的离去基团。亲核取代产生用PEG修饰的蛋 白质或聚乙二醇化的γ-晶状体蛋白。因为已经证明利用PEG修饰蛋白质增加溶解度并不 影响三维结构或特性，所以选择聚乙二醇化。具体地，因为增加的PEG24的合理的分子量 (1100.39)和间隔臂长度（8.82nm)，所以选择PEG24。
[0111] NHSPEG24
[0112] 利用PEG24修饰γ -晶状体蛋白是成功的，通过在MALDI-T0F中观察到的γ -晶状 体蛋白分子量大的增加所证明。γ D-晶状体蛋白的最大相对强度是在24, 148m/z或2PEG24 单元处，同时对于yS-晶状体蛋白，峰出现在对应于4PEG24单元的26,711m/z处。（图 1)过量的反应物和反应条件是足够的，由于没有未修饰的Y-晶状体蛋白存在于溶液中。 γ -晶状体蛋白的较高分辨率MALDI-T0F数据示出了对应于1和3PEG24修饰的在23, 056m/ z和25, 206m/z处的另外的两个截然不同的峰。
[0113] CD光谱学证明尽管进行了修饰，两个晶体蛋白似乎均保持了它们的天然状态。 TD-晶状体蛋白示出了增加的峰和深度，其可以归于蛋白质浓度的细微差异。因为先前已 经证明了聚乙二醇化不妨碍蛋白质的二级结构，所以预期与实验数据良好贴合。（数据未显 示）
[0114] 在22°C和37°C处，对利用PEG24修饰的γ D-和γ S-晶状体蛋白进行DLS。NICF 提供一组峰的分布函数，其具有可以见诸于Γ对q2的图表的角的依赖。（图2_4)PEG24修 饰的γ-晶状体蛋白蛋白质具有小的尺寸分布，在将表示聚集体形成的更长的张弛时间处 没有另外的模式。对于YD-晶状体蛋白，由扩散系数计算的&在22°C和37°C处是3. lnm， 而γ S-晶状体蛋白在22°C和37°C处具有3. 2nm的Rh。Rh值分别与通过MALDI-T0F测量的 γ D-和γ S-晶状体蛋白的24. IkDa和26. 7kDa分子量很好地相关。
[0115] 通过NHSPEG24聚乙二醇化γ D-晶状体蛋白有效地防止在稀溶液中的任何聚集事 件，如在DLS中容易被看到的。PEG是亲水聚合物并且被示出增加蛋白质在溶液中的溶解 度。不限于理论，据信，如果聚集现象是由于疏水交互作用或静电有关的溶解度问题，那么 与聚乙二醇化相关的增加的溶解度防止γ-晶状体蛋白蛋白质聚集。
[0116] 沿着相同思考线索，不限于理论，据信，通过与PEG反应已经改变了蛋白质的总表 面电荷。在蛋白质的等电点处，溶解度降低，其由与等电点有关的电荷中和产生。含有伯胺 的氨基酸是这类修饰的靶标位点。赖氨酸和精氨酸的伯胺可以具有与其相关的正电荷，其 取决于蛋白质组成和溶液条件。通过NHSPEG与赖氨酸和精氨酸基团反应，潜在的电荷位点 被亲水的PEG占据，从而改变蛋白质表面电荷。如果聚集事件是静电相互作用的结果或邻 近等电点的蛋白质的结果，那么这将合理的解释为什么聚集体不在溶液中。经由其它反应 机制，利用PEG修饰γ-晶状体蛋白蛋白质将用于检查此可能性。
[0117] 不限于理论，在溶液中缺乏聚集体的最终解释是间隔问题。在硬的球状胶体领域， 已经确定，添加间隔分子可以减少聚集。添加 PEG24部分至γ-晶状体蛋白在蛋白质的表面 上提供亲水间隔分子。由PEG所提供的在蛋白质之间的间隔可以是被需要用于防止γ-晶 状体蛋白蛋白质聚集的所有。
[0118] 实施例4-利用PEG4化学修饰γ D-和γ S-晶状体蛋白
