Shroom3在慢性肾脏疾病和慢性异体移植肾病中的用图
【专利说明】SHR00M3在慢性肾脏疾病和慢性异体移植肾病中的用途
[0001] 由于接受来自国立卫生研究院的1U01AI070107-01号基金资助，美国政府对本发 明享有某些权利。
技术领域
[0002] 本申请涉及鉴别罹患肾脏疾病的患者和在肾异体移植物（allograft)接受者 中预测肾纤维化的发展和进展的方法。本发明包括用于鉴别罹患肾脏疾病的患者和用 于在肾异体移植物接受者中预测肾脏疾病和小管 -间质纤维化（tubulo-interstitial fibrosis)的发展和进展的试剂盒。
【背景技术】
[0003] 慢性肾脏疾病（Chronic Kidney disease，CKD)影响10%的美国成年人，并且世 界范围的发病率和患病率上升{Coresh J, 2007}。末期肾病（End-stage renal disease， ESRD)需要肾置换治疗（RRT)并且当前影响超过500, 000名美国成年人。除了导致末期肾 病（ESRD)的风险以外，CKD还增加心血管疾病和所有原因死亡的风险{Weiner D，2004}。小 管-间质纤维化（TIF)是各种病因的CKD最终共同的病理过程，导致ESRD的发展。TIF也 是慢性异体移植肾病（chronic allograft nephropathy, CAN)的首要组成，并且与肾异体 移植物中的估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR)的进行性 下降相关{Chapman J, 2005} {Nankivell BJ, 2003}。CAN 代表死亡截尾（death-censored) 长期移植物丢失的最常见原因，并通过慢性异体移植物异常指标评分（chronic allograft dysfunction index score，CADI 评分）而组织学地测定{Isoniemi Η, 1992} {Yilmaz S，2007}。迄今为止，没有防止CKD或CAN进展的有效的抗纤维化疗法。目前，一些有CKD 或CAN的患者将最终进展至ESRD并需要RRT。例如，肾异体移植物接受者代表了肾移植候 补名单上13. 5%的患者和2005年进行的所有移植的15% {Magee JC，2007}。肾异体移植 物接受者有30%的可能性在10年时需要RRT或再次移植{USRDS 2012}。RRT和ESRD护理 对于美国联邦医疗保险是不成比例和迅速增长的财政负担{Iglehart，2011}。因此，确定新 的敏感的生物标志物来预测肾纤维化发展是很关键的。此外，这些标志物可代表治疗性介 入的靶标，以在早期防止TIF发展，从而防止向ESRD进展。
[0004] 基于异体移植物活检的研究（因故的（for-cause)和程序性的（protocol))提供 了对早期异体移植物改变如何与长期异体移植物结果相关联的认识{Gago M，2012} {Rush D, 1994} {Seron D, 1997} {Cosio F, 2005} {Park W, 2010}。更近期地，已显示出清楚的活检 和血液基因表达谱（转录组）特征，来区分有急性排斥的患者、有慢性排斥的患者、处于免 疫抑制的患者和手术耐受的接受者{Akalin E，2010} {Akalin E，2001} {Flechner S，2004} {Donauer J, 2003} {Sarwal M, 2003}{Reeve J, 2009} {Scherer A,2003} {Sagoo P,2010} {Newell K, 2010}。这些基因面板（gene panel)能在单独的组织学分类标准基础上改 进{Sarwal M, 2003} {Reeve J, 2009}。全基因组关联（Genome-wide association)研究 也强烈地将Shroom3基因（rsl7319721)的单核苷酸多态性（SNP)与基于人群的欧洲祖 系群组中由eGFR表征的偶发性和流行性CKD相联系{Kottgen A, 2009} {Boger C，2011}。 