riodic acid Schiff stain)， 中排-天狼猩红（Picrosirius red)染色。下排-对COLlAl的免疫标记（TRITC-Alexa fluor)在速冻肾皮质切片上进行。示出代表性图像。图表表示在每只动物的5个随机高倍 视野中COLlAl染色面积/总面积（％)的形态测量定量。（16D)描述在对照、和DOX与非 DOX饲养的动物的UUO肾中通过RT PCR得出的SHR00M3和COLlAl mRNA表达的棒状图（向 GAPDH归一化；η = 5 ;平均值土标准误；有试验后Bonferroni比较的方差分析；*P〈0. 05)。
【具体实施方式】
[0030] 定义
[0031] 术语"约"或"大约"通常意指对于数值的类型和测定的方法而言在可接受的误差 范围以内。例如，它可意指给定数值或范围的20%以内，更优选10%以内，还最优选5%以 内。可选地，尤其是在生物系统中，术语"约"意指在给定数值的约一个对数级（即，一个数 量级）以内，优选2倍以内。
[0032] 术语"显著地更高的Shr〇〇m3表达水平"在本文中定义为对照的约1. 4倍至约5倍 之间。
[0033] 本发明是基于当与从正常对象获得的对照活检相比，面临发展CAN风险的肾异体 移植物接受者中SHR00M3表达水平显著更高这一发现。根据本发明，用例如免疫染色但优 选实时聚合酶链式反应（RT-PCR)等现有技术中已知的技术，从来自肾异体移植物接受者 的活检中确定SHR00M3表达水平，并与来自例如活体供体基线活检样品或来自肾切除手术 的肾样品等正常肾样品的对照获得的活检相比较。
[0034] 在慢性异体移植物排斥基因组研究实验方案中，在不同的时间点从所有招募的患 者中获得活检（见下文的实施例）。从3个月时的异体移植物活检上进行的DNA-微阵列， 鉴别并排序差异表达与12个月时的CADI评分和肾功能相关的基因。在这个列表当中最高 排序的基因中有SHR00M3 (未发表数据）。
[0035] 全基因组关联研究也强烈地将SHR00M3基因（rsl7319721)中的单核苷酸多态 性（SNP)与欧洲祖系群组中由eGFR表征的偶发性和流行性CKD相联系{Kottgen A，2009} {Boger C，2011}。SHR00M3基因编码含PDZ结构域的蛋白质，其可直接结合丝状肌动蛋白， 并调节其在细胞中的亚细胞分布。在小鼠中，SHR00M3完全缺失或缺陷导致开放性神经管缺 陷和新生儿死亡{Hildebrand J，1999}。在MDCK肾细胞系中，SHR00M3定位于顶端和衔接点 复合物，并且对正常上皮细胞表型的维持至关重要{Hildebrand J，2005}。也已知SHR00M3 的C-端结构域与Rho-激酶（ROCKs)相互作用，从而促进肌球蛋白磷酸化和肌动蛋白收缩 {Nishimura T,2008}〇
[0036] 在本文报道的研究中，招募了 589名患者。异体移植物活检在移植后0、3、12和24 个月时获得，并且从中心实验室报告慢性异体移植物异常指标评分（CADI)。基因表达微阵 列分析在3个月的活检上进行（Affymetrix :人类外显子-1芯片），并分析与12个月CADI 和eGFR的相关性（η = 160)。过表达和慢病毒（Ientiviral)阻抑研究在人原代小管细 胞（human primary tubular cells，RPTE)上进行。发现SHR00M3基因表达与纤维化线性 相关，并与1年时的eGFR负相关（n = 101 ;p〈0. 05)。这由RT-PCR独立地确认（η = 36)。 SHROOM3表达和3个月CADI之间未见相关性（η = 137)。
