用于增强免疫应答的哺乳动物乳骨桥蛋白的制作方法
【专利说明】用于增强免疫应答的晡乳动物乳骨桥蛋白 发明领域
[0001] 本发明涉及在哺乳动物例如人受试者中提高对感染性疾病的免疫应答，以及在哺 乳动物诸如人中增强用于预防性或治疗性治疗感染性疾病的疫苗接种的功效。已经发现口 服给予哺乳动物乳骨桥蛋白（0ΡΝ)或其活性截短部分可增强哺乳动物的免疫应答，并且增 强由哺乳动物中的疫苗接种诱导的免疫应答，从而增强疫苗接种的预防性或治疗性功效。
[0002] 发明背景
[0003] 免疫系统针对活生物体中的疾病提供主要的防御机制，因此病原体和外来生物体 被免疫系统的组分检测到并且消除。先天免疫应答针对感染起第一道防线的作用，该先天 免疫应答包括多样的细胞组分，包括粒细胞（嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细 胞）、肥大细胞、自然杀伤细胞（NKC)和抗原呈递细胞（APC)，诸如巨噬细胞和树状细胞（DC) 以及可溶性因子，诸如补体蛋白。作为第二道防线的适应性免疫应答较慢地形成，并且包 括选择细胞应答与体液应答用于消除病原体。细胞免疫主要是Thl诱导的，从而引起用来 破坏受损宿主细胞（例如经病毒或病原体感染的细胞）的细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞 (NKC)和活化巨噬细胞的分化。体液免疫表现为抗原特异性和抗原记忆增加，因此Th2活化 和细胞因子产生引起产生抗体的B细胞和记忆细胞的生成，这些产生抗体的B细胞和记忆 细胞有助于识别病原体来源的抗原和病原体消除。
[0004] 新生哺乳动物中的先天免疫是不发达的，这样使得新生儿中的抗病性严重地依赖 于被动获取通过母体乳汁（具体地，初乳）得到的母体抗体。与此同时，婴儿免疫系统的发 育通过存在于母乳中的免疫刺激组分来诱导。在喂食配方乳而不是母乳的新生哺乳动物中 的免疫系统的发育延迟，其原因是将以另外的方式提供于母乳中的主要的免疫诱导和免疫 赋予组分的缺乏。
[0005] 在整个生命中维持免疫系统仍然是健康所必需的，并且因此任何年龄的免疫受损 个体以及具有稳步下降的免疫的老年个体代表着处于更高疾病相关死亡率的风险中的患 者群。
[0006] 提升对感染性疾病的免疫抵抗力的疫苗接种是改善公共卫生的最有效方法。疫苗 可供使用的疾病范围正在不断地增加，并且使用这些疫苗来保护成年群体（具体地，不断 增加的老年群体）也正在增加。预防性或者治疗性的疫苗接种刺激身体的免疫系统，以便 识别类似于给定的致病剂的抗原剂，破坏它，并且"记住"它，这样使得当再次暴露时免疫系 统可以更容易地识别并且破坏该致病剂。典型地，这样一种试剂是从病原性微生物的削弱 或杀死的形式、它的毒素或它的表面蛋白中的一种制得。
[0007] 因为疫苗接种的功效取决于已接种疫苗的受试者提升有效免疫应答的能力，所以 疫苗接种的益处在免疫系统没有完全发育的个体中（如在新生或年幼的婴儿中）或者在其 免疫系统下降、受损或衰退的个体中（如在一些成年人和老年人中）有所减少。因此，存在 对能够在这些患者群中增强免疫应答（具体地，对疫苗接种的免疫应答）的试剂的需要。对 这些大量的患者群体进行疫苗接种的公共卫生计划必须是极其安全的，并且因此用来增强 对疫苗接种的免疫应答的试剂和用于这些试剂给予的手段两者必须满足这些安全要求。
[0008] 骨桥蛋白（0ΡΝ)是由多种细胞类型表达的细胞外基质蛋白，这些细胞类型包括破 骨细胞、成骨细胞、巨噬细胞、活化的Τ细胞、平滑肌细胞以及上皮细胞。该骨桥蛋白存在于 若干个组织中，这些组织包括骨、肾、胎盘、平滑肌以及分泌上皮细胞。0ΡΝ能够介导细胞粘 附和迀移，并且与正常的组织重塑过程诸如骨再吸收、血管发生、伤口愈合以及组织损伤相 关联。0ΡΝ还在某些患病的状态下表达，例如再狭窄、动脉粥样硬化、肾病以及肿瘤发生。已 经观察到编码0ΡΝ的基因的修改的转录，其中改变的剪接转录物在某些疾病状态下引起不 同形式的0ΡΝ的表达（比松内特（Bissonnette)等人2012)。0ΡΝ通过与整联蛋白相互作 用而发挥它的许多生物作用，这些整联蛋白包括一个大家族的介导细胞-细胞和细胞-基 质相互作用两者的异源二聚体跨膜受体，并且该0ΡΝ可以在炎症疾病中起作用。