[0119] 利用PEG4修饰γ -晶状体蛋白蛋白质从而研究间隔臂长度对于γ -晶状体蛋白 蛋白质聚集的影响。利用NHS官能化的PEG(NHSPEG4)再次进行反应从而使修饰的方法相 同。PEG4具有219. 33g/mol增加的分子量和I. 6nm的间隔臂，其两者都小于PEG24。
[0121] NHSPEG4
[0122] MALDI-T0F数据示出了总的γ -晶状体蛋白分子量的增加，这表明具有PEG修饰。 (图5)对于γ D-晶状体蛋白，看到的最高的相对强度出现在22, 820m/z处，而对于γ S-晶 状体蛋白，这发生在23, 329m/z处，其分别对应于被添加至任一蛋白质的4和5PEG4单元。 应当指出的是，在相对强度峰周围有高斯（Gaussian)分布，这表明存在含有更大程度的修 饰和更小程度的修饰的蛋白质。MLDI-TOF数据还示出了没有未修饰的晶状体蛋白蛋白质 存在。
[0123] CD光谱学再次示出了聚乙二醇化没有显著地影响γ和α -晶状体蛋白蛋白质的 二级结构。（数据未显示）在天然的和PEG4修饰过的γ-晶状体蛋白蛋白质之间看到了极 好的一致。
[0124] 利用PEG4修饰的γ -晶状体蛋白蛋白质的NICF具有单指数衰变，表明在溶液中 存在单一的尺度。（图6)类似于利用PEG24修饰的γ-晶状体蛋白，没有聚集体存在于溶 液中。分布函数（图7)再次示出了一组峰，证明在Γ对q 2图表（图8)中的线性角相关。 通过DLS测量的γ D-晶状体蛋白的心在22°C和37°C处分别是2. 8和2. 9nm。Rh尺寸与 约22. 8kDa的修饰的蛋白质重量很好地相关。由于修饰的γ D-晶状体蛋白蛋白质的Rjl 大于它的未修饰的前体，所以在DLS中还可以观察到蛋白质单体尺寸的微增。PEG4修饰的 γ S-晶状体蛋白蛋白质在22°C和37°C处具有2. 9的Rh。相比于未修饰的γ S-晶状体蛋 白，修饰的蛋白质的总尺寸确实增加并且Rh与约23. 3kDa的分子量相一致。
[0125] 利用NHSPEG4和NHSPEG24修饰的γ -晶状体蛋白蛋白质在22 °C和37 °C处示出 了没有聚集。利用PEG4修饰通常导致四至五低分子量增加而在PEG24的情况下时，每个 γ-晶状体蛋白蛋白质添加两个至三个基团。利用PEG4每个蛋白质进行的大量的修饰在防 止聚集方面没有提供显著的好处。同样地，添加具有PEG24的更大的总重量至γ-晶状体 蛋白对于防止聚集没有提供优势。
[0126] 利用PEG24修饰的γ -晶状体蛋白蛋白质与PEG4修饰相比具有稍大的Rh。由于 两个修饰没有导致聚集体，所以推断出间隔臂长度没有显著地有助于聚集的预防。据预测， 更大的PEG链将产生相似的结果。
[0127] 实施例5-利用CAPEG化学修饰γ D-和γ S-晶状体蛋白
[0128] 通过CAPEG4进行修饰从而研究γ -晶状体蛋白聚乙二醇化的可替换的反应机制。 在生理ΡΗ(6. 8)处，CAPEG4的伯胺是稍微更多正的并且能够和带负电荷的氨基酸、天冬氨 酸和谷氨酸起反应。可替换地，带正电荷的氨基酸仍然能够和CAPEG4的羧酸（CA)起反应。 与NHSPEG4相似的原因选择CAPEG4,原因是增加的小增加的分子量/单元（265. 3g/mol)和 短的间隔臂（l.Slnm)。
[0130] CAPEG4