Shr〇〇m3基因编码含PDZ结构域的蛋白质，其可直接结合丝状肌动蛋白，并调节其在细胞 中的亚细胞分布。在小鼠中，Shroom3完全缺失或缺陷导致开放性神经管缺陷和新生儿 死亡{Hildebrand J, 1999}。在MDCK肾细胞系中，Shroom3定位于顶端和衔接点复合物 (junctional complex)，并且对正常上皮细胞表型的维持至关重要{Hildebrand J, 2005}。 也已知Shroom3的C-端结构域与Rho-激酶（ROCKs)相互作用，从而促使肌球蛋白磷酸化 和肌动蛋白收缩{Nishimura T，2008}。然而，尚不了解Shroom3是否在CKD或CAN的肾纤 维化中发挥作用。
[0005] 技术中需要的是一些标志物，其表达可用来鉴别罹患肾脏疾病的患者，并预测肾 纤维化的发展。此外，需要此类标志物来鉴别面临发展CAN的风险的肾异体移植物接受者， 并代表治疗性介入的靶标，以在早期防止TIF发展，从而防止向ESRD进展。
【发明内容】
[0006] Shr〇〇m3是新的候选基因，其在肾异体移植物中的表达先于肾功能降低和TIF，并 预测肾功能降低和TIF。更高的异体移植物Shr 〇〇m3水平预测CAN的组织学进展。也发 现这些关系在白种人供体肾的接受者（recipients of white-donor kidneys, WDKR)中 相关性最好。该发现首次确认，之前记述的慢性肾脏疾病（CKD)相关的Shroom3基因座 (rsl7319721) {Kottgen A, 2009} {Boger C, 2011}通过增加 Shroom3 表达而介导其效果。此 外，发现Shr〇〇m3在经典TGF-β (beta)信号传导和胶原蛋白-I的产生中具有有益的作用。
[0007] 在一方面，本发明提供一种在接受了来自供体的肾移植的患者中鉴别发展慢性异 体移植肾病（CAN)的风险的方法，其包括：鉴别肾供体的种族；确定在移植后预定的时间从 患者获取的肾活检标本中的SHR00M 3表达水平；将活检标本中的SHR00M 3表达水平与对 照中的SHR00M表达水平相比较；确定异体移植物中的SHR00M 3表达水平是否显著高于对 照，并且如果标本中的SHR00M 3表达水平显著高于对照，则将患者诊断为面临CAN的风险。
[0008] 在进一步的方面，本发明提供一种在接受了来自供体的肾的患者中鉴别发展慢性 异体移植肾病（CAN)的风险的方法，其包括以下步骤：鉴别肾供体的种族；从患者获取肾异 体移植物活检样品；确定所述活检中的SHR00M3表达水平；将所述活检中的SHR00M3表达 水平与对照中的SHR00M3表达水平相比较，并且如果样品中的SHR00M3水平显著高于对照 且肾供体为高加索人，则告知患者面临发展CAN的风险。
[0009] 还在进一步的方面，本发明提供一种在接受了来自供体的肾的高加索人患者中鉴 别发展肾病的风险的方法，其包括以下步骤：确定所述供体是否表达rs 17319721 SNP风 险等位基因，并进行基因分析以确定所述供体对于所述风险等位基因是否为纯合的，其中 如果所述供体对于所述风险等位基因是纯合的，那么所述患者面临发展肾病的风险。
[0010] 还在进一步的方面，本发明提供一种在高加索人肾供体中鉴别发展纤维化的风险 的方法，其包括以下步骤：确定所述供体是否表达:TS 17319721 SNP风险等位基因，并进行 基因分析以确定所述供体对于所述风险等位基因是否为纯合的；其中如果所述供体对于所 述风险等位基因是纯合的，那么所述供体面临纤维化的风险。
[0011] 还在进一步的方面，本发明提供一种鉴别高加索人患者发展选自由慢性异体移植 肾病（CAN)和慢性肾脏疾病（CKD)组成的组的进行性肾脏疾病的风险的方法，其包括：确定 在预定的时间从患者获取的肾活检标本中的SHROOM 3表达水平，将活检标本中的SHROOM 3表达水平与对照中的SHROOM 3表达水平相比较，确定标本中的SHROOM 3表达水平是否显 著高于对照，并且如果标本中的SHROOM 3表达水平显著高于对照，则将患者诊断为面临所 述疾病的风险。
