嘧菌酯对口腔癌及癌前病变的干预作用
【技术领域】
[0001] 本发明是关于一种化合物的新应用，具体的说是涉及一种新的干预口腔癌细胞生 长的化合物。
【背景技术】
[0002] 口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的3%，位居第六位。口腔癌 的发病率在世界范围内呈上升趋势，发病年龄年轻化及女性增多趋势，估计全球每年新发 病例27. 4万例。口腔是人体的重要解剖学部位，口腔癌病人以外观受损、进食困难及疼痛 为主要症状，晚期还有张口困难、唾液减少、颈部僵硬等一系列临床表现。目前，对于口腔癌 主要采用手术治疗，放射治疗，化学药物治疗为主的综合序列治疗，但治疗效果往往不佳，5 年生存率不足50%。理想的抗癌药物应具备低毒、安全、有效、价廉等条件，因此亟需研发。
[0003]开发一种新药花费昂贵，周期长，应用现有已知的化合物，是寻找新抗癌药物的 有效手段。啼菌酯（别名阿米西达，英文名Azoxystrobin)是一种从蘑燕分离出来的 strobilurin类天然杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、保护、治疗等特点。嘧菌酯是一种线粒 体呼吸抑制剂，分子式C22H17N305，分子量403. 3875,CAS号131860-3-8,合成专利最早由英 国帝国化学工业公司申请。通过抑制细胞色素Bel向细胞色素C的电子转移，从而抑制线 粒体的呼吸。嘧菌酯毒性较低，对雌、雄大鼠的急性经口、经皮毒性均属低毒，雌、雄大鼠经 口LD50>5000mg/kg，急性经皮LD50>5000mg/kg，急性吸入LC50 (2h) >2474mg/m3,属低毒性， 致敏实验得出对豚鼠皮肤致敏率为0%。致畸实验结果显示嘧菌酯原药未引起人外周学淋 巴细胞染色体畸变率增高，目前尚未见报道有致突变、致畸和致癌作用。在大鼠体内的毒代 动力学特点是，嘧菌酯给药后lh血药浓度达到峰值，分布范围广，但在被测组织器官中未 有蓄积作用，排泄快，4h后主要以未经代谢的原型直接随粪便排出。
[0004]现有技术背景缺陷：化疗是口腔癌临床治疗常用方法之一，在口腔癌治疗中发挥 了重要的作用，但部分病例在化疗后机体对化疗药物出现了耐药现象，造成化疗失败，且副 作用较大。所以寻找新型低毒高效的治疗药物对口腔癌综合治疗具有重要意义。本发明所 涉及的化合物嘧菌酯为常见市售的广谱杀菌剂，主要用于农作物的病虫害防治，其制备方 法简单，杀虫效果好。我们研究发现嘧菌酯对口腔癌细胞的生长有显著的抑制作用，有望为 临床口腔癌治疗的新药研发提供科学依据。迄今，国内外尚未发现有关嘧菌酯与癌症相关 性研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对目前口腔癌综合治疗的缺陷，提供一种在制备用作抗肿瘤药 物中应用的化合物，为口腔癌的临床药物治疗提供新的支持。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。
[0007]具体包括以下步骤：
[0008] 1.啼菌酯为式⑴所不结构式的化合物，分子式为C22H17N305，化学名， (E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基）嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，CAS编号为 131860-33-8 ;外观为白色粉末状，分子量403. 34。本品也可溶于甲醇、甲苯、丙酮等其他有 机溶剂，但不以此为限，本发明中将嘧菌酯原药溶于DMSO,配制成50mg/ml贮存液，存于4°C 冰箱。
[0009]
[0010] 2.嘧菌酯对口腔癌细胞增殖的影响
[0011] 通过CCK-8法检测嘧菌酯对肿瘤细胞增殖的影响，其原理为在电子耦合剂存在的 情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物。颜色的深浅与 细胞的增殖成正比，使用酶标仪在450nM波长处测定0D值，以间接反映活细胞数量。
[0012] 将1. 5μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml不同浓度的啼菌酯分别作用于口腔癌 细胞SCC15,CAL2724h，48h，72h后，细胞增殖受到不同程度的抑制。随着药物浓度的升高， SCC15及CAL27细胞增殖抑制率亦随着升高。嘧菌酯作用于SCC15细胞24h，48h，72h的半 数抑制率IC50 分别为L82μg/ml,7· 51μg/ml和 8· 02μg/ml;CAL27 细胞 24h, 48h, 72h的 IC50分别为4. 4μg/ml，6.5μg/ml，和5. 9μg/ml。提示嘧菌酯对口腔癌细胞增殖具有抑制 作用。
[0013] 3.嘧菌酯对口腔癌前病变细胞增殖的影响
[0014] 将1. 5μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml不同浓度的啼菌酯分别作用于口腔 癌前病变细胞D0K24h，48h，72h后，细胞增殖受到明显的抑制。48h，72h的抑制率都在 90% -100%之间。提示嘧菌酯对口腔癌前病变细胞的增殖抑制作用尤其显著。
