30g、黄苗15 g、知母15 g、葛根15 g、五味子15 g、天花粉15 g、鸡内金10 g;制法:药材饮片按处方剂量称取，分别以10倍量、8倍量、6倍量30%乙醇回流 提取3次，每次提取时间I h，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎，即得。
[0030] 对比药物C:处方：山药30g、黄苗15 g、知母15 g、葛根15 g、五味子15 g、天花粉15 g、鸡内金10 g;制法:药材饮片按处方剂量称取，分别以10倍量、8倍量、6倍量70%乙醇回流 提取3次，每次提取时间I h，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎，即得。
[0031] 对比药物D:处方：山药30g、黄苗15 g、知母15 g、葛根15 g、五味子15 g、天花粉15 g、鸡内金10 g;制法：（1)取所述重量的黄芪、葛根、五味子中药粗粉，用5倍重量的70%乙醇 加热回流提取2次，每次1小时，合并提取液、滤过，滤液回收乙醇至无醇味，备用；（2)取所述 重量的山药、知母、天花粉，加7倍重量水煎煮2次，每次1小时，合并提取液、滤过，滤液减压 浓缩至相对密度为1.10-1.20(室温）的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达70%，搅匀，静置12小 时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，备用；（3)取（1)和(2)所得滤液合并，搅匀，真空干燥后粉 碎成80~100目细粉，与粉碎成100目的鸡内金细粉混匀，即得。
[0032] 对比药物E:处方：山药30g、黄苗15 g、知母15 g、葛根15 g、五味子15 g、天花粉15 g、鸡内金10 g;制法:一、准备药材:首先称取15 g黄芪、15 g知母、30g山药、IOg鸡内金、15g 葛根、15g五味子和15g天花粉，即得到待煎煮药材;二、煎煮:①首先向待煎煮药材中加入 去离子水，并煎煮1~2h，然后采用过滤方法将第一次煎液和第一次煎煮后药材分离;②向 步骤二①中经分离得到的第一次煎煮后药材中加入去离子水，并煎煮1~2h，然后采用过滤 方法将第二次煎液和第二次煎煮后药材分离;③向步骤二②中经分离得到的第二次煎煮 后药材中加入去离子水，并煎煮1~2h，然后采用过滤方法去除煎煮后药材，并将得到的煎 液与第一次煎液和第二次煎液合并，得到待处理煎液;三、成品：将待处理煎液在温度为70 °C~90°C的条件下浓缩至相对密度1.04g/cm 3~1.12g/cm3,得到初清膏，将初清膏在离心速 度为3500r/min~4500r/min下离心8min~12min，然后将分离得到的上清液在温度为70°C ~90°C的条件下浓缩至相对密度1.02g/cm3~1.10g/cm3，得到清膏，最后采用冷冻干燥技 术将清膏共冷冻干燥时间35h~45h，即得到玉液汤冻干口服制剂。
[0033]链脲佐菌素(STZ)，购自Sigma公司； 吡拉西坦片(脑复康），上海华源安徽仁济制药有限公司，国药准字H34020741; 石杉碱甲片，河南太龙药业股份有限公司，国药准字H10940156; 盐酸二甲双胍片，辽宁一成药业有限公司，国药准字H21024375; (2)试剂 AchE(ELISA)试剂盒、AGEs(ELISA)试剂盒和ChAT(ELISA)试剂盒，以上试剂盒均购于艾 莱萨生物科技(上海)有限公司;RAGE和NF-kB免疫组化试剂盒，购自武汉博士德生物工程有 限公司。
[0034] 1.2仪器 Morris水迷宫，上海吉量软件科技有限公司;BT224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限 公司；BI-2000医学图像分析系统，成都泰盟软件有限公司;Eon全波长酶标仪，美国BioTek; Thermo-86度低温冰箱;微量移液器，上海求精生化试剂仪器有限公司，TGL-16M台式高速冷 冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；三诺安稳血糖仪，三诺生物传感股份有限公 司。
