一种预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗及制备方法，属于生物医药技术 领域。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一种人畜共患病的重要致病菌，可 引起人体局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎甚至败血症、脓毒血症等全身感染，美国 每年因被金黄色葡萄球菌感染而丧生的人数已超过死于艾滋病人数；在动物感染方面，金 黄色葡萄球菌可引起牛羊乳房炎、猪羊皮炎和流产、羔羊败血病、马创伤性感染、脓肿、蜂窝 织炎、鸡的坏疽性皮炎、败血病等疾病，造成了我国每年上百亿元的经济损失。同时，金黄色 葡萄球菌也是国内外最常见的细菌性食物中毒病原之一，由其引起的食物中毒占细菌性食 物中毒的33%。因此，金黄色葡萄球菌的防治具有重要的经济意义和公共卫生学意义。 [0003]目前，金黄色葡萄球菌的防治主要依靠抗生素和疫苗。使用抗生素易产生耐药性， 导致治疗用药量及饲料用药升高；抗生素的使用使机体抵抗力下降，易发生各种细菌性及 病毒性疾病；养殖业中使用的抗生素经过食物链进入人体，危害人类健康。
[0004] 疫苗方面，基因工程黏膜免疫活载体疫苗是目前研究的热点。金黄色葡萄球菌主 要黏附素一一纤黏蛋白原凝集素 A(ClfA)与乳腺、皮下、血管、心内膜等的感染有关。编码 ClfA的基因 clfA在迄今为止所有临床分离的金黄色葡萄球菌中都存在。所以，以黏附素 ClfA作为靶位进行疫苗研制是预防金黄色葡萄球菌感染的有效途径。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗及制备方 法，所采取的技术方案如下：
[0006] 本发明的目的在于提供一种预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗，该疫苗含有金黄色 葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的纤黏蛋白原凝集素 A，所述纤黏蛋白原凝集素 A的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 优选地，所述纤黏蛋白原凝集素 A，包含在菌液浓度为6. 0 X 10sCFU/mL的重组乳酸 乳球菌中。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种所述疫苗的制备方法，该方法的步骤如下：
[0009] 1)提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA ;
[0010] 2)以步骤1)所得的金黄色葡萄球基因组DNA为模板，扩增金黄色葡萄球菌的纤黏 蛋白原凝集素 A基因 clfA ;
[0011] 3)利用步骤2)所得的纤黏蛋白原凝集素 A基因 clfA构建重组质粒，并将重组质 粒导入到宿主菌中，获得重组菌；
[0012] 4)培养步骤3)所得的重组菌，获得重组菌培养液；
[0013] 5)洗涤步骤4)所得重组菌培养液并调整培养液的浓度，获得疫苗。
[0014] 优选地，步骤1)所述金黄色葡萄球菌，是金黄色葡萄球菌ATCC25923。
[0015] 优选地，步骤2)所述扩增，所用引物的序列如SEQ ID NO. 2-SEQ ID N0. 3所示。
[0016] 优选地，步骤3)所述宿主菌，是乳酸乳球菌MG1363。
[0017] 优选地，步骤4)所述培养，培养条件为：培养温度30°C，培养时间为28h，所用培养 基为MRS培养基。
[0018] 优选地，步骤5)所述洗涤，是用生理盐水洗涤3次；所述调整培养液浓度，是利用 生理盐水将培养液中的菌浓度调至6. OX 10sCFU/mL。
[0019] 所述制备方法的具体步骤如下：
[0020] 1)采用CTAB法提取金黄色葡萄球菌ATCC25923的基因组DNA ;
[0021] 2)以步骤1)所得的金黄色葡萄球基因组DNA为模板，以SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示的序列为引物，扩增金黄色葡萄球菌的纤黏蛋白原凝集素 A基因 clfA ;
[0022] 3)将步骤2)所得的金黄色葡萄球菌的纤黏蛋白原凝集素 A基因 clfA插入到重组 质粒pMG36c中，构建重组质粒pMG36c-clfA，再将所得的重组质粒电转化到宿主菌乳酸乳 球菌MG1363中，获得重组乳酸乳球菌；
[0023] 4)利用MRS培养基，在培养温度30°C的条件下培养步骤3)所得的重组乳酸乳球 菌28h，获得重组菌培养液；
