氢气饱和生理盐水的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及氢气饱和生理盐水的新用途，具体地说，是氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。
【背景技术】
[0002]动脉粥样硬化(AS)是一个稳定期与不稳定期交替的非线性过程，这一过程取决于斑块的稳定性和易损性。相较于斑块的早期形成，对斑块稳定性的研究越来越受到人们的重视。AS晚期不稳定斑块(易损斑块)的破裂是引起急性冠脉综合征、急性脑梗死等心脑血管病急症的主要原因。而不稳定斑块的特征是:大的细胞外脂质池、薄的纤维帽、巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润等。大量细胞凋亡尤其巨噬细胞凋亡是导致易损斑块形成，影响其稳定性的重要因素。在AS进展过程中，巨噬细胞凋亡不仅直接导致凋亡的平滑肌细胞和巨噬细胞不能被有效吞噬，促进脂质核心的形成及增大，而且富含游离胆固醇的凋亡巨噬细胞通过释放基质降解蛋白酶损伤纤维帽，并产生肿瘤坏死因子-α、白介素-1 β，引起继发性炎症反应和坏死，从而促进斑块不稳定。因此目前认为干预巨噬细胞凋亡过程可能对阻止AS进展、阻止已形成的斑块破裂、降低心脑血管病事件发生率具有重要意义。
[0003]大部分生物学家一直认为，氢气属于生理性惰性气体。最近的研究发现，氢气不仅不是生理性惰性气体，而是一种良好的选择性抗氧化物质，对许多疾病具有显著治疗作用。2007年7月，1.0hsawa等在《自然医学》报道，动物吸入2%的氢气，可清除自由基，改善脑缺血再灌注损伤，作用基础是氢气可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子。该研究迅速引起广泛关注，并引起了研究氢气治疗疾病的热潮。随后，有人又用肝和心肌缺血动物模型，证明呼吸2 %的氢气可治疗肝和心肌缺血再灌注损伤。采用饮用饱和氢气水可治疗应激引起的神经损伤、人类2型糖尿病、小鼠基因缺陷慢性氧化应激损伤、化疗药顺铂引起的肾损伤和帕金森病。呼吸2%的氢气可治疗小肠移植引起的炎症损伤，对小肠缺血和心脏移植后损伤同样具有保护作用。上海第二军医大的研究报道呼吸2%的氢气可治疗新生儿脑缺血缺氧损伤。申请人的研究证实，腹腔注射饱和氢气生理盐水能够降低仓鼠血浆低密度脂蛋白胆固醇水平并改善高密度脂蛋白功能。上述研究表明，作为选择性抗氧化物质，氢气对很多疾病具有治疗作用，具有十分广泛的应用前景。申请人发表在”动脉粥样硬化(Atherosclerosis) ”杂志上的科学发现和日本学者Ohsawa等的报道均表明:氢分子在载脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)鼠模型中具有明确的抗早期AS作用，能抑制AS斑块处的炎症反应和巨噬细胞聚集，但氢气分子是否能影响已形成的晚期动脉粥样硬化斑块的稳定性仍未阐明。鉴于氢气的抗凋亡特性，本申请利用与人脂质谱接近的低密度脂蛋白受体敲除(LDLR7 )小鼠，研究了氢气对动脉粥样硬化斑块稳定性及对斑块处巨噬细胞凋亡的影响。
[0004]中国专利公开号CN101347451A公开了一种具有治疗缺血再灌注损伤功能的含氢注射液，该发明是一种可用于治疗脑、心、肾等组织器官缺血再灌注损伤的注射液。制备方法为:将医用注射液软包装袋置于低压下脱气处理，抽除气体后进行低温预处理，再注入氢气进行加压助溶，使氢气溶于注射液，在常压4°C左右保存备用，稳定24小时后就可使用。但是关于氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用目前还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明针对以上不足之处，提供了一种氢气饱和生理盐水的新用途，氢气饱和生理盐水通过减少斑块内脂质和巨噬细胞含量及炎症反应，增加斑块内胶原含量，从而增加斑块稳定得分，防止其破裂。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种氢气饱和生理盐水的应用，氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。
[0007]氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块保健品中的应用。
[0008]所述氢气饱和生理盐水的制备方法为:生理盐水在0.5 MPa压力下加压暴露4h,将纯氢气溶解于无菌生理盐水中达到饱和水平，4°C贮存于移除气体的密封生理盐水袋中备用。
[0009]所述氢气饱和生理盐水维持氢气浓度不低于0.6 mM，一周内配制使用均可达到此浓度。
[0010]本发明优点在于:提供了氢气饱和生理盐水的新用途，首次揭示了氢气饱和生理盐水除抑制动脉粥样硬化斑块形成外，还可使其稳定，不易破裂；氢生理盐水制备简单、注射浓度高、使用方便且无爆炸风险，成本很低，且无副作用，从动物实验的结果来看具有良好的治疗优势，大大减少易损斑块患者药物副作用风险，并大大降低医疗成本。
【附图说明】
[0011 ] 图1所示为:主动脉斑块病变分析结果；
图2所示为:斑块稳定得分；
图3所示为:主动脉斑块MMP-9免疫荧光组织化学分析结果；
图4所示为:主动脉斑块⑶83和FoxP3免疫荧光组织化学分析结果；
图5所示为:实时荧光定量PCR结果；
图6所示为:TUNEL染色结果；
图7所示为:免疫印迹；
图8所示为:主动脉斑块BIP和CHOP免疫荧光组织化学分析。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0013]材料和方法
1.1动物和实验设计
80只8-9周龄雄性LDLR7小鼠随机分成5组，每组16只。分别为:
阴性对照组(溶媒组，Control),
饱和氢气生理盐水低剂量组(0.5 ml/kg/d, H2-L),
饱和氢气生理盐水高剂量组(5 ml/kg/d, H2-H)、
阳性对照辛伐他汀组(5 mg/kg/d, Sim (5))、
联合用药组(低剂量氢气和2.5 mg/kg/d辛伐他汀，H2-L + Sim (2.5))。
[0014]适应性喂养I周后，给予尚脂(15.8%)、尚胆固醇(1.25%)饮食，自由饮水。氣气生理盐水腹腔注射给药，辛伐他汀灌胃给药，持续28周。
[0015]氢气饱和生理盐水的制备
在0.5 MPa压力下加压暴露4 h,将纯氢气溶解于正常无菌生理盐水中达到饱和水平，4°C贮存于移除气体的密封生理盐水袋中。所用氢气饱和生理盐水均为I周内配置，以维持氢气浓度不低于0.6 mM。
[0016]病变分析
主动脉根部靠近心底的部位用于连续冰冻切片的制作。冰冻切片的厚度为8 μπι，切片开始的部位为主动脉根部主动脉瓣开始出现处，每间隔16 μm收集一张切片，直至主动脉瓣膜完全消失。分别采用不连续切片的油红O染色和Trichrome染色(Sigma, HT15)确定斑块脂质核心和胶原面积；利用抗SMC抗体