[0131] MALDI-T0F示出了 γ-晶状体蛋白分子量相当大的增加，其是通过CAPEG4修饰的 结果。（图9)在任一溶液中没有未修饰的γ-晶状体蛋白，这表明反应条件足以满足蛋白 质修饰。对于yD-晶状体蛋白在23, 273m/z处的相对强度峰代表已经被添加至蛋白质的 5CAPEG单元。对于γ S-晶状体蛋白，较高分辨率的MALDI-T0F光谱示出了几个不同的质量 峰从而包括22, 867m/z或2CAPEG4单元，23, 089m/z或3CAPEG4单元（相对强度最大），以 及 23, 591m/z 或 5CAPEG4 单元。
[0132] γ -晶状体蛋白的CAPEG4修饰的CD光谱学示出了与利用PEG4和PEG24进行的修 饰相似的变化趋势。（数据未示出）yS-晶状体蛋白+CAPEG4示出了与未修饰的yS-晶状 体蛋白蛋白质极好的关联。修饰的TD-晶状体蛋白在220nm处再次示出了轻微的变化，但 是总的曲线具有与天然的TD-晶状体蛋白相似的形状。
[0133] 利用CAPEG修饰γ -晶状体蛋白也防止蛋白质的聚集。可以通过产生具有Γ对 q2线性相关的分布函数的单指数功能描述NICF。（图10-12)在22°和37°C处看见单体形 式的修饰的γ-晶状体蛋白蛋白质，其中R h与温度无关的。对于TD-晶状体蛋白，扩散系 数提供2. Snm的计算的Rh，而对于yS-晶状体蛋白，此值为2. 9m。除在尺寸上近似于利用 PEG4修饰的γ -晶状体蛋白之外，&值分别与γ D-和γ S-晶状体蛋白23kDa和23. 5kDa 修饰的分子量者很好地相关。
[0134] 在生理pH(6. 8)处利用CAPEG的聚乙二醇化靶向酸性氨基酸。与利用NHSPEG进 行的反应相类似，CAPEG修饰应当改变蛋白质的总表面电荷。通过与带负电荷的氨基酸反 应，亲水的PEG链占据带正电荷的氨基酸。具有与NHSPEG4相似的尺寸和修饰的数量（四至 五），利用CAPEG4修改过的γ -晶状体蛋白提供非常相似的修饰。优于NHSPEG，使用CAPEG4 的潜在的优点是在反应中没有NHS离去基团。
[0135] 不限于理论，CAPEG修饰再次表明蛋白质表面电荷是γ-晶状体蛋白聚集体形成 的主要因素。随着PEG部分被添加至蛋白质中，改变表面的疏水性，防止聚集，也是有可能 的。从该实验获得的关键信息是：通过酸性的或碱性氨基酸的修饰可以防止聚集。
[0136] 实施例6-利用MMPEG化学修饰γ D-和γ S-晶状体蛋白
[0137] 顺丁烯二酰亚胺官能化的PEG是另一个反应机制，通过该机制，可以聚乙二醇 化γ-晶状体蛋白蛋白质。硫醇基团能够在顺丁稀二酰亚胺官能团的双键上的Michael 加成。Y-晶状体蛋白蛋白质均含有含有硫醇端基的多个半胱氨酸氨基酸残基。利用 MMPEG24(MM)聚乙二醇化γ-晶状体蛋白因而通过半胱氨酸氨基酸发生。通过此反应机制 的修饰是以前的聚乙二醇化实验所独有的，因为总蛋白质电荷不应当被影响。具体地，选择 MMPEG24,因为每单元添加的高分子量（1239. 44g/mol)和长间隔臂（9. 53nm)与PEG24将是 可比较的。
[0139] MMPEG24
[0140] 利用MMPEG24修饰的γ -晶状体蛋白的MALDI-T0F光谱示出了可以观察到三个 截然不同的峰，从最小至没有未修饰的γ-晶状体蛋白。（数据未显示）在23187,24426， 25666m/z处观测到四个γ D-晶状体蛋白峰，与1，2,和3修饰相对应。在γ S-晶状体蛋白 峰的情况下，在23565, 24426,和25666m/z处观测到γ S-晶状体蛋白峰，与1，2, 3修饰相对 应。两个晶状体蛋白蛋白质的最尚的相对强度出现在2修饰处。
[0141] 在天然的和聚乙二醇化的γ-晶状体蛋白蛋白质之间再次看到极好的一致。众所 周知，在某些情况下，半