获得转化子数目约为150个；阴性对照（即未转化质粒的感受态细胞）在 抗性平板上未生长，在未含抗生素的平板上生长；阳性对照（即转化PMG36C的感受态细 胞）在抗性平板上生长，有转化子，结果如图6所示。
[0088] PCR检测情况：从转化子中提取质粒，而从感受态细胞中未提到质粒；对提取的质 粒进行酶切验证，Sal I，Sma I以及双酶切结果，均与预期结果相同；以提取的质粒为模板， 进行PCR扩增，获得了 3000bp的目标条带，表明转化成功。
[0089] 实施例5重组蛋白的表达
[0090] 1.试验方法
[0091] 1. 1基因工程菌株的培养
[0092] 将含有重组质粒的乳酸乳球菌在MRS液体培养基中静置培养过夜，按2%的接种 量接种于新鲜MRS液体培养基中，继续静置培养至对数后期，离心收集菌体，电泳检测。
[0093] 1. 2蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0094] 蛋白样品加入SDS凝胶上样buffer，煮沸5min，冷却后上样；制胶参照《分子克 隆实验指南（第三版）》灌制SDS聚丙烯酰胺凝胶；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的 低板，小心将梳子拔出；按预定顺序加样，每个样品的上样量为20 yL~40 yL ;进行电泳， 设置稳压状态，浓缩胶电压60V，电流约10~15mA ;分离胶电压150V，电流约25~30mA， 电泳3~4h，至指示剂溴酚兰到达底部；拆开玻璃板，剥离凝胶，将凝胶放入染色液中染色 40min ;将染色后的凝胶转入脱色液中脱色2h，期间换脱色液2~3次。
[0095] 2.试验结果
[0096] 基因全长2802bp，编码933个氨基酸，预测分子量为96942Da。蛋白电泳显示，与 对照菌株（转化PMG36C)相比，转化pMG36C-clfA的菌株，在97KDa附近，有一蛋白条带，表 明clfA基因成功表达，结果如图7所示。
[0097] 实施例6疫苗制备
[0098] 无菌操作，将重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株接种到液体MRS培养基 中，30°C静止培养28小时，得到新鲜培养液；培养液4000r/min离心30min，收集沉淀；沉淀 用无菌生理氯化钠溶液洗涤，4000r/min离心30min，共洗涤3次；离心收集菌体，用细菌麦 氏浊度仪将菌体用无菌生理氯化钠溶液校正为6. Ο X 10sCFU/mL菌悬液，制成疫苗，4°C冰箱 内保存，上述操作全程在百级洁净无菌间内进行。
[0099] 实施例7疫苗免疫保护试验
[0100] 为了验证本发明利用基因工程手段制备的预防金黄色葡萄球菌感染疫苗的保护 效果，选择清洁级小鼠作为实验动物，进行小鼠免疫保护试验。
[0101] 1.1试验方法
[0102] 1. 1. 1疫苗免疫方法
[0103] 选用体重14~16g的清洁级小鼠40只作为免疫组，使用疫苗灌胃免疫，第一次免 疫期为7天，3次/天，0. 5mL/只小鼠；间隔5天，进行第二次免疫，免疫期为7天，3次/天， 0. 5mL/只小鼠。
[0104] 1. 1. 2攻毒菌株ATCC6538最小致死量测定
[0105] 选用金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株37°C培养12~16小时的营养琼脂培养物， 用细菌麦氏浊度仪以生理氯化钠溶液稀释成含菌4. 0 X 10s/mL、3. 6 X 10s/mL、3. 2 X 108/ mL、2. 8X10s/mL、2. 4X10s/mL、2. 0X10s/mL、l. 6X10s/mL、l. 2X10s/mL、8. 0X107/mL、 4. OX 107/mL、2. OX 107/mL等浓度的菌悬液，用每一稀释度的菌悬液，腹腔注射5只体重为 14~16g小鼠，每只小鼠注射量为0. 5mL，观察3天，使小鼠于感染后3天内全部死亡的最 小剂量为1个最小致死量（MLD)。
[0106] 1. 1. 3疫苗免疫效果测定
[0107] 于第二次免疫结束后第11天，免疫组小鼠每只腹腔注射1MLD的ATCC6538新鲜菌 悬液（含于〇. 5mL中），同时应用同批饲养的、体重与免疫组相同的小鼠3组（每组5只） 作对照，分别于腹腔注射2、1及1/2MLD的ATCC6538新鲜菌悬液（含于0. 5mL中）；观察3 天，进行结果判定：对照组小鼠感染2及1MLD者应全部死亡，感染1/2MLD者应有部分死亡， 计算免疫组小鼠保护率。
[0108] 2.试验结果
[0109] 2. 1攻毒菌株ATCC6538最小致死量测定结果
[0110] ATCC6538菌株1. 6 X 10s/mL组及以上浓度组5只小鼠均全部死亡，1. 2 X 10s/mL组 及以下浓度组5只小鼠部分死亡或未死亡，因此，金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株的MLD为 0. 8X108,结果见表1。
[0111] 表1金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株MLD测定结果