[0012] 还在进一步的方面，本发明提供一种用于鉴别罹患肾病和面临发展CAN或CKD 风险的患者的试剂盒，其包括置于单独容器中的：在SHR00M3表达的RT-PCR测定和rs 17319721 SNP风险等位基因的RT-PCR测定中使用的引物，阳性对照，缓冲液和使用说明。
[0013] 根据说明书、权利要求和附图，本发明的这些和其它方面将对本领域技术人员变 得明显。
【附图说明】
[0014] 图1 :描述本文报道的研究中参与者数量，并示出对160名参与者从3个月异体移 植物活检提取RNA用于微阵列的图表。在这160名患者中，在移植后12个月时，147人报告 有 eGFR-肌酐（creatinine)，101 人报告有 CADI-12,和 85 人报告有 CADI-3。
[0015] 图2A-2D :描述下列内容的图表：（2A) 3个月时的异体移植物的对数Shroom3表达 (微阵列）与12个月时的eGFR肌酐的相关性（r = -0· 20 ;p = 0· 007) ; (2B) 3个月时异体移 植物的对数Shroom3表达（微阵列）与CADI-12个月的相关性（皮尔逊相关系数（Pearson) R-0. 22 ;p = 0. 027) ; (2C)与没有显著纤维化进展的供体（CADI增量（Delta CADI)〈2 ;n = 68)相比，所有具有进行性纤维化的供体中Shroom3的表达更高（CADI增量=2或大于2 ; η = 17);和（2D)在死亡供体肾中，3个月Shroom3表达与12个月CADI之间的相关性最强 (r = 0. 34 ;p = 0. 0088)[线表示平均值；须=SD]。
[0016] 图3A-3D :描述下列内容的图表：(3A)3个月时的Shroom3表达的倍数变化 (RT-PCR)与CADI-12个月的相关性（皮尔逊相关系数r = 0· 4169 ;p = 0· 0103) ; (3B) 3个 月时的Shroom3表达的倍数变化（RT-PCR)与12个月时eGFR肌酐的相关性（r = 0. 3230 ; p = (3C) 3个月时的异体移植物的对数Shroom3表达（微阵列）与3个月时Shroom3表达 的倍数变化之间的相关性（皮尔逊相关系数r = 0. 5613 ;p = 0. 0008);和（3D) 3个月时对 数Shroom3表达与同时的CADI评分之间的关系的回归线-未能鉴别出关系。
[0017] 图4A-4C :描述下列内容的图表：(4A)在白种人供体肾的接受者中，3个月时的异 体移植物的对数Shroom3表达与CADI-12个月的相关性（r = 0. 2538 ;p = 0. 02) ; (4B) 在白种人供体肾的接受者中，异体移植物的对数Shr〇〇m3表达与eGFR-肌酐的相关性（r =-0. 25 ;p = 0. 008);和（4C)与没有显著的纤维化进展的WDKR(CADI增量〈2 ;n = 56)相 比，有纤维化进展的WDKR(CADI增量彡2 ;n = 14)中的对数Shroom3表达更高[*p〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0018] 图5A-5C :描述下列内容的图表：(5Α)在活体供体接受者（living donor recipients, LDR)中，3个月时的异体移植物的对数Shroom3表达（微阵列）与12个月CADI 之间没有相关性；和（5B)在非WDKR中；（5C)在非-WDKR中，3个月Shroom3与eGFR-12个 月没有相关性。
[0019] 图6A-6B :示出下列内容的图表：（6A)Shroom3 SNP(rsl7319721)在（供体和 接受者当中的）白种人和非白种人之间分布不同。白种人的效应等位基因发生率更高 (p〈0. 0001)。（6B):供体肾中的风险等位基因的纯合性与异体移植物Shr〇〇m3表达的显著 增加有关（P = 〇. 033)，（须：第5至第95百分位；线位于中位数处；p = 0. 0183) [*p〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0020] 图7A-7C :示出下列内容的图表：(7Α、7Β分别示出）供体中有效应等位基因（A)存 在时，Shroom3表达在WDKR和非WDKR中都增加。和（7C)接受者的SNP类型并不显著影响 Shroom3表达（须：最小值-最大值；线位于中位数处；p = 0· 0309) [*ρ〈0· 05 ;#ρ〈(λ 001 ; ***ρ〈0· 0001]。