[0037] 在全基因组关联研究中，SHR00M3(rsl7319721)中的SNP已连接至CKD。如本文所 公开的，发现供体DNA中风险等位基因（即A/G或A/A)的至少一个拷贝的存在与3个月时 更高的移植物内SHR00M3表达相关（η = 136 ;p = 0. 02)。与非白种人供体相比，风险等位 基因在白种人中更流行。如下文的实施例4所示，SNP风险等位基因在有肾病的白种人糖 尿病人中更频繁。因此，本发明提供用于在接受来自供体的肾、罹患肾病的糖尿病高加索人 患者中鉴别发展CAN的风险的方法，其包括从处于基线的供体获得血样，并进行基因分析 以确定供体是否对于风险等位基因是纯合的步骤。如下文实施例9所示，该方法可在非糖 尿病高加索患者上实践。如果供体对于风险等位基因是纯合的，那么该患者面临CKD或CAN 的风险。该方法仅在供体可找到的情况下进行，但通常情况并非如此。如果供体不能找到， 则可检查患者中的SHR00M3表达水平。虽然在白种人供体肾的接受者中SHR00M3表达对12 个月时的CADI有预测作用，但这对于非白种人或活体供体的接受者并不适用。
[0038] 在RPTE中，SHR00M3的过表达增加1型胶原蛋白的产生，而慢病毒阻抑明显减少1 型胶原蛋白的产生（P〈〇. 01)。SHR00M3过量促进经典TGF-β信号传导，而SHR00M3阻抑抑 制经典TGF- M言号传导，这由磷酸化Smad3和促纤维化标志的产生所证明。此外，如RT-PCR 所确定的，与对照相比，在有CKD(HIV-肾病和单侧输尿管阻塞（Unilateral Ureteric Obstruction))的FVB/N小鼠中，SHR00M3表达增加。因此，本发明不限于CAN，而是对其它 CKD，例如阻塞性尿路病（obstructive uropathy)、HIV相关的肾病和糖尿病肾病等也有用。
[0039] 不希望受理论限制，相信Shr〇〇m3涉及例如肝纤维化和肺纤维化等涉及纤维化的 任何疾病。因此，本文记述的材料和方法将对监测此类疾病的进展有用。如下文实施例 10所示，在小鼠模型中，Shr 〇〇m3敲减动物中，肾间质纤维化显著消除。这些结果确认了 SHR00M3在这些疾病中的作用。
[0040] 本发明也提供本文公开的方法用的试剂盒。该试剂盒包括单独的容器中的下列组 分：用于RT-PCR SHR00M3表达测定的引物、用于基因表达分析的微阵列和用于rsl7319721 风险等位基因的RT-PCR分析的引物、缓冲液和使用说明。试剂盒中使用的引物的非限制性 列表记载表5。阳性对照包括过表达SHR00M3的细胞，或脑组织例如神经上皮，已知其有高 7义平SHR00M3表达（Shroom3_mediated recruitment of Rho kinases to the apical cell junctions regulates epithelial and neuroepithelial planar remodeling-Tamako Nishimura and Masatoshi Takeichi，Development 135, 1493-1502(2008)doi:10.1242/ dev.019646)〇
[0041] 本发明指向用于鉴别面临发展例如CAN或CKD等肾脏疾病风险的肾异体移植物 接受者的方法。当鉴别出此类患者时，本发明包括用于治疗此类患者的方法。此类方法包 括但不限于，给予免疫抑制药即神1丐依赖磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitor，CNI)，例 如环孢菌素或他克莫司，或较少纤维发生的免疫抑制药例如吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF)或西罗莫司。由于鉴别为面临发展CAN或CKD风险的患者肾功能受损，并常 常罹患高血压，因此向此类患者给予例如赖诺普利等血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI)，或 给予例如氯沙坦等血管紧张素 II受体阻断剂，在本发明的范围之内。
[0042] 本发明也提供用SHR00M3作为靶标来筛选对治疗CAN和CKD有用的药物的方法。 下文实施例5中记述的用SHR00M3A-等位基因/萤光素酶构建体转染的293T细胞可用于筛 选测定，以鉴别用于治疗SHR00M3介导的纤维化疾病的药物。细胞可种在96孔微孔板中， 与候选药物接触，并对萤光素酶活性的变化进行测定。将测定基线处的SHR00M3活性（即 萤光素酶），并且抑制剂槲皮素和/或BC-21可用作阳性对照。