[0112]
[0113] 2. 2疫苗免疫效果测定结果
[0114] 2MLD对照组、1MLD对照组小鼠全部死亡，1/2MLD对照组小鼠有2只死亡，免疫组 40只小鼠有3只死亡，其余37只小鼠均存活，疫苗对免疫组小鼠的保护率达到92. 5%，结 果见表2。
[0115] 表2重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株免疫效果测定结果
[0117] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗，其特征在于，含有金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)的纤黏蛋白原凝集素A，所述纤黏蛋白原凝集素A的氨基酸序列 如SEQIDNO. 1 所示。2. 权利要求1所述一种预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗，其特征在于，所述纤黏蛋白 原凝集素A，包含在菌液浓度为6. 0X10sCFU/mL的重组乳酸乳球菌中。3. -种权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下： 1) 提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA; 2) 以步骤1)所得的金黄色葡萄球基因组DNA为模板，扩增金黄色葡萄球菌的纤黏蛋白 原凝集素A基因clfA; 3) 利用步骤2)所得的纤黏蛋白原凝集素A基因clfA构建重组质粒，并将重组质粒导 入到宿主菌中，获得重组菌； 4) 培养步骤3)所得的重组菌，获得重组菌培养液； 5) 洗涤步骤4)所得重组菌培养液并调整培养液的浓度，获得疫苗。4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述金黄色葡萄球菌，是金黄色 葡萄球菌ATCC25923。5. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤2)所述扩增，所用引物的序列如 SEQIDNO. 2-SEQIDNO. 3 所示。6. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤3)所述宿主菌，是乳酸乳球菌 MG1363。7. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤4)所述培养，培养条件为：培养温 度30 °C，培养时间为28h，所用培养基为MRS培养基。8. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤5)所述洗涤，是用生理盐水洗涤3 次；所述调整培养液浓度，是利用生理盐水将培养液中的菌浓度调至6.OX10sCFU/mL。9. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 采用CTAB法提取金黄色葡萄球菌ATCC25923的基因组DNA; 2) 以步骤1)所得的金黄色葡萄球基因组DNA为模板，以SEQIDNO. 2-SEQIDNO. 3所 示的序列为引物，扩增金黄色葡萄球菌的纤黏蛋白原凝集素A基因clfA; 3) 将步骤2)所得的金黄色葡萄球菌的纤黏蛋白原凝集素A基因clfA插入到重组质 粒pMG36c中，构建重组质粒pMG36c-clfA，再将所得的重组质粒电转化到宿主菌乳酸乳球 菌MG1363中，获得重组乳酸乳球菌； 4) 利用MRS培养基，在培养温度30°C的条件下培养步骤3)所得的重组乳酸乳球菌 28h，获得重组菌培养液； 5) 利用无菌生理盐水洗涤步骤4)所得重组菌培养液3次后，再利用无菌生理盐水将培 养液中的菌浓度调节至6.OX10sCFU/mL。
【专利摘要】本发明公开了一种预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗及制备方法，属于生物医药技术领域。本发明所提供的疫苗含有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus？aureus)的纤黏蛋白原凝集素A，其中纤黏蛋白原凝集素A的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。同时，本发明还提供了制备疫苗的方法。本发明所提供的疫苗可以通过口服方式经由消化道免疫动物，免疫效果明显，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题。
【IPC分类】A61K39/085, C12N15/74, A61P31/04
【公开号】CN105288606
【申请号】CN201510762059
【发明人】曲晓军, 王金英, 潘钰, 原韬, 孙建华, 于冲, 夏海华
【申请人】黑龙江省科学院微生物研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月10日