 CelITiter 96? AQueous One Solution Reagent继续孵育4h，终止培养。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测 定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式计算细胞存活率：细胞存活率（％) = OERP处理 组OD值一病毒对照组OD值）八细胞对照组00值一病毒对照组00值）乂100%。结果见表 2〇
[0055] 表2 HERP对EV71病毒感染的预防作用
[0056]
[0057] 结果表明，细胞在同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白提前转染后，再被病毒感染，其 存活率明显高于病毒对照组，并且随着HERP转染时间的逐渐升高，对EV71的感染的预防作 用越为明显，上述数据显示同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白具有预防EV71病毒感染的作 用。
【主权项】
1. 一种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白在制备治疗或预防EV71感染药物中的应用， 其步骤是： A、 利用 pCMV-Tag-Flag2B 载体构建 pCMV-HERP 质粒； B、 在对EV71病毒敏感的人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞中过表达了构建的pCMV-HERP表 达质粒，24小时后用一定量的EV71病毒感染，EV71病毒的VPl结构蛋白和3C非结构蛋白 作为EV71病毒复制的检测标志物，并针对VPl蛋白基因设计了荧光定量检测引物； C、 时间梯度实验，转染空载pCMV-Tag-Flag2B载体和pCMV-HERP质粒24小时后分别感 染EV71病毒4小时、8小时、12小时和24小时后收样提取总RNA并检测VPl的mRNA水平， 同时检测病毒蛋白水平。
【专利摘要】本发明公开一种同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白在制备治疗或预防EV71感染药物中的应用，其步骤是：A.利用pCMV-Tag-Flag2B载体构建pCMV-HERP质粒；B.EV71病毒的VP1结构蛋白和3C非结构蛋白作为EV71病毒复制的检测标志物，并针对VP1蛋白基因设计了荧光定量检测引物；C.时间梯度实验。表达HERP蛋白能够明显抑制EV71病毒VP1的mRNA水平，随着HERP质粒浓度的提高呈现梯度降低的剂量依赖效应。免疫印迹实验也显示了VP1和3C蛋白的表达水平也随着HERP蛋白表达量的提高而降低。
【IPC分类】A61P31/14, A61K38/17
【公开号】CN105031612
【申请号】CN201510398925
【发明人】吴建国, 邬开朗, 葛茂林, 乔智, 罗震, 谭秋萍, 刘芳
【申请人】武汉胜达康生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月8日