[0015] 综上所述，本发明拓展了嘧菌酯新的应用途径，为将嘧菌酯应用于抑制肿瘤细胞 生长上，使其能进一步应用包括于治疗口腔癌的医药组分中，改善口腔癌的治疗效果。本发 明对该化合物的应用的范围包括对于口腔癌细胞的生长抑制，进而抑制肿瘤的增生，从而 延缓肿瘤的恶化。同时，本发明中亦可将嘧菌酯利用于抑制口腔癌细胞生长的医药组成物 的成分中，还可包括药学上可接收的载体。载体可为赋形剂（如水）、填充剂（如蔗糖或淀 粉）、黏合剂（如纤维素衍生物）、稀释剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂，但并未仅限于此。 本发明医药制剂可依一般习知药学的制备方法生产制造，将嘧菌酯与一种以上的载体相混 合，此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶囊或其他液体制剂，但未以此为限。
[0016] 以下将配合图示进一步说明本发明的实施方式，
【附图说明】
[0017] 图1.嘧菌酯化学结构式；
[0018] 图2.嘧菌酯对SCC15细胞增殖的影响；
[0019] 图3.嘧菌酯对CAL27细胞增殖的影响；
[0020] 图4.嘧菌酯对D0K细胞增殖的影响；
【具体实施方式】
[0021] SCC15细胞培养于DMEM-F12培养基中，CAL27细胞和D0K细胞培养于DMEM高糖培 养基中，10%Gibco胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，并置于5%C02、95%空气、 37°C的饱和湿度孵箱中培养。细胞贴壁生长，2-3天传代一次，实验所需细胞均处于对数生 长期。
[0022] 采用CCK-8法检测细胞增殖。实验设置实验组，嘧菌酯浓度分别为1. 5μg/ml、 3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml;溶剂对照组，与实验组同浓度的DMS0。取对数生长期细胞， 用含0.25%EDTA胰酶消化，离心，弃上清。用含有10 %血清的培养基调整细胞浓度为 2. 5X104个/ml。每孔接种200μ1细胞悬液入96孔培养板内，每组4个复孔。贴壁过夜 后，吸弃上清，按组加入含有不同浓度漏芦ΕΑ的培养液（血清含量为10% )，并设溶剂对 照组继续培养不同时间（24h、48h、72h)。每孔加190μ1培养基和10μ1CCK8试剂，置于 37°C、5%C02饱和湿度孵箱内培养2. 5h后终止培养。在酶标仪上测定各孔吸光度（Α值）， 选择450nm波长，记录结果，并按以下公式计算增殖抑制率：增殖抑制率（％) = (A$JSS-A 空白组)/ 对醒-A空白组)X100%。
【主权项】
1. 一种化合物，具有下述结构：2. 如权利要求1所述的化合物，该化合物系 (E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基）啼啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙稀酸甲酯（methyl(E)_2_{2_[6_(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate)〇3. 权利1、2中所述化合物对口腔癌及癌前病具有显著干预作用。4. 一种用于抑制口腔癌细胞生长的制剂，包括有效剂量如权利要求1、2所述的化合物 以及药学上可接收的载体或稀释剂。5. 如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂为片剂、糖衣丸、胶囊、注射剂、溶 液、乳液、油膏、乳膏、吸入剂、气雾剂或栓剂。6. 如权利要求1、2所述的化合物或权利要求4、5中所述的制剂在制备防治口腔癌的药 物中的应用。
【专利摘要】本发明关于一种化合物嘧菌酯(E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯(methyl(E)-2-{2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate)的新用途和用于显著抑制口腔癌细胞的制剂，属于抗肿瘤药物研发领域。嘧菌酯获取方法简便，化学结构明确，采用CCK-8法对口腔癌细胞SCC15和CAL27以及口腔癌前病变DOK细胞的增殖活性进行检测，实验结果显示有明显的增殖抑制作用，本发明为临床治疗口腔癌新药的研发提供实验依据，可应用于抑制口腔癌细胞生长的制剂中。
【IPC分类】A61K31/505, A61P35/00, C07D239/52
【公开号】CN105250303
【申请号】CN201510778439
【发明人】汤晓飞, 王春晓, 陈慧, 张敏
【申请人】首都医科大学附属北京口腔医院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月13日