[0009] W0 98/56405 A1涉及一种通过改变（增加或降低）骨桥蛋白活性来调制（增大或 减少）个体的免疫应答的方法；但缺乏证据支持向受试者给予0ΡΝ(例如重组0ΡΝ)的治疗 作用。
[0010] WO 00/63241 A2涉及作为免疫应答调节剂的Eta-1/骨桥蛋白；但没能证明给予 0ΡΝ可增强对感染性疾病的免疫抵抗力。
[0011] 卡哈吉（Khajoee)V等人，2006 临床与实验免疫学（CLINICALANDEXPER頂ENTAL IMMUNOLOGY)，143(2) :260-268涉及，基于使用人单核细胞来源的巨噬细胞培养物所进行的 研究的骨桥蛋白在对抗分枝杆菌感染的防御上的作用。
[0012] 附图简述
[0013] 图1动物测试群体和研究设计。将小猪分成接受大母猪代乳品配方（FF;n= 10) 或用140mg/L骨桥蛋白补充的配方（0ΡΝ;n= 12)或者大母猪养育（SR;n= 7)的三个膳食 组。
[0014] 图2属于接受大母猪代乳品配方（FF;n= 10)或用140mg/L骨桥蛋白补充的配方 (0ΡΝ;n= 12)的膳食组的小猪，以及示于插图中的大母猪养育的小猪（SR;n= 7)的产后 平均每日体重。
[0015] 图3通过ELISA所测量的来源于7天龄、14天龄和21天龄的小猪的血清中的 Fluzone?特异性IgG效价。未接种疫苗的小猪中的流感病毒疫苗特异性IgG水平示于插 图中。数据被表达为平均值土SD。不同下标是指在p〈0. 05处的统计学显著性。未接种疫 苗的组中的上标是指统计学显著的时间差异；接种疫苗的图中的上标指示在第21天时膳 食处理组之间的差异。
[0016] 图4通过ELISA所测量的在接种疫苗和未接种疫苗的小猪的血清中的总IgG浓 度。该血清来源于7天龄、14天龄和21天龄的小猪血液样品。在第21天时取得的样品中 所测量的总IgG水平示于插图中。数据被表达为平均值土SD。上标是指随时间推移的统计 学显著的差异。
[0017] 图5通过ELISA所测量的来源于7天龄、14天龄和21天龄的小猪的血清中的总 IgM浓度。数据被表达为平均值土SD。上标是指随时间推移的统计学显著的差异。
[0018] 图6对于CD4(克隆74-12-4)和CD8(克隆76-2-11)所染色的PBMCT淋巴细 胞群体的流式细胞术散点图。4个象限绘制了⑶8+淋巴细胞（具有⑶3+⑶4-⑶8+分布 (profile)的细胞毒性T细胞）；⑶4+淋巴细胞（具有⑶3+⑶4+⑶8-分布的T辅助细胞）、 ⑶4+⑶8+淋巴细胞（具有⑶3+⑶4+⑶8+分布的记忆T细胞）。
[0019] 图7膳食对第21天时PBMC中的T辅助细胞⑶4+细胞（图A)、细胞毒性⑶8+T 细胞（图Β)的丰度和对⑶4+/⑶8+比率（图C)的作用。细胞群体被表达为总⑶3+Τ细胞 的％。数据被表达为平均值土SD，并且不同上标指示在p〈0. 05处的统计学显著的差异。* 指示在P〈〇. 1处的统计趋势。
[0020] 图8膳食对第21天时MLN中的细胞毒性⑶8+T细胞（图A)的丰度和对⑶4+/ CD8+T细胞比率（图B)的作用。细胞群体被表达为总CD3+T细胞的％。数据被表达为平均 值土SD，并且不同上标指示在p〈0. 05处的统计学显著的差异。*指示在p〈0. 1处的统计趋 势。
[0021] 图9膳食对第21天时脾中的记忆（⑶4+⑶8+)T细胞的丰度的作用。细胞群体被 表达为总⑶3+T细胞的％。数据被表达为平均值土SD，并且不同上标指示对于疫苗接种组 内的膳食作用的在P〈〇. 05处的统计学显著的差异；*指示对于疫苗接种作用的在p〈0. 05 处的统计学显著性。
