(Abeam, ab5694)、抗M0MA-2 (Serotec,MCA519G)抗体和抗MMP-9抗体(Santa Cruz, sc-6840)进行免疫荧光染色检测斑块处平滑肌细胞、巨噬细胞含量和金属基质蛋白酶-9表达。所有的定量分析数据均使用Image-ProPlus软件并用抗体的阳性面积和斑块面积的百分比显示数据结果。斑块稳定得分计算方法为:(平滑肌细胞面积+胶原面积)/ (巨噬细胞面积+脂质面积)。
[0017]免疫荧光组织化学分析
主动脉根部的连续冰冻切片分别用特异性抗体(Bip抗体、CHOP抗体、CD83抗体、M0MA-2抗体和FoxP3抗体来自Abeam)进行染色，荧光二抗孵育后Olympus显微镜采集图片。数据定量分析中使用颜色设定和面积求法。所有的定量分析数据均使用Image-ProPlus软件并用抗体的阳性面积和斑块总面积的百分比显示数据结果。
[0018]染色
动脉粥样硬化斑块处凋亡细胞数目采用TUNEL染色法检测。利用试剂盒(Roche，USA)根据说明书进行操作。
[0019]实时荧光定量PCR
TRIZOL法提取全长主动脉RNA后，利用MuLV反转录酶(Applied B1systems)合成第一链cDNA。采用SYBR-green PCR master mix试剂盒(北京天根)和Rotor-gene Q仪器(德国凯杰)进行实时荧光定量PCR反应。2 Dret相对定量法进行数据分析。
[0020]免疫印迹
全长主动脉组织蛋白提取后上样SDS-PAGE，采用抗BCL2和抗cleaved caspase_3抗体(Abeam)进行蛋白的免疫印记(western blot)分析。蛋白的观察和量化分析采用化学发光法(Pierce)和 Quantity One (B1-Rad)软件系统。
[0021]统计学分析
统计学分析用GraphPad Prism programme ver.4.0进行单因素方差分析检验。结果显示为平均值土标准偏差。P值小于0.05为有显著性差异。
[0022]结果
2.1饱和氢气生理盐水增加动脉粥样硬化斑块稳定性
请参照附图1，组织切片油红O染可见，对照组斑块内有丰富的红染区域(图1)，表明高脂喂养后小鼠主动脉斑块内脂质(Iipid)含量增多，斑块变得不稳定；抗巨噬细胞(M0MA-2)抗体免疫染色结果显示(图1)，对照组阳性染色比例高，表明斑块内含大量巨噬细胞，符合不稳定斑块的特征。而氢气干预后显著减少动脉粥样硬化斑块处脂质(Iipid)和巨噬细胞(Mac)聚积，同时增加胶原(Collagen)含量(图1)，由此，动脉粥样硬化斑块趋向于稳定，稳定得分增加(图2)。同时，与对照组相比，主要由巨噬细胞分泌且在斑块稳定性中起重要作用的金属基质蛋白酶-9的表达显著减少(图3)，进一步验证了氢气可增加斑块稳定性。值得一提的是，低剂量联合用药组可发挥与高剂量氢气或高剂量辛伐他汀相似的保护作用(图1-图3)，说明联合应用氢气和辛伐他汀可增强疗效，或许可为减少他汀类药物副作用提供新途径。
[0023]饱和氢气生理盐水减少斑块内⑶83+树突状细胞并增加FoxP3+调节T细胞含量已有报道证实动脉粥样硬化斑块稳定性与斑块内调节T细胞(Treg)数目呈正相关且与成熟树突状细胞(DC)数目呈负相关。本研究发现，与对照组相比，氢气干预后斑块内CD83+ DCs显著减少而Foxp3+ Treg显著增加(图4)。PCR结果显示，氢气组DC成熟标志物mRNA水平下降而Treg相关基因mRNA水平表达增加(图5)，同时，氢气干预后，动脉壁上DC分泌的促炎因子mRNA水平下降而Treg分泌的抗炎因子水平升高。以上发现进一步证实氢气可增加动脉粥样硬化斑块稳定性。
[0024]氢气饱和生理盐水减少动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡和内质网应激反应
巨噬细胞凋亡在动脉斑块稳定中起重要作用，基于此，我们利用TUNEL法检测了斑块处细胞凋亡情况。结果显示，与对照组相比，氢气可显著减少斑块处凋亡细胞的比例(图6)。免疫印迹结果显示，氢气干预后，动脉壁上凋亡标志蛋白Bcl-2表达上调，cleavedcaspase-3表达下降(图7)，进一步证实了氢气的抗凋亡作用。以上数据提示氢气可能通过减少动脉斑块处细胞凋亡而发挥其稳定斑块的作用。
[0025]已有报道内质网应激反应在巨噬细胞凋亡过程中起重要作用，基于此，我们检测了斑块处内质网应激相关蛋白的表达。免疫荧光结果显示，与对照组相比，氢气干预后Bip和CHOP表达显著下调(图8)。鉴于内质网应激-CHOP信号途径在细胞凋亡过程中的重要作用，我们的结果提示，氢气干预后斑块处减少的内质网应激反应可能是氢气抑制斑块处细胞凋亡的机制。
[0026]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
[0027]当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种氢气饱和生理盐水的应用，其特征在于:氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。2.根据权利要求1所述的氢气饱和生理盐水的应用，其特征在于:氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块保健品中的应用。3.根据权利要求1-2所述的氢气饱和生理盐水的应用，其特征在于:所述氢气饱和生理盐水的制备方法为:生理盐水在0.5 MPa压力下加压暴露4 h,将纯氢气溶解于无菌生理盐水中达到饱和水平，4°C贮存于移除气体的密封生理盐水袋中备用。4.根据权利要求1-2所述的氢气饱和生理盐水的应用，其特征在于:所述氢气饱和生理盐水维持氢气浓度不低于0.6 mM。
【专利摘要】本发明涉及氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。本发明优点在于：提供了氢气饱和生理盐水的新用途，首次揭示了氢气饱和生理盐水除抑制动脉粥样硬化斑块形成外，还可使其稳定，不易破裂。氢生理盐水制备简单、注射浓度高、使用方便且无爆炸风险，成本很低，且无副作用，从动物实验的结果来看具有良好的治疗优势，大大减少易损斑块患者药物副作用风险，并大大降低医疗成本。
【IPC分类】A61K33/00, A61P9/10
【公开号】CN105079025
【申请号】CN201510335932
【发明人】宋国华, 秦树存, 于杨
【申请人】泰山医学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年6月17日