[0043] 作为可选方案，将用已知的SHR00M3表达上调剂TGFBl (5-10ng/ml)来处理293T 细胞，并且这些细胞（有较高的SHR00M3表达基线）用于筛选测定。这些测定可发展为高 通量形式。
[0044] 用于对A等位基因的RT-PCR测定和用于产生萤光素酶报告构建体的引物示于表 5〇
[0045] 总之，根据本发明，SHR00M3已鉴别为新的候选基因，其在肾异体移植物中的表达 先于CAN中的肾功能紊乱和TIF，并预测CAN中的肾功能紊乱和TIF。显著更高的异体移植 物SHR00M3水平可用于预测CAN的组织学进展。此外，发现这些关系在白种人供体肾的接受 者中最有预测性。这些发现首次确认，此前记述的CKD相关的SHR00M3基因座（rsl7319721) {Kottgen A，2009}{Boger C，2011}通过增加 SHR00M3表达而介导其作用。最后，本文记述 的体外研究提示SHR00M3在肾小管细胞中的经典TGF-β信号传导和胶原蛋白-1产生中的 有益作用。总而言之，这些发现表明SHR00M3是CAN和CKD二者中的治疗靶标，并且阻抑其 水平可用于抑制TIF进展并延缓ESRD。
[0046] 本发明在下文的工作实施例中描述，实施例意在进一步描述本发明，但不限制本 发明的范围。
[0047] 在下文的实施例中，使用下列材料和方法。
[0048] 活检和RNA提取：实时、超声引导的肾异体移植物活检在移植后0、3、12和24 个月时从5个临床位点的3个获得。当可能时，用18G弹簧加载的活检针提取两个核芯 (core)。如果获得单个核芯，3个月时的访问优先用核芯进行RNA提取（QIAGEN-ALLprep kit，Valencia，CA USA)，而12个月的核芯优先进行组织学分析。用于基因表达研究的组织 立刻储存在RNA-Iater中，并在-20°C下运至基因组中心实验室。
[0049] 逆转录：提取的活检 RNA 用 Sensiscript - 步法 RT (Qiagen)和 Oligo-DT 引 物（Qiagen)，以55ng的起始总RNA量进行逆转录。不使用以nanodrop测得的RNA 浓度<5ng/mcl的提取样品。对于体外研究，我们以500-1000ng的起始总RNA，使用 Superscript-Ill (Invitrogen-Life technologies, Grand Island, NY)〇
[0050] RT-PCR :用Primer-BLAST(NCBI)对Shroom3设计跨内含子的引物组，并通过熔解 曲线分析和琼脂糖凝胶电泳来确认PCR扩增子。用实时聚合酶链式反应（RT-PCR) (Applied biosystems 7500循环仪），在患者的内部和外部群组中测定Shroom3表达。
[0051] Shroom3 SNP 分析：用 Taqman SNP 分析测定（货号：4351379，Applied Biosystems, Foster City, CA)对Shroom3进行革巴向基因型分型。从植入前活检或血液中提 取DNA (QIAGEN-ALLpr印kit, Valencia, CA USA)用于供体SNP测定，并从外周血提取DNA用 于接受者SNP测定。用来自Applied Biosystems的基因型分型软件进行自动分析（Applied Biosystems 7500 循环仪）。
[0052] Shr〇〇m3启动子-增强子构建体和萤光素酶-报告子测定：用引物组PCR扩增跨越 SHR00M3的5'翻译起始位点-3000碱基的启动子片段，所述引物对任选地包括SHR00M3内 含子-1的24个碱基对序列，其包括含有两个等位基因的任一个（A或I. G)的rsl7319721 位点（表1)。在所有正向引物中引入KpnI限制酶切位点，并在反向引物中引入Hind III限 制酶切位点。然后用Kpn I和Hind III位点，将PCR产物克隆入萤光素酶报告载体-pGL3 Basic (E-1751，Promega，WI，USA)。这产生3种报告质粒-只有启动子，有内含子-A或-G 序列的启动子。