[0035] 1.3 动物 雄性SD大鼠，清洁级，体重250~300g，由第四军医大学实验动物中心提供，合格证号： SCXK(军）2012-006;饲养环境:陕西中医学院中药药理实验室，动物分笼饲养，保持12h昼夜 节律，室温(22 ± I)°C，自由饮水摄食。
[0036] 2.方法 2.1造模与分组 雄性SD大鼠适应性喂养1周，除空白组给予基础饲料外，其余大鼠给予自制高脂高糖饲 料(基础饲料59%、猪油18%、蔗糖20%、蛋黄3%)喂养50天后，一次性腹腔注射STZ 30mg/kg(临 用前溶于0.1mol/L、pH4.2的柠檬酸缓冲液中配置成1%的浓度），72小时后尾静脉采血用血 糖仪测血糖，以血糖浓度2 16.7mmol/L为造模成功，模型成功后大鼠随机分为模型组、脑 复康组(0.48g/kg)、石杉碱甲组（40yg/kg)、盐酸二甲双胍组（0.15g/kg)、本发明药物组 (11.5g/kg)、对比药物A组（11.5g/kg)、对比药物B组（11.5g/kg)、对比药物C组（11.5g/kg)、 对比药物D组（11.5g/kg)、对比药物E组（11.5g/kg)，模型分组后第二天开始灌胃给药，空白 组和模型组均灌胃等容量生理盐水，1次/ d，给药30d，给药期间动物自由进食进水，未使用 胰岛素及其它降糖药物。
[0037] 2.2 Morris水迷宫实验 采用Morris水迷宫法进行大鼠记忆功能的测定:①定位航行实验:于最后一次灌胃后 Ih开始。每组随机取10只大鼠，每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每次分别 从4个不同的标记点(在4个象限中平均分布），将大鼠面向池壁放入水中，记录90s内寻找平 台所需时间（逃避潜伏期)及搜索距离。每次至少间隔30min，训练共历时4d。平台位置在同 一批大鼠训练及测试过程中保持不变。如果大鼠在90s内仍未找到平台，将其重新置于平 台，20s后移出迷宫，其潜伏期记为90s。②空间探索实验:第5天撤除平台，任选1个入水点将 大鼠面向池壁投入水中，记录大鼠在90s内跨过虚拟平台的穿越次数及大鼠在目标象限(原 站台象限）的游泳时间。
[0038] 2.3取材与标本处理 水迷宫实验结束后，禁食不禁水12h后，每组除随机剩余的4只大鼠外其余大鼠称重，尾 静脉采血测血糖后处死，迅速取脑，放在冰冷生理盐水中漂洗，滤纸吸干水分，分离海马组 织，称重，在冰浴下用匀浆器匀浆，制成重量体积比为10%的组织匀浆，离心（3500r/min) 10 min，取上清液严格按试剂盒说明测定AchE、AGES和ChAT各项指标。每组将剩余4只大鼠，麻 醉后，4%多聚甲醛0.1mol · I/1磷酸缓冲液(pH 7.4)心内灌注固定，待固定充分后，开颅取 脑，冠状位取视交叉向尾端3-4_组织块，投入相同固定液于4°C固定1周后，常规石蜡包埋， 冠状切片，进行RAGE和NF-kB免疫组化染色;各组选取海马部位共8个不重复视野，运用BI-2000医学图像分析系统对免疫组化片子进行分析，统计平均灰度值。
[0039] 2.4统计学处理 所有实验数据用完土s表示，组间比较正态分布均匀和方差齐时采用单因素方差分析， 正态分布不均匀或方差不齐时用非参数检验，用SPSS 13.0软件统计。
[0040] 3.结果 3.1对糖尿病脑病模型大鼠水迷宫实验成绩的影响 水迷宫实验第1天各组间潜伏期、探索距离基本无显著性差异，与空白组比较，从第2天 起，模型组逃避潜伏期、探索距离显著延长(P〈〇.01或P〈〇.05)，目标象限（II象限)游泳时间 明显缩短(P〈〇.01)，站台穿越次数明显减少(P〈〇.01);与模型组相比，第3天，脑复康组潜伏 期、探索距离明显缩短(P〈〇.05)，本发明药物组探索距离明显缩短(P〈0.05)，第4天，脑复康 组、石杉碱甲组、盐酸二甲双胍组、本发明药物组潜伏期明显缩短(P〈〇.05或P〈0.01)，石杉 碱甲组、盐酸二甲双胍组、本发明药物组探索距离明显缩短(P〈〇.05)，盐酸二甲双胍组、本 发明药物组目标象限（II象限）的游泳时间明显延长(P〈〇.05)，脑复康组、石杉碱甲组、盐酸 二甲双胍组、本发明药物组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组、对比药物D组、对比 药物E组站台穿越次数增多（P〈0.05或P〈0.01)(见表1-1至表1-3) 表1-1对糖尿病脑病模型大鼠水迷宫试验潜伏期的影响(i、± s，n=10)