[0022] 图10由PBMC细胞产生的IL-12分泌。将PBMC细胞离体培养72小时，收集条件 培养基并且通过ELISA分析IL-12。数据被表达为平均值土SD，并且不同上标指示对于处 理组之中的膳食作用的在P〈〇. 05处的统计学显著的差异；*指示对于疫苗接种作用的在 p〈0. 05处的统计学显著性。
[0023] 图11植物凝集素（PHA)刺激对PBMC分泌IL-12 (A)和IL-10⑶的作用。在PHA 存在下将PBMC细胞离体培养72小时，收集条件培养基并且通过ELISA分析IL-10和IL-12。 数据被表达为平均值土SD，并且不同上标指示对于处理组之中的膳食作用的在p〈0. 05处 的统计学显著的差异；*指示对于膳食作用的在P〈〇. 1处的统计趋势。
[0024] 图12脂多糖（LPS)刺激对PBMC分泌IL-12 (A)、IL-6⑶和IL-10 (C)的作用。在 LPS存在下将PBMC细胞离体培养72小时，收集条件培养基并且通过ELISA分析IL-6、IL-10 和IL-12。数据被表达为平均值土SD，并且不同上标指示对于处理组之中的膳食作用的在 p〈0. 05处的统计学显著的差异；*指示对于疫苗接种作用的在p〈0. 05处的统计学显著性。
[0025] 图13流感病毒疫苗刺激对PBMC分泌IL-12 (A)和IL-10 (B)的作用。在流感病毒 疫苗存在下将PBMC细胞离体培养72小时，收集条件培养基并且通过ELISA分析IL-10和 IL-12。数据被表达为平均值土SD，并且不同上标指示处理组之中的在p〈0. 05处的统计学 显著的差异；*指示对于疫苗接种作用的在P〈〇. 05处的统计学显著性。
[0026] 图14由脾细胞产生的IL-12(A)和IL-10⑶分泌。将脾细胞离体培养72小时， 收集条件培养基并且通过ELISA分析IL-6、IL-10和IL-12。数据被表达为平均值土SD，并 且不同上标指示对于处理组之中的膳食作用的在P〈〇. 05处的统计学显著的差异；*指示对 于疫苗接种作用的在P= 〇. 07处的趋势。
[0027] 图15植物凝集素（PHA)刺激对脾分泌IL-12 (A)和IL-10⑶的作用。在PHA存 在下将脾细胞离体培养72小时，收集条件培养基并且通过ELISA分析IL-10和IL-12。数 据被表达为平均值土SD;不同上标指示处理组之中的在p= 0. 07处的统计趋势；*指示对 于疫苗接种作用的在P〈〇. 05处的统计学显著。
[0028] 图16脂多糖（LPS)刺激对脾分泌IL-12 (A)和IL-10⑶的作用。在LPS存在下 将脾细胞离体培养72小时，收集条件培养基并且通过ELISA分析IL-10和IL-12。数据被 表达为平均值土SD，并且不同上标指示对于处理组之中的膳食作用的在p〈0. 05处的统计 学显著的差异；*指示对于疫苗接种作用的在P〈〇.05处的统计学显著。
[0029] 图17流感病毒疫苗刺激对脾分泌IL_12(A)和IL-10(B)的作用。在流感病毒疫 苗存在下将脾细胞离体培养72小时，收集条件培养基并且通过ELISA分析IL-10和IL-12。 数据被表达为平均值土SD，并且不同上标指示对于处理组之中的膳食作用的在p〈0. 05处 的统计学显著的差异；*指示对于疫苗接种作用的在P〈〇. 05处的统计学显著。
[0030] 图18当存在以下情况时的年龄在从1至6月龄的婴儿中的发热发病率：1)母乳 喂养；2)用没有0ΡΝ添加的常规配方（RF) (F0)喂养；3)用添加大约65mg0PN/L的牛0ΡΝ 的RF(F65)喂养以及4)用添加大约130mg0PN/L的牛0ΡΝ的RF(F130)喂养。发病率以时 间的百分比给出，该时间是属于每个处理组的婴儿在一个日历月的周期过程中被记录为有 发烧的时间（记录的时间/日历月值是随临床试验的周期记录的值的平均值）。
[0031] 发明概述
[0032]当口服给予时，出乎意料地发现哺乳动物乳骨桥蛋白（0ΡΝ)和/或其活性截短物 可在哺乳动物受试者中增强