[0021] 图8Α-8Β :示出下列内容的图表：(8Α)根据ESRD病因学，在354名白种人接受者中 的Shr〇〇m3 SNP等位基因流行率（示为％ )。与无关供体相比，患有来自糖尿病的ESRD的 接受者，有显著更高的风险等位基因流行率（49% )。（8B):研究的3247名患者中Shr〇〇m3 SNP等位基因流行率。风险等位基因流行率在有CKD的糖尿病患者中最高（51%) [*p〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0022] 图9 :下文实施例5中使用的萤光素酶报告质粒的构建体图。
[0023] 图10Α-10Β :图IOA是示出具有表现比G-等位基因更高的活性的A-等位基因增 强子元件的萤光素酶报告质粒，和仅有启动子的质粒的图；图IOB是说明从293-Τ细胞中提 取的核蛋白表现出向含G-等位基因的核苷酸序列增强的结合的免疫印迹。
[0024] 图11Α-11Β :图IlA是示出下列内容的图：通过RT-PCR测得，在PRCEC中，TGF-β 处理以剂量依赖（上至5ng/ml)和时间依赖的方式增加 Shroom3(误差棒（error bar):表 示在PRCEC中，TGF- β处理以时间依赖的方式增加 Shroom3 (上至5ng/ml))(误差棒：平均 值土标准误）[*ρ〈0· 05 ;#p〈0. 001 ;*#ρ〈0· 0001]。图IlB是说明TGF-β以时间依赖的 方式增加 Shroom3的免疫印迹。
[0025] 图12A-12B :图12A是示出实施例6的结果的图表，其显示TGF-β以β-联蛋白/ TCF712依赖的方式增加 Shr〇〇m3表达。槲皮素 （β -联蛋白抑制剂）和BC-21 (TCF7L2抑制 剂）抑制TGF-β诱导的Shroom3表达增加（RT-PCR)。12Β是示出Shroom3蛋白以β -联 蛋白/TGF-β依赖的方式增加的免疫印迹。
[0026] 图13Α-13Β :图13Α和图13Β是示出分别由RT-PCR和免疫印迹所确认的在 PC-SHR00M3转染的PRCEC中Shroom3过表达的图表（平均值土标准误）[*ρ〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0027] 图14A-14C:图14Α是示出实施例7的结果的图，并通过RT-PCR显示在TGF-β 诱导的促纤维化（prof ibrotic)基质标志表达上的效果。Shroom3过表达单独增加胶 原蛋白-1和纤连蛋白产生，而敲减阻抑这些基质标志（平均值土标准误）[*P〈0. 05 ; **p〈0. 001 ;#*p〈0. 0001];图14B是示出Shroom3过表达促进15分钟时PRCEC中响应 TGF-β的Smad-3磷酸化的免疫印迹（右）；图14C为照片，示出与TGFf3 1处理的没有 SHR00M3过表达的细胞相比，TGF-β 1处理的SHR00M3-过表达的PRCEC也发展出更明显的 丝状肌动蛋白束（图14C-上部和下部）。
[0028] 图15A-15B :示出实施例7的结果的图，其建立Shroom3在有PC-SHR00M3转染的 PRCEC中过表达，分别由RT-PCR(图15A)和免疫印迹（图15B)确认（平均值土标准误） [*ρ〈0· 05 ;**p〈0. 001 ;***ρ〈0· 0001]
[0029] 图16A-16D : (16Α)示出对R0SA-RTTA(上图）和COLTGM(下图）的代表性基因型 分型结果。（16B)示出来自非Dox饲养对比Dox饲养的小鼠 （η = 2)的UUO肾的小鼠肾皮 质裂解物中的磷酸化-SMAD3 (P-SMAD3)、总SMAD3 (SMAD3)、Shroom3和β -肌动蛋白的免疫 印迹。（16C)左至右-示出来自对比肾和非Dox饲养动物的肾，和Dox饲养动物的UUO肾的 代表性低倍（IOx)图像的照片。上排-高碘酸希夫染色（Pe