[0053] 这些构建体（各Imcg)与海肾萤光素酶（Renilla Iuciferase)报告质 粒-pTL-TK (200ng)的瞬时转染在铺于6孔板、处于80 %汇合的HEK293T细胞中进行 (Polyjet reagent，SignaGen labs，Rockville，MD)。24 小时后，裂解细胞并提取蛋白。在 微板读数仪上，根据制造者提供的实验方案，用双萤光素酶测定系统（pJK Germany)在裂解 物中测定海肾和萤光素酶活性。结果表示为萤光素酶：海肾之比。
[0054] 免疫印迹：用含有1% Triton、蛋白酶抑制剂混合物和酪氨酸及丝氨酸/苏 氨酸磷酸化和磷酸酶抑制剂的缓冲液裂解细胞。对裂解物进行使用兔抗Shr 〇〇m3(Dr Jeffrey Hildebrand, Pittsburgh 惠赠）、抗 V5 标签抗体（R960-25，Invitrogen-Life technologies)、磷酸化-Smad3抗体（兔多克隆-pS423/425)和Smad-3 (兔单克隆 Smad-3, #9523,来自Epitomics, Burlingame, CA)的免疫印迹分析。光密度测定按此前记述 的进行{Gassman 2009}。
[0055] 过表达研究：用Clonase-II重组酶（Invitrogen)将人Shroom3构建体（Open Biosystems, Lafayette, CO)克隆入具有C-端V5和组氨酸标签的哺乳动物表达载体 PC_DEST40(Invitrogen, Carlsbad, CA)。如此前所记述{Jin Y, 2012}，使用利用 Lonza Nucleofector Technology (用于原代哺乳动物上皮细胞（Primary Mammalian Epithelial Cell)的Basic Nucleofector试剂盒，Program T20)的电穿孔转染来转染的原代肾皮质上 皮细胞（primary renal cortical epithelial cells，PRCEC)。以空目标载体转染作为对 照，通过RT-PCR和免疫印迹在PRCEC中确认强制表达。促纤维化细胞外基质标志在PRCEC 中通过实时聚合酶链式反应（RT-PCR)来分析。转染后36小时，在营养饥饿培养基中测定 TGF-β处理在Shroom3-转染的细胞中的基质标志产生上的效果。Smad-3的磷酸化在用 TGF- β处理5、15和30分钟时测定。
[0056] Shroom3SIRNA阻抑研究：通过293-Τ细胞中的RT-PCR和免疫印迹，试验人 Shroom3 短发夹克隆（Open Biosystems, Lafayette, CO)对 Shroom3 的阻抑。将选择的 GFP-标签的发夹和包膜质粒（Poly jet reagent) -起转染进293-T细胞，以产生哺乳动物 VSV假型慢病毒表达构建体。用此慢病毒构建体感染PRCEC，并确认Shr〇〇m3阻抑。对于小 鼠中的体内Shroom3阻抑，用能够解析详尽shRNA文库的感受器Ping-Pong测定（Mirimus inc，Long Island，NY)将强力阻抑发夹序列列入入围名单。小鼠足细胞用这些在Mir30慢 病毒骨架上的序列转导，并用RT-PCR和免疫印迹试验对Shr 〇〇m3阻抑进行试验。选择两条 序列，用于胚胎干细胞注射入小鼠，从而开发四环素-可诱导Shr〇〇m3-ShRNA小鼠模型。
[0057] 参与者的特征
[0058] 在本研究招募结束时，从5个中心向本研究中招募了 589名接受者。群组中的供 体和接受者的人口统计和临床特征列于表1。包括在微阵列研究中的患者的人口统计和临 床特征详述于表2。
[0059] 实施例1: SHR00M3上调，并与CAN进展相关
[0060] 为了鉴别可潜在地有助于CAN发展的基因，我们对有来自3个月异体移植物活检 以及eGFR_12和CADI_12的基因表达微阵列数据的群组的首66名对象进行了临时分析。涉 及CAN进展的候选基因列表-也就是在3个月异体移植物样品中的表达与低eGFR_12和高 CADI_12相关的基因，被鉴别并排序。SHR00M3在列表的最高排位的基因当中（表3)。由于 临时分析，我们收集并分析了另外的样品。在准备即时应用时，3个月异体移植物基因表达 概况已在160份异体移植物上进行，其中在147名对象中12个月eGFR(eGFR_1