注:与空白组比较，Δ卩〈〇.〇5，^ P〈0.01;与模型组比较，外〈0.05，^〈0.01 表1-2对糖尿病模型大鼠水迷宫试验探索距离的影响(?土s，n=10)
注:与空白组比较，Λ卩〈〇.〇5，^ P〈0.01;与模型组比较，aP〈0.05 表1-3对糖尿病脑病大鼠水迷宫试验目标象限时间和穿越次数的影响(|±s，n=10)
注:与空白组比较，Λ ?〈〇.〇5，^ P〈0.01;与模型组比较，~〈0.05，~〈0.01 3.2对糖尿病脑病模型大鼠血糖、体重、AchE、ChAT和AGEs的影响 与空白组比较，模型组血糖、AchE、AGEs水平显著增加(P〈0.01)，体重、ChAT水平显著降 低(P〈0.01);与模型组比较，盐酸二甲双胍组、本发明药物组血糖值显著降低(P〈0.05或卩〈 0.01)，盐酸二甲双胍组、本发明药物组大鼠体重值显著性升高(P〈〇.05)，脑复康组、石杉碱 甲组、本发明药物组AchE、AGEs水平显著降低(P〈0.05或P〈0.01 )，脑复康组、石杉碱甲组、盐 酸二甲双胍组、本发明药物组ChAT水平显著增加(P〈0.05或P〈0.01 )，见表1-4和表1-5。
[0041]表1-4对糖尿病脑病模型大鼠血糖、体重指标测试结果($±2f，n=10)
注:与空白组比较，μ P〈〇. 01;与模型组比较，AP〈〇. 05，^〈0.01 表1-5对糖尿病脑病模型大鼠 AchE、ChAT和AGEs指标测试结果(，n=l0)
注:与空白组比较，μ P〈〇. 01;与模型组比较，AP〈〇. 05，^〈0.01 3.3对各组大鼠海马组织病理改变的影响 RAGE主要在细胞膜表达，免疫组化染色阳性呈棕黄色，免疫组化染色显示，与空白组比 较，模型组大鼠海马DG区RAGE免疫阳性细胞数明显增多，着色明显加深，平均灰度值明显降 低(P〈0.01);与模型组比较，脑复康组、石杉碱甲组、盐酸二甲双胍组、本发明药物组大鼠海 马DG区RAGE免疫阳性细胞数明显降低，着色较浅，平均灰度值明显升高(P〈0.01)，见表1-6。 核因子NF-kB在神经元胞浆表达，免疫组织化学染色显示，与空白组比较，模型组大鼠海马 DG区颗粒细胞层和皮质神经元NF-kB免疫反应阳性细胞多且着色深，平均灰度值明显降低 (P〈0.01);与模型组比较，脑复康组、石杉碱甲组、盐酸二甲双胍组、本发明药物组大鼠海马 DG区颗粒细胞层和皮质神经元NF-kB免疫反应阳性细胞较少，平均灰度值明显升高(P〈0.05 或Ρ〈0·01)见表 1-6。
[0042] 表1-6对糖尿病脑病模型大鼠海马组织中RAGE、NF_kB表达平均灰度值的影响（ )
注:与假手术组比较，Μ P〈〇. 01;与模型组比较，AP〈〇. 05，aaPW . 01 4.结论与讨论 4.1结论 本实验研究结果表明，本发明药物可明显改善糖尿病脑病模型大鼠的认知障碍，具有 一定脑保护作用，其作用机制是通过降血糖、改善胆碱能神经功能、改善糖尿病脑组织中 AGEs- RAGE-NF-kB通路等途径来改善糖尿病模型大鼠海马组织病变。
[0043] 本实验通过水迷宫进行大鼠神经认知模型的验证和神经认识治疗可行性的评估， 大鼠逃避时间、摸索距离越短，穿越次数越多、目标象限活动时间越长，说明大鼠学习记忆 能力越强。本研究水迷宫实验数据显示，本发明药物能减少大鼠逃避潜伏期和摸索距离，增 加穿越次数和目标象限活动时间，表明本发明药物可明显改善糖尿病脑病模型大鼠的学习 记忆能力，其效果明显优于对比药物A、对比药物B、对比药物C、对比药物D、对比药物E。
[0044] 高血糖导致脑组织中AGEs的沉积，AGEs的聚集能引起很多毒性反应，它对细胞的 毒性作用是通过与其特异性受体糖基化终末产物受体(RAGE)的结合来实现的。RAGE是细胞 表面分子免疫球蛋白超家族中的一员，最初是作为AGEs的结合受体被发现的，RAGE与糖尿 病并发