[0024] 5)利用无菌生理盐水洗涤步骤4)所得重组菌培养液3次后，再利用无菌生理盐水 将培养液中的菌浓度调节至6. OX 10sCFU/mL。
[0025] 本发明有益效果：
[0026] 1、本发明制备的以乳酸乳球菌为载体的预防金黄色葡萄球菌感染疫苗可通过口 服方式免疫机体，口服免疫的优点是可有效激发肠道局部免疫，进而激发全身免疫，且特别 适合预防肠道传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，还可节省注射 人工成本。但是疫苗口服免疫必须解决免疫原在到达小肠激发机体免疫反应前容易被降 解和失活的弊端，解决这一弊端最好的方法是采用活的载体系统来递呈完整的抗原。常用 的活载体是致弱病原菌和病毒，但二者存在着毒力恢复的可能，在应用于老人、儿童以及免 疫力低下的机体时，受到了很大的限制。乳酸乳球菌作为递呈抗原的活载体，具有以下优 点：乳酸乳球菌是食品级的安全微生物，使用安全；其不在人和动物肠道内定殖，避免了长 期免疫刺激引起的免疫麻痹；乳酸乳球菌能起到免疫佐剂的作用；乳酸乳球菌分泌的蛋白 很少，外源蛋白表达后不需要特殊的提取、纯化，避免了抗原损失。
[0027] 2、采用本发明制备的疫苗对免疫组小鼠的保护率达92. 5%，是一种高效、安全、使 用方便、成本低廉的预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗。
【附图说明】
[0028] 图1为金黄色葡萄球菌基因组DNA检测结果；
[0029] (图中，1-4 :金黄色葡萄球菌 DNA ;M :Marker 5000)。
[0030] 图2为金黄色葡萄球菌clfA基因扩增检测；
[0031] (图中，1-5 :PCR 产物；M :Marker 5000)。
[0032] 图3为重组质粒粗提取验证结果；
[0033] (图中，1 :pMG36c质粒；2 :转化子1 ;3 :转化子2 ;4 :转化子3 ;5 :转化子4 ;M: Marker 5000)〇
[0034] 图4为重组质粒提取验证结果；
[0035] (图中，1 :pMG36c 质粒；2 :转化子 3 ;3 :转化子 1 ;4 :转化子 2 ;M :marker 5000)。
[0036] 图5为重组质粒单酶切和双酶切验证结果；
[0037] (图中，1 :PCR产物；2 :pMG36c ;3 :重组质粒/Sal I ;4 :重组质粒/Sma I ;5 :重组 质粒/Sma I+Sal I ;M:marker 5000)。
[0038] 图6为转化子筛选结果；
[0039] (其中，a为转化pMG36C-clfA乳球菌生长在抗性平板；b为转入pMG36c质粒的乳 球菌生长在抗性平板；c为乳球菌感受态生长在无抗性的平板；d为乳球菌感受态生长在有 抗性的平板）。
[0040] 图7为重组蛋白的检测结果；
[0041 ](图中，1 :Marker ;2:转化pMG36C的菌株全蛋白；3:转化pMG36C_clfA的菌株全 蛋白）。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0043] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0044] 1.菌种、质粒和动物
[0045] ⑴金黄色葡萄球菌ATCC25923、ATCC6538购自中国医学细菌保藏管理中心；⑵乳 酸乳球菌MG1363、质粒pMG36c购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；⑶大肠杆菌感 受态细胞JM109由本实验室保存；(4) IRC清洁级小鼠，雌性，体重14~16g，购自黑龙江中 医药大学。
[0046] 2.酶、试剂及培养基
[0047] ⑴凝胶回收试剂盒MinElute Gel Extraction Kit、质粒提取试剂盒购自Omega 公司；⑵高保真Taq酶KOD-Plus、高效连接试剂盒Ligation high购自东洋纺（上海）生 物科技有限公司；⑶限制性内切酶、连接酶均购自大连TaKaRa生物技术公司；(4) MRS液体 培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；?Electroporation Buffer :0.4mol/L鹿 糖，5mmol/L 磷酸二氢钠，lmmol/L 氯化镁，用 HC1 调 pH 值为 6· 0 ;(6) milk medium :0· 2mol/ L蔗糖，5 %脱脂乳，0. 1 %酵母提取物，1 %酪蛋白氨基酸，25mmo 1/L氯化镁，115°C高压灭菌 20min，贮存于4°C ;(7)其它试剂均为国产分析纯。
[0048] 3.主要仪器
[0049] ⑴酶标仪、电击转化仪等美国Bio-Rad公司